• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    hMASP2 DNA納米脂質體對BCG感染小鼠肺組織T細胞亞群和AKT/pAKT蛋白表達的影響

    2017-11-13 05:33:46張國超董信芳雒艷萍車團結馬興銘
    轉化醫(yī)學電子雜志 2017年10期
    關鍵詞:脂質體百分比復合物

    高 琪,張國超,何 琦,董信芳,雒艷萍,車團結,馬興銘

    (1蘭州大學基礎醫(yī)學院,2甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室,甘肅蘭州730000)

    hMASP2 DNA納米脂質體對BCG感染小鼠肺組織T細胞亞群和AKT/pAKT蛋白表達的影響

    高 琪1,張國超1,何 琦1,董信芳1,雒艷萍1,車團結2,馬興銘1

    (1蘭州大學基礎醫(yī)學院,2甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室,甘肅蘭州730000)

    目的:構建hMASP2 DNA納米脂質體復合物,探討hMASP2 DNA納米脂質體對BCG感染小鼠肺組織T細胞亞群和AKT/pAKT蛋白表達的影響.方法:構建pcDNA3.1?hMASP2重組表達質粒,以脂質體作為載體,制備質粒DNA納米脂質體復合物并檢測Zeta電位和粒徑;經鼻滴入1×109CFU BCG 100 μL,建立結核分枝桿菌感染小鼠模型,實驗分DNA納米脂質體組(pcDNA3.1?hMASP2組)和對照組,在感染當天小鼠尾靜脈分別注射pcDNA3.1?hMASP2 200 μL(25 μg DNA)和PBS 200 μL,每3天注射一次,連續(xù)治療三周后處死小鼠;分離肺組織淋巴細胞,流式細胞儀檢測T細胞亞群;肺組織免疫組化分析AKT、pAKT蛋白表達.結果:pcDNA3.1?hMASP2 DNA納米脂質體復合物Zeta電位52.6 mV、平均粒徑279.9 nm;與對照組相比,pcDNA3.1?hMASP2組小鼠肺組織CD4+T細胞亞群百分比明顯升高(P<0.05)、CD4+PD?1+T細胞亞群百分比降低(P<0.05);pcDNA3.1?hMASP2組小鼠肺組織AKT和pAKT的陽性細胞百分比明顯增高(P<0.05).結論:構建穩(wěn)定的pcDNA3.1?hMASP2 DNA納米脂質體復合物,pcDNA3.1?hMASP2納米脂質體增加BCG感染小鼠的肺組織的CD4+T細胞、促進肺組織pAKT蛋白的表達,降低肺組織的PD?1+T細胞亞群,從而上調小鼠T細胞功能.

    納米脂質體;MASP2;結核病;PD?1;AKT

    0 引言

    結核?。╰uberculosis,TB)現已成為備受大家關注的全球性健康問題.2015年,世界各地估計有1040萬例新發(fā)活動性結核病,同年全球造成約140萬人死亡[1].結核病是嚴重危害人類健康的經呼吸道傳播的慢性傳染病,近年來,我國每年報告肺結核發(fā)病人數約100萬,始終位居全國甲乙類傳染病的前列;耐多藥肺結核危害日益凸顯,每年新發(fā)患者人數約12萬,未來數年內可能出現以耐藥菌為主的結核病流行態(tài)勢[2].現如今,在藥物治療的基礎上,免疫學療法為結核病的治療提供了新方法和新思路,其中結核分枝桿菌疫苗和IL?12使用最多,DNA疫苗以Ag85B效果最好,它能夠刺激肉芽腫組織淋巴細胞的應答,達到延長動物壽命的目的[3].IL?12能夠推進CTL細胞成熟、引誘Th1分化、刺激T細胞、釋放IFN?γ,免疫治療具有較大應用潛力.

    補體系統被認為是在炎癥過程中具有重要作用的先天免疫系統的重要組成部分.可以通過經典途徑、替代途徑或凝集素途徑激活,產生具有廣泛免疫功能的C3a和C5a,以及能夠直接裂解靶細胞的末端補體裝置膜攻擊復合物[4].甘露糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶2(mannan?binding lectin associated ser?ine proteases,MASP2)是啟動補體凝集素途徑的關鍵效應酶,其基因位于染色體1p36上,由12個外顯子組成,長約20 kb[5-6].甘露糖結合凝集素(mannan?binding lectin,MBL)識別結合病原體后,與之結合的MASP2被激活,引發(fā)補體系統的抗體非依賴性活化途徑,裂解C4和C2并激活后續(xù)補體級聯反應,從而誘導炎癥反應,并破壞并清除病原體[5],因此,凝集素途徑效應酶MASP2在發(fā)揮抗細菌感染方面具有重要的作用.

    本實驗室曾對MASP2蛋白進行表達和純化,但其性質不穩(wěn)定,在30 min即可降解,當MASP2蛋白濃度>3 μg/L時,在無MBL參與的情況下可發(fā)生自行激活,使得MASP2蛋白難以大量純化[7].在前期的研究中,以腺病毒為載體構建的rAd?hMASP2對小鼠結核性肉芽腫的治療具有明顯治療效果[8-11],但腺病毒載體存在靶向性差、免疫原性強、半衰期短等缺點,限制了其在治療中的應用[12].為此,我們構建MASP2 DNA納米脂質體復合物,由磷脂、膽固醇等為膜材包合而成的脂質體進入人體內,被網狀內皮系統吞噬而激活機體自身免疫功能,脂質體容易浸染細胞,并能夠改變藥物的體內分布,使藥物主要在肝、肺等組織器官中積蓄,提高藥物治療效率.因此,在本實驗構建hMASP2重組質粒,以脂質體為載體,制備DNA納米脂質體復合物,評價其對BCG感染小鼠肺組織T細胞亞群和AKT/pAKT蛋白表達的影響.

    1 材料和方法

    1.1 hMASP2DNA納米脂質體制備hMASP2全基因質粒pYr?ads?1?hMASP2由本實驗室構建,E.coli DH5α和E.coli BL?21為本實驗室保存;真核表達載體pcDNA3.1購自蘇州金唯智有限公司;hMASP2的上下游引物由華大基因科技有限公司合成.以本實驗室pYr?ads?1?hMASP2為模板進行PCR擴增,獲取hMASP2全基因,上游引物序列GGGGTACCGCCAC?CATGAGGCTGCTGACCCTCCT,下游引物序列GGAATTCTTAAAAATCACTAATTATGTTCTC,酶切位點EcoRⅠ和KpnⅠ,將構建好的重組質粒交由華大基因科技有限公司測序,結果顯示序列匹配,表明重組質粒構建成功.參考文獻方法[13]構建hMASP2 DNA納米脂質體復合物:用實驗室已經制備的脂質體,調整其及質粒DNA的濃度,將脂質體與DNA 3∶1混合,剩余量用5%葡萄糖補足,用加樣槍反復吹打混勻,置于4℃冰箱中過夜,次日用于小鼠尾靜脈注射.

    1.2 hMASP2 DNA納米脂質體表征hMASP2 DNA納米脂質體用Malvern Zetasizer Nano?ZS(Malv?ern Instruments,Worcestershire,UK)儀器檢測MASP2其Zeta電位和粒徑大小,判斷其穩(wěn)定性和納米脂質體大小.

    1.3 小鼠BCG感染模型建立與干預SPF級6~8周齡雌性昆明種小鼠(蘭州大學實驗動物中心),溫濕度適宜、干凈清潔的條件下飼養(yǎng).擴增培養(yǎng)牛型結核分枝桿菌減毒株BCG D1331菌株(蘭州大學結核病研究中心惠贈),第0天小鼠經鼻滴入1×109CFU 100 μL,建立小鼠結核病模型并隨機將小鼠分為hMASP2脂質體復合物組(pcDNA3.1?hMASP2組)和PBS對照組,每組四只.BCG感染當天分別給予尾靜脈注射pcDNA3.1?hMASP2脂質體復合物和等體積PBS,注射體積為200 μL(25 μg DNA),每隔三天注射一次.在第21天處死小鼠,取左肺組織分離淋巴細胞,流式細胞儀分析CD4、CD8、PD?1淋巴細胞亞群,右肺組織免疫組化染色檢測AKT和pAKT的表達情況,并計算其陽性細胞百分比.

    1.4 肺淋巴細胞分離與流式細胞術參考文獻方法[14]分離肺組織淋巴細胞,即用40%的Percoll(Pharmacia,America)分離小鼠肺組織的淋巴細胞,用D?Hanks液洗滌兩次,棄去上清后用PBS洗滌,100 μLPBS重懸后細胞計數.調整細胞濃度,取2×106個淋巴細胞進行染色,其中PE?抗CD4單克隆抗體(0.625 μL),APC?抗CD8單克隆抗體(0.625 μL),FITC?抗PD?1單克隆抗體(0.8 μL)加入后(三株熒光抗體購自eBioscience公司),輕輕渦旋混勻,4℃避光孵育30 min,然后加入預冷的PBS 1 mL進行重懸洗滌,上機檢測(BD FACSCalibur),結果由FlowJo 7.6.1統計分析.

    1.5 肺組織免疫組織化學染色用常規(guī)SABC免疫組化法檢測小鼠右肺組織中AKT、pAKT的表達水平,常規(guī)石蠟切片脫蠟,乙醇水化,檸檬酸鈉修復,3%H2O2孵育10 min,加兔抗鼠一抗(1∶100)(抗AKT抗體購自Bioss公司,抗pAKT抗體購自bioswamp公司),4℃過夜孵育,加Maxvision二抗(1∶100)37℃孵育20 min,PBS沖洗2 min×3次,DAB顯色,蘇木素復染,脫水,封片,顯微鏡下觀察,自上向下隨機取10個高倍視野(×400),用Image?Pro plus 6.0軟件進行分析,以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性信號,計算陽性細胞百分比.

    1.6 統計學處理采用SPSS18.0軟件學進行數據分析,計算出各組的M±SD,同時采用單因素方差分析計算P值,組間分析采用t檢驗,當P<0.05時認為差異有統計學意義.實驗數據制圖使用Graph Pad Prism軟件.

    2 結果

    2.1 hMASP2 DNA納米脂質體表征hMASP2 DNA納米脂質體經Malvern Zetasizer Nano?ZS(Malv?ern Instruments,Worcestershire,UK)儀器檢測,測得其平均Zeta電位為52.6 mV,平均粒徑大小為279.9 nm(圖1).制備的hMASP2 DNA納米脂質體復合物性質穩(wěn)定(Zeta>40 mV,粒徑100~300 nm)[9],可用于小鼠尾靜脈注射.

    圖1 MASP2 DNA納米脂質體Zeta電位和粒徑峰值

    2.2 肺組織T細胞亞群流式細胞儀檢測小鼠肺組織T細胞數量、亞群及百分比結果見圖2~4.兩組小鼠肺組織T細胞數、CD8+T細胞亞群和CD8+PD?1+T細胞亞群百分比無統計學差異(P>0.05)(圖2、3).與對照組相比,pcDNA3.1?hMASP2組小鼠肺組織CD4+T細胞百分比明顯增多,差異具有統計學意義(P=0.028);pcDNA3.1?hMASP2組小鼠肺組織CD4+PD?1+T細胞百分比明顯降低,差異具有統計學意義(P=0.023).表明hMASP2 DNA納米脂質體能夠促進小鼠肺組織淋巴細胞的浸潤和募集,并抑制CD4+T淋巴細胞膜表面抑制性分子PD?1的表達.

    圖2 兩組小鼠肺組織淋巴細胞總數

    圖3 兩組小鼠肺組織CD4+、CD8+、CD4+PD?1+、CD8+PD?1+T細胞亞群百分比

    圖4 兩組小鼠肺組織淋巴細胞亞群流式細胞術檢測代表圖

    2.3 肺組織免疫組化檢測每個切片觀察4個高倍鏡視野,每高倍鏡視野計數100個細胞,綜合判斷陽性細胞染比例和染色強度.小鼠肺組織免疫組化檢測結果見圖5、6.與對照組相比,pcDNA3.1?hMASP2組AKT和pAKT陽性細胞百分比明顯增高,差異具有統計學意義(P<0.05).對照組小鼠肺組織中有較少的棕黃色陽性細胞分布,而hMASP2 DNA納米脂質體組小鼠肺組織中有較多、集中分布的棕黃色陽性細胞.hMASP2DNA納米脂質體組小鼠肺組織AKT、pAKT的表達水平均顯著增加,表明hMASP2 DNA納米脂質體能夠促進小鼠肺組織細胞AKT表達,并增加磷酸化的pAKT水平.

    圖5 小鼠肺組織中AKT和pAKT免疫組化結果(IHC×100)

    圖6 小鼠肺組織中AKT和pAKT陽性細胞百分比

    3 討論

    程序性死亡因子(PD?1/CD279)是共刺激分子CD28家族中的受體,主要表達于T細胞表面,通過與其配體PDL?1/2結合,抑制淋巴細胞增殖和細胞因子產生[15].PD?1/PD?L1對調節(jié)T細胞功能起著至關重要的作用.在慢性感染、腫瘤患者體內,T細胞高表達PD?1分子,被認為是T細胞耗竭的標志[16-17].結核患者的免疫力受損與巨噬細胞和T細胞活化受損、IFN?γ的產生減少密切相關[18],結核分枝桿菌特異性CD4+T細胞在活動性肺結核中的作用比CD8+T細胞更重要[19],并且活動性肺結核CD4+T細胞高表達PD?1分子[20].故通過下調T細胞PD?1分子的表達,改善患者的T細胞功能,是治療慢性感染的策略之一.在本實驗中,pcDNA3.1?hMASP2治療組CD4+T細胞比例明顯升高、CD4+PD?1+T細胞比例降低,表明hMASP2 DNA納米脂質體能夠促進小鼠肺組織CD4+T細胞的浸潤和募集,并抑制PD?1分子的表達,從而上調CD4+T細胞功能.磷酸肌醇三磷酸激酶?絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinsitol 3?OH kinase?RAC?alphaserine/threonine?protein kinase,PI3K?AKT)信號通路廣泛存在于細胞中,是細胞內重要信號通路之一,通過影響下游多種效應分子的活化狀態(tài)發(fā)揮其作用[21].AKT也稱為蛋白激酶B,一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要通過絲氨酸473和蘇氨酸308的磷酸化激活,在多種細胞過程中起重要作用[22].AKT是PI3K/AKT通路的中心環(huán)節(jié),可被PI3K激活成為具有磷酸激酶活性的pAKT(磷酸化AKT),pAKT可誘導干擾細胞凋亡功能的信號,并且可能通過激活哺乳動物的雷帕霉素靶標和阻滯靶細胞通過正常的細胞周期等來促進細胞存活,增殖和運動[23-24].在本實驗中,pcDNA3.1?hMASP2組棕黃色的陽性細胞分布更廣泛,并且AKT和pAKT陽性細胞百分比明顯增高,其在小鼠肺組織中顯著表達.一方面hMASP2 DNA納米脂質體抑制BCG感染誘導的肺組織細胞凋亡,有利于肺組織修復.另一方面,肺肉芽組組織中有大量浸潤T細胞,hMASP2 DNA納米脂質體通過影響AKT和pAKT表達,促進浸潤T細胞增殖、活化,拮抗PD?1對T細胞的下調作用,可能是其下調PD?1分子的表達機制之一,繼而增強T細胞抗感染的效應功能.總之,結核病的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后是一個復雜的多因素參與的過程,本實驗主要通過檢測PD?1和AKT水平來初步評價hMASP2 DNA納米脂質體對小鼠結核性肉芽腫的影響.hMASP2 DNA納米脂質體作用于小鼠后,T細胞PD?1表達水平降低,AKT和pAKT表達均增加,表明hMASP2 DNA納米脂質體對BCG感染小鼠肺組織局部免疫具有上調作用.但hMASP在小鼠體內的表達、hMASP2 DNA納米脂質體對PD?1和AKT水平的調控機制需要進一步研究.

    [1] Yates TA,Khan PY,Knight GM,et al.The transmission of Myco?bacterium tuberculosis in high burden settings[J].Lancet Infect Dis,2016,16(2):227-238.

    [2] 劉英姿.艾滋病患者中結核病的患病情況及發(fā)病趨勢分析[J].中國醫(yī)藥指南,2013,11(24):261-262.

    [3]黃委剛.腫瘤壞死因子?α在結核病免疫中的研究進展[J].醫(yī)藥前沿,2013(9):58-59.

    [4] Cernoch M,Viklicky O.Complement in kidney transplantation[J].Front Med(Lausanne),2017,4:66.

    [5] Wang Y,Yan J,Shi Y,et al.Lack of association between polymor?phisms of MASP2 and susceptibility to SARS coronavirus infection[J].BMC Infect Dis,2009,9:51.

    [6] 王 倩,陳慧昱,陸小鈴,等.甘露糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶2的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志,2015,31(1):129-133.

    [7] 張國超,雒艷萍,陸小鈴,等.重組腺病毒載體pAd?4?hMASP?2的構建[J].中國生物制品學雜志,2016,29(11):1141-1145.

    [8] Dong X,Luo Y,Gao Q,et al.Effects of MBL?associated serine pro?tease?2(MASP?2)on liquefaction and ulceration in rabbit skin mod?el of tuberculosis[J].Microb Pathog,2016,99:282-286.

    [9] Gao Q,Dong X,Luo Y,et al.Construction of human MASP?2?CCP1/2SP,CCP2SP,SP plasmid DNA nanolipoplexes and the effects on tuberculosis in BCG?infected mice[J].Microb Pathog,2017,109:200-208.

    [10] Xu X,Lu X,Dong X,et al.Effects of hMASP?2 on the formation of BCG infection?induced granuloma in the lungs of BALB/c mice[J].Sci Rep,2017,7(1):2300.

    [11] Fu J,Wang J,Luo Y,et al.Association between MASP?2 gene pol?ymorphism and risk of infection diseases:A meta?analysis[J].Mi?crob Pathog,2016,100:221-228.

    [12] 胡奇嬋,陳 玥,王 麗,等.腺病毒載體用于基因治療的研究進展[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2011,23(5):76-80.

    [13] Templeton NS,Lasic DD,Frederik PM,et al.Improved DNA:lipo?some complexes for increased systemic delivery and gene expression[J].Nat Biotechnol,1997,15(7):647-652.

    [14] Umemura M,Yahagi A,Hamada S,et al.IL?17?mediated regulation of innateand acquired immune responseag ainstpulmonary Mycobacte?rium bovis bacille Calmette?Guerin infection[J].J Immunol,2007,178(6):3786-3796.

    [15] Freeman GJ,Wherry EJ,Ahmed R,et al.Reinvigorating exhausted HIV?specific T cells via PD?1?PD?1 ligand blockade[J].J Exp Med,2006,203(10):2223-2227.

    [16] Pauken KE,Wherry EJ.Overcoming T cell exhaustion in infection and cancer[J].Trends Immunol,2015,36(4):265-276.

    [17] Patel SP,Kurzrock R.PD?L1 expression as a predictive biomarker in cancer immunotherapy[J].Mol Cancer Ther,2015,14(4):847-856.

    [18] Asante?Poku A,Yeboah?Manu D,Otchere ID,et al.Mycobacterium africanumis associated with patient ethnicity in Ghana[J].PLoS Negl Trop Dis,2015,9(1):e3370.

    [19] Gao Y,Zhang S,Ou Q,et al.Characterization of CD4/CD8+αβ and VY2Vδ2+T cells in HIV?negative individuals with different My?cobacterium tuberculosis infection statuses[J].Hum Immunol,2015,76(11):801-807.

    [20] Barber DL,Wherry EJ,Masopust D,et al.Restoring function in ex?hausted CD8 T cells during chronic viral infection[J].Nature,2006,439(7077):682-687.

    [21] Landgren H,Curtis MA.Locating and labeling neural stemcells in the brain[J].J Cell Physiol,2011,226(1):1-7.

    [22] Nicholson KM,Anderson NG.The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy[J].Cell Signal,2002,14(5):381-395.

    [23] Xue G,Hemmings BA.PKB/Akt?dependent regulation of cell motil?ity[J].J Natl Cancer Inst,2013,105(6):393-404.

    [24] Al?Bazz YO,Underwood JC,Brown BL,et al.Prognostic significance of Akt,phospho?Akt and BAD expression in primary breast cancer[J].Eur J Cancer,2009,45(4):694-704.

    Effects of hMASP2 DNA nano-liposomes on T-lymphocytesubsetsandexpressionof AKT/pAKT protein in lung tissue of BCG-infected mice

    GAO Qi1,ZHANG Guo-Chao1,HE Qi1,DONG Xin-Fang1,LUO Yan-Ping1,CHE Tuan-Jie2,MA Xing-Ming11Department of Immunology,School of Basic Medical Science,Lanzhou University,2Gansu Key Laboratory of Functional Genom?ics and Molecular Diagnosis,Lanzhou 730000,China

    AIM:To evaluate the potential impacts of human MASP2(hMASP2)DNA nano liposomes on T?lymphocyte sub?sets and AKT/pAKT protein expression in lung tissue of BCG?in?fected mice through constructing the hMASP2 DNA nano?lipo?somes complex.METHODS:The pcDNA3.1?hMASP2 recombi?nant plasmids were constructed and then the hMASP2 DNA nano?liposomes complex were prepared with a carrier of liposome.The zeta potential and particle size of hMASP2 DNA nano?liposomes were detected.After infection with 100 μL of 1×109CFU BCG,mice were randomly divided into two groups and

    the fol?lowing treatments:the mice of hMASP2 DNA nano?liposomes group were injected by tail vein with 200 μL(25 μg DNA)of DNA nano?liposomes and the mice of control group were received PBS(200 μL)by tail vein.All mice were injected every three days and treated for 3 weeks,then were killed.Lymphocytes were isolated from lung tissue and PD?1+T cell subsets were detected by flow cytometry.The expression of AKT/pAKT protein was detected with immunohistochemical staining.RESULTS:The zeta potential of pcDNA3.1?hMASP2 DNA nano?liposome complex was 52.6 mV and the average particle size was 279.9 nm.Com?pared with the control group,the percentage of CD4+T?lympho?cyte subsets in the lung tissue of mice treated with hMASP2 DNA nano?liposomes were significantly increased(P<0.05)and the percentage of CD4+PD?1+T?lymphocyte subsets were significantly decreased(P<0.05).The percentage of AKT and pAKT positive cells in hMASP2 DNA nano?liposomes group were significantly increased(P<0.05).CONCLUSION:A stable pcDNA3.1?hMASP2 DNA nano?liposome complex is firstly constructed,which shows the positive efficacy in increasing the number of CD4+T cells,reducing the number of PD?1+T?lymphocyte sub?sets,and promoting the expression of pAKT of BCG?infected mice.These findings provide experimental evidence that hMASP2 DNA nano?liposomes display a potential role of up?regulating T?cell?mediated immunity in tuberculosis.

    nano?liposomes;MASP2;tuberculosis;PD?1;AKT

    R730.45

    A

    2017-07-21;接受日期:2017-08-03

    蘭州大學中央高校基本科研業(yè)務費專項資金(lzujbky-2017-117);蘭州市科技計劃項目(2016-3-107)

    高 琪.碩士.E?mail:gaoqijy@163.com

    雒艷萍.副教授.馬興銘(共同通訊作者).教授.E?mail:maxm@lzu.edu.cn

    2095?6894(2017)10?35?04

    猜你喜歡
    脂質體百分比復合物
    PEG6000修飾的流感疫苗脂質體的制備和穩(wěn)定性
    BeXY、MgXY(X、Y=F、Cl、Br)與ClF3和ClOF3形成復合物的理論研究
    柚皮素磷脂復合物的制備和表征
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:18
    超濾法測定甘草次酸脂質體包封率
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:20:08
    黃芩苷-小檗堿復合物的形成規(guī)律
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:18
    TPGS修飾青蒿琥酯脂質體的制備及其體外抗腫瘤活性
    中成藥(2017年3期)2017-05-17 06:08:52
    普通照明用自鎮(zhèn)流LED燈閃爍百分比測量不確定度分析
    電子制作(2017年20期)2017-04-26 06:57:46
    肝癌患者外周血Treg、Th17百分比及IL-17水平觀察
    離子對脂質體囊泡的影響
    鐵氧化物-胡敏酸復合物對磷的吸附
    国产精品久久久人人做人人爽| 国产黄色小视频在线观看| 热99在线观看视频| 国产成人aa在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日本黄色片子视频| 午夜激情福利司机影院| 国产亚洲精品久久久com| 熟女人妻精品中文字幕| 精品无人区乱码1区二区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲成a人片在线一区二区| x7x7x7水蜜桃| 亚洲一区高清亚洲精品| 熟女人妻精品中文字幕| 久久草成人影院| 国内精品久久久久久久电影| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 精品人妻1区二区| 成人特级av手机在线观看| tocl精华| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 1000部很黄的大片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲成a人片在线一区二区| 18+在线观看网站| ponron亚洲| 一二三四社区在线视频社区8| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产久久久一区二区三区| 国内精品一区二区在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久亚洲真实| 日本一本二区三区精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 免费av毛片视频| 最近最新免费中文字幕在线| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产亚洲精品综合一区在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| av视频在线观看入口| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲国产欧美人成| 日本黄色片子视频| 国产免费男女视频| 精品国产三级普通话版| 色播亚洲综合网| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 99久久九九国产精品国产免费| avwww免费| 久久久久久久精品吃奶| 国产久久久一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美bdsm另类| 俺也久久电影网| 国产高清三级在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 搡老岳熟女国产| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 看片在线看免费视频| 成人国产综合亚洲| 亚洲美女黄片视频| 亚洲av成人av| 日韩欧美精品免费久久 | 欧美激情在线99| 一边摸一边抽搐一进一小说| 性欧美人与动物交配| 国产综合懂色| 国产精品国产高清国产av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 青草久久国产| 欧美成人性av电影在线观看| 久久久久九九精品影院| 变态另类丝袜制服| 美女黄网站色视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产精品久久视频播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 三级毛片av免费| 中出人妻视频一区二区| 男女那种视频在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩精品中文字幕看吧| 国产99白浆流出| 99国产极品粉嫩在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美日韩黄片免| АⅤ资源中文在线天堂| 女人被狂操c到高潮| 天天一区二区日本电影三级| 久久亚洲精品不卡| 精品一区二区三区视频在线 | 亚洲七黄色美女视频| 色av中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看| 综合色av麻豆| 精品久久久久久成人av| 不卡一级毛片| 超碰av人人做人人爽久久 | 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 最近视频中文字幕2019在线8| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲,欧美精品.| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲精品在线观看二区| 性色av乱码一区二区三区2| 人妻久久中文字幕网| 一个人看视频在线观看www免费 | 色综合站精品国产| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品99久久99久久久不卡| 女同久久另类99精品国产91| 91麻豆av在线| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 内地一区二区视频在线| 亚洲在线自拍视频| 日韩国内少妇激情av| 国产视频一区二区在线看| 国产免费一级a男人的天堂| 我的老师免费观看完整版| 精华霜和精华液先用哪个| www.999成人在线观看| 超碰av人人做人人爽久久 | av片东京热男人的天堂| 怎么达到女性高潮| 亚洲专区国产一区二区| 久久精品国产清高在天天线| 天天躁日日操中文字幕| e午夜精品久久久久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲精品色激情综合| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲无线观看免费| 一进一出好大好爽视频| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一进一出好大好爽视频| 国产69精品久久久久777片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| e午夜精品久久久久久久| 国产黄片美女视频| 成人特级av手机在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产精品98久久久久久宅男小说| 露出奶头的视频| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 国产欧美日韩精品亚洲av| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费无遮挡裸体视频| 99热只有精品国产| 老司机午夜福利在线观看视频| 日本成人三级电影网站| 99国产综合亚洲精品| 国产久久久一区二区三区| 亚洲成人久久性| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美bdsm另类| 99热6这里只有精品| 亚洲国产精品合色在线| 久久精品影院6| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲成人久久性| 国产黄色小视频在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 在线观看av片永久免费下载| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久成人免费电影| 亚洲人成电影免费在线| 欧美最新免费一区二区三区 | 日本免费a在线| 精品久久久久久久久久久久久| 91久久精品电影网| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品一区二区免费欧美| 91av网一区二区| 禁无遮挡网站| 99久久九九国产精品国产免费| 久久精品影院6| 欧美一级毛片孕妇| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精华国产精华精| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美午夜高清在线| www国产在线视频色| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲av一区综合| 男女那种视频在线观看| 午夜福利欧美成人| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产精品一及| 欧美乱妇无乱码| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 中出人妻视频一区二区| 久久久久久人人人人人| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费高清视频大片| 色尼玛亚洲综合影院| 在线观看av片永久免费下载| 禁无遮挡网站| 天天一区二区日本电影三级| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲不卡免费看| 亚洲 国产 在线| 中亚洲国语对白在线视频| 午夜日韩欧美国产| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品久久久久久久久免 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲18禁久久av| 亚洲av不卡在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 母亲3免费完整高清在线观看| 99久久精品一区二区三区| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲国产色片| 九九在线视频观看精品| 最近最新中文字幕大全免费视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久这里只有精品中国| 性欧美人与动物交配| 国产免费一级a男人的天堂| 91久久精品国产一区二区成人 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 美女免费视频网站| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 久99久视频精品免费| 精品福利观看| 性色av乱码一区二区三区2| 成人一区二区视频在线观看| 宅男免费午夜| svipshipincom国产片| 神马国产精品三级电影在线观看| 在线观看日韩欧美| 黄色日韩在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲av免费在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 成人三级黄色视频| xxxwww97欧美| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 熟女人妻精品中文字幕| 人妻夜夜爽99麻豆av| 母亲3免费完整高清在线观看| 在线观看舔阴道视频| 深夜精品福利| 精品久久久久久久久久久久久| 无遮挡黄片免费观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 婷婷精品国产亚洲av| 嫩草影院精品99| 国产成人av激情在线播放| 久久亚洲精品不卡| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日韩精品青青久久久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 免费无遮挡裸体视频| 欧美性感艳星| 免费av观看视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产av一区在线观看免费| 亚洲乱码一区二区免费版| 久99久视频精品免费| 成人特级黄色片久久久久久久| 岛国在线免费视频观看| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲国产欧美人成| 国产av麻豆久久久久久久| 色吧在线观看| 午夜久久久久精精品| 搡老岳熟女国产| 很黄的视频免费| 我的老师免费观看完整版| 日韩欧美精品免费久久 | 久久这里只有精品中国| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩精品青青久久久久久| 精品欧美国产一区二区三| 在线a可以看的网站| 久久6这里有精品| 国产亚洲精品av在线| 九色成人免费人妻av| 中文在线观看免费www的网站| www日本黄色视频网| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产高清视频在线播放一区| 一级作爱视频免费观看| 91久久精品电影网| 99精品久久久久人妻精品| 成年女人看的毛片在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美日韩精品网址| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精品亚洲美女久久久| 淫秽高清视频在线观看| 成人欧美大片| 床上黄色一级片| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 99久久成人亚洲精品观看| 最新中文字幕久久久久| 国产成人啪精品午夜网站| 搡老岳熟女国产| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲精品在线观看二区| 国产视频内射| 午夜福利18| 国产视频内射| 精品久久久久久,| x7x7x7水蜜桃| 日本与韩国留学比较| 一级黄片播放器| ponron亚洲| 麻豆成人午夜福利视频| 久久久久久人人人人人| 国产麻豆成人av免费视频| 成人av一区二区三区在线看| 国产成人aa在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 99精品久久久久人妻精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 黄片大片在线免费观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 一本久久中文字幕| 亚洲电影在线观看av| 午夜免费激情av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲国产精品成人综合色| 国内精品一区二区在线观看| 夜夜爽天天搞| 欧美最新免费一区二区三区 | 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产日本99.免费观看| 嫩草影视91久久| 国产成人av教育| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 男女午夜视频在线观看| 欧美3d第一页| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产单亲对白刺激| 啦啦啦免费观看视频1| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产真人三级小视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| av国产免费在线观看| 老司机福利观看| 少妇丰满av| 他把我摸到了高潮在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美一级毛片孕妇| 黄色女人牲交| 亚洲人成网站高清观看| 国产三级黄色录像| 国产亚洲精品一区二区www| 免费大片18禁| 激情在线观看视频在线高清| 最后的刺客免费高清国语| 欧美日韩综合久久久久久 | 精品乱码久久久久久99久播| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产亚洲精品一区二区www| 制服丝袜大香蕉在线| 日韩国内少妇激情av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国内精品一区二区在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 国产午夜福利久久久久久| 欧美色视频一区免费| 久久久久久人人人人人| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人系列免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 天堂动漫精品| 可以在线观看毛片的网站| АⅤ资源中文在线天堂| 国产亚洲精品综合一区在线观看| а√天堂www在线а√下载| 白带黄色成豆腐渣| www.www免费av| 一区二区三区激情视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 午夜福利欧美成人| 观看免费一级毛片| 国产一区二区激情短视频| netflix在线观看网站| 我要搜黄色片| 亚洲专区国产一区二区| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品人妻1区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 欧美大码av| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜视频国产福利| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产视频一区二区在线看| 精品欧美国产一区二区三| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 国产成人a区在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 熟女人妻精品中文字幕| 91av网一区二区| 国产精品永久免费网站| 亚洲熟妇熟女久久| 国产熟女xx| 免费搜索国产男女视频| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜a级毛片| 中文在线观看免费www的网站| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 国产精品野战在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 18美女黄网站色大片免费观看| av在线蜜桃| 99久久精品国产亚洲精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产成人a区在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 色综合欧美亚洲国产小说| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日日夜夜操网爽| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 欧美一区二区精品小视频在线| 最新在线观看一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产男靠女视频免费网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲国产欧美网| 91久久精品国产一区二区成人 | 国产精品久久视频播放| 一进一出抽搐gif免费好疼| 女人被狂操c到高潮| 精品国产美女av久久久久小说| 成人一区二区视频在线观看| 69人妻影院| 久久精品91蜜桃| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 精品国内亚洲2022精品成人| 观看美女的网站| 欧美区成人在线视频| 亚洲人与动物交配视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产激情欧美一区二区| 成人午夜高清在线视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品免费一区二区三区在线| 免费av观看视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 一区二区三区高清视频在线| 久久久久性生活片| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜视频国产福利| 久久亚洲真实| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲av成人av| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 日本 av在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费观看人在逋| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美3d第一页| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产午夜精品论理片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久精品人妻少妇| 亚洲不卡免费看| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲av五月六月丁香网| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国内精品美女久久久久久| 亚洲国产色片| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国内精品久久久久久久电影| 嫩草影视91久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 此物有八面人人有两片| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲精品亚洲一区二区| www.熟女人妻精品国产| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 网址你懂的国产日韩在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久久久久中文| 免费看十八禁软件| 国产三级在线视频| 亚洲在线自拍视频| 岛国在线免费视频观看| 久久久久久九九精品二区国产| 精品久久久久久成人av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 黄色成人免费大全| xxxwww97欧美| 欧美黑人欧美精品刺激| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 看片在线看免费视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 免费看a级黄色片| 99热这里只有是精品50| 欧美成人性av电影在线观看| 午夜福利高清视频| 亚洲不卡免费看| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产v大片淫在线免费观看| 国产黄a三级三级三级人| 精品福利观看| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲av美国av| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产美女午夜福利| 高清日韩中文字幕在线| 日韩国内少妇激情av| 成人av在线播放网站| 99久久精品热视频| 国产精品亚洲美女久久久| 1024手机看黄色片| 国产精品av视频在线免费观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 美女cb高潮喷水在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 窝窝影院91人妻| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产野战对白在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 老鸭窝网址在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩人妻高清精品专区| 午夜久久久久精精品| 成年人黄色毛片网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 丁香六月欧美| a在线观看视频网站| 五月伊人婷婷丁香| 真人做人爱边吃奶动态| 高清毛片免费观看视频网站| 色在线成人网| av专区在线播放| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一级a爱片免费观看的视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜老司机福利剧场| 亚洲成人中文字幕在线播放| 中文字幕高清在线视频| 青草久久国产| 热99在线观看视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产91精品成人一区二区三区| 日本熟妇午夜| 一级黄片播放器| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲专区国产一区二区| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美性猛交黑人性爽|