可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移沉淀聚合法制備木犀草素分子印跡聚合物及其表征

蘇立強(qiáng)， 楚善明， 謝 鵬， 王媛媛

(齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

木犀草素(Luteolin，LTL)為一種典型的黃酮類化合物，是多種常見中草藥和天然產(chǎn)物中的有效成分之一，因其可調(diào)節(jié)人體免疫功能以及良好的抗病毒性能，在醫(yī)藥方面有重要的應(yīng)用價值。因合成藥物產(chǎn)率低，且具有一定毒副作用，近年來人們更傾向于從植物中提取具有藥用價值的化學(xué)成分[1 - 3]。目前，木犀草素提取的方法主要有:乙醇-水溶劑提取法、堿性稀醇提取法、超聲波法、超臨界流體萃取法、酶提取法和大孔樹脂吸附法。但這些方法都不同程度存在有機(jī)溶劑消耗大，純度低等問題。因此，針對合成以及提取的諸多弊端，建立高選擇性的提取木犀草素的方法具有重要意義。

分子印跡技術(shù)(MIT)是指制備對某一特定目標(biāo)分子具有特異選擇性聚合物的過程。在分子識別、固相萃取、色譜分離等方面得到廣泛應(yīng)用。分子印跡聚合物(MIPs)的制備方法主要有本體聚合、懸浮聚合、沉淀聚合、表面聚合、原位聚合等?？赡婕映?斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)-沉淀聚合法具有單體適用范圍廣、聚合過程簡單、特異性吸附量大等優(yōu)點(diǎn)[4 - 6]，同時又避免了傳統(tǒng)沉淀聚合因自由基反應(yīng)過程不受控制，使得所制備的MIPs粒徑范圍較寬，內(nèi)部孔穴差異較大的缺點(diǎn)[7 - 9]。目前對木犀草素MIPs的制備大都采用傳統(tǒng)聚合方法[16 - 20]。祁楚楚等[19]以木犀草素為模板分子，利用本體聚合法制備MIPs；曹紅梅[20]以懸浮聚合法制備了木犀草素MIPs。本文采用RAFT-沉淀聚合法制備木犀草素MIPs，其吸附性能優(yōu)于傳統(tǒng)方法制備的聚合物，將其作為固相萃取材料，用于花生殼中木犀草素的分離富集，效果良好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

P230型高效液相色譜儀(大連依利特公司)。

木犀草素(LTL)、香葉木素、芹菜素、丙烯酰胺(AM)(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(分析純，東京化成工業(yè)株式會社)，偶氮二異丁腈(AIBN)(分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)，二硫化碳、無水NaSO4、四正丁基溴化銨、石油醚、甲醇、氯化芐均為分析純(Sigma試劑有限公司)，甲酸為優(yōu)級純(天津市科密歐化學(xué)試劑中心)。

1.2 鏈轉(zhuǎn)移試劑二芐基三硫代碳酸酯的制備

參照文獻(xiàn)方法[10]制備鏈轉(zhuǎn)移試劑二芐基三硫代碳酸酯(DBTTC)，并用紅外光譜法進(jìn)行表征。

1.3 分子印跡聚合物的制備

在100 mL圓底燒瓶中加入0.0715 g (0.25 mmol)模板分子LTL，0.0718 g (1 mmol)功能單體AM，超聲溶解于40 mL甲醇中，預(yù)聚合8 h。再加入2.765 g (14 mmol)交聯(lián)劑EGDMA，0.01 g 引發(fā)劑AIBN和0.05 g DBTTC，超聲15 min，緩慢通入N2脫氧15 min，將圓底燒瓶密封后，置于60 ℃恒溫水浴中熱聚合24 h。用10%乙酸-甲醇溶液(V/V)對聚合物進(jìn)行索氏提取24 h，以去除模板分子和未參加反應(yīng)的功能單體及交聯(lián)劑。再除去殘留的乙酸，45 ℃真空干燥48 h，即得R-MIPs。除不加模板分子外，其他操作步驟同上，制備非印跡聚合物R-NIPs。不加入DBTTC，其他同上，制備傳統(tǒng)印跡聚合物T-MIPs和非印跡聚合物T-NIPs。

1.4 MIPs吸附性能研究

1.4.1靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)配制濃度(c0)范圍在0.00～100.00 μg/mL的木犀草素溶液，再分別向各溶液中加入10 mg的MIPs，靜止12 h。然后取上層清液1 mL，用0.45 μm膜過濾后，加無水甲醇稀釋至3 mL，利用紫外分光光度計測得各溶液的濃度ce，根據(jù)吸附前后木犀草素的濃度變化，計算洗脫后的MIPs的吸附量，然后按照公式：Q=(c0-ce)×V/m計算得出分子印跡聚合物對木犀草素(LTL)的飽和吸附容量Q。

1.4.2動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)稱取0.0300 g MIPs，置于100 mL錐形瓶中，加入35 mL 100 μg/mL的木犀草素溶液，再加入15 mL無水甲醇，低頻超聲10 min。每間隔20 min吸取1 mL上層清液，離心5 min(800 r/min)，用0.45 μm膜過濾后，利用紫外分光光度計測得相應(yīng)濃度ce，根據(jù)公式計算MIPs的吸附容量Q。

1.4.3選擇性吸附實(shí)驗(yàn)取吸附瓶三個，分別加入10 mL濃度為100 μg/mL的木犀草素溶液、芹菜素溶液、香葉木素溶液，各加入MIPs 10 mg，超聲10 min后，置于25 ℃室溫下靜止12 h。利用紫外分光光度計測得相應(yīng)的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出濃度ce，根據(jù)公式分別計算MIPs的吸附容量Q。用相同的方法進(jìn)行R-NIPs的選擇性吸附實(shí)驗(yàn)。

1.5 樣品處理與固相萃取

取粉碎花生殼5 g溶解于200 mL 50%甲醇中，超聲提取0.5 h，回流提取3次，將三次提取的甲醇溶液合并后過濾，再將濾液蒸發(fā)濃縮，離心5 min，取上清液用50%甲醇定容至250 mL。分子印跡固相萃取(MISPE)柱依次用3 mL水和5 mL甲醇活化，取已處理好的甲醇溶液上樣，然后用3 mL乙腈淋洗，再用10 mL甲醇/乙酸(9∶1，V/V)作為洗脫液進(jìn)行洗脫，將洗脫液濃縮至1 mL。濃縮液經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)檢測。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm)；流動相:甲醇；紫外檢測波長：348 nm；流速：0.5 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 木犀草素印跡機(jī)理

木犀草素是一種多酚化合物，在預(yù)聚合中酚羥基上的H+與功能單體(AM)上的O原子發(fā)生強(qiáng)烈的氫鍵作用。加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑和RAFT試劑后，在60 ℃下反應(yīng)，生成聚合物，洗脫除去模板分子后，在聚合物內(nèi)部形成與模板分子結(jié)構(gòu)、大小相匹配的孔穴，可以特異選擇性吸附模板分子。在該分子印跡聚合物的末端，含有RAFT試劑，在相同的實(shí)驗(yàn)條件時，可以繼續(xù)引發(fā)反應(yīng)。

木犀草素分子內(nèi)部含有四個酚羥基，從理論上講功能單體與模板分子將以1∶4的比例形成配合物，在印跡孔穴中含有四個結(jié)合位點(diǎn)，依靠“四點(diǎn)作用”方式實(shí)現(xiàn)對模板分子的識別。酚羥基是氫鍵的良好供體，丙烯酰胺中的-NH2基與C=O基團(tuán)均可作為氫鍵受體，-NH2中N上的孤對電子與相鄰的C=O基團(tuán)會產(chǎn)生共軛，與木犀草素中的酚羥基形成穩(wěn)定的氫鍵。

2.2 R-MIPs與T-MIPs的掃描電鏡圖對比

采用傳統(tǒng)沉淀聚合法與RAFT-沉淀聚合法分別制備木犀草素MIPs，對比其形貌上的差異，掃描電鏡圖見圖1。傳統(tǒng)方法合成的聚合物有粘連現(xiàn)象，粒徑較小，且粒分布不均勻。加入RAFT試劑后，聚合物大小均一，粒徑明顯增大，大約為3.5 μm，更適合作為固相萃取填料。這是因?yàn)榫酆线^程中RAFT試劑的存在會導(dǎo)致活性種(生長鏈)和休眠種(RAFT基團(tuán)鏈)之間能夠形成快速的動力學(xué)平衡，從而使聚合速度可控。

圖1 T-MIPs(A)與R-MIPs(B)的掃描電鏡(SEM)圖(5 μm)Fig.1 SEM images of T-MIPs(A) and R-MIPs(B) (5μm)

2.3 靜態(tài)吸附性能

采用靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)考察聚合物吸附性能，繪制出R-MIPs、R-NIPs、T-MIPs、T-NIPs的靜態(tài)吸附曲線，見圖2。由圖2可知，R-MIPs和T-MIPs的吸附容量明顯高于R-NIPs和T-NIPs。這是因?yàn)镸IPs內(nèi)部存在與LTL結(jié)構(gòu)相匹配的印跡孔穴，且孔穴內(nèi)規(guī)則排列著與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，吸附容量較大；而NIPs內(nèi)部不存在這樣的孔穴，主要依靠物理吸附，吸附容量較小。另外，R-MIPs的吸附容量(32.60 mg/g)高于T-MIPs的吸附容量(29.06 mg/g)，這是因?yàn)樵赗AFT-沉淀聚合過程中引入DBTTC，抑制了自由基無序反應(yīng)，穩(wěn)定了增長自由基濃度，從而控制了反應(yīng)進(jìn)程，使粒徑更加均勻有序，吸附容量更大。R-NIPs 的吸附容量(14.41 mg/g)低于T-NIPs的吸附容量(16.61 mg/g)是因?yàn)橐隓BTTC后，聚合物粒徑變大，表面積減小，使其物理吸附量變小。

2.4 動態(tài)吸附性能

為考察R-MIPs對模板分子的結(jié)合速率，進(jìn)行動力學(xué)吸附實(shí)驗(yàn)?？疾炀酆衔锱c模板分子結(jié)合的動力學(xué)性能。動力學(xué)吸附曲線如圖3，吸附在2 h快速達(dá)到平衡，主要是由于RAFT-沉淀法制備的聚合物孔穴更均勻，表面更光滑，快速的吸附平衡可更好的應(yīng)用于實(shí)際。

圖2 R-MIPs、T-MIPs、T-NIPs和R-NIPs的吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherm of R-MIPs,T-MIPs,T-NIPs and R-NIPs

圖3 R-MIPs的動力學(xué)吸附曲線Fig.3 Kinetic adsorption curve of R-MIPs

對聚合物的動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)一級動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型擬合[12]，見表1。準(zhǔn)一級動力學(xué)模型公式為:ln(Qe-Qt)=lnQ1-K1t；準(zhǔn)二級動力學(xué)模型公式為:t/Qt=1/(K2Q22)+t/Q2。式中，Qt為t時刻的吸附容量(mg/g)；Qe為達(dá)到平衡時的吸附容量(mg/g)；K1，K2分別為一級和二級動力學(xué)速率常數(shù)(h-1)。

表1 聚合物準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型參數(shù)

準(zhǔn)一級動力學(xué)模型主要描述物理吸附，準(zhǔn)二級動力學(xué)模型主要描述化學(xué)吸附，包含了吸附的所有過程(外部液膜擴(kuò)散、表面吸附和顆粒內(nèi)擴(kuò)散等)。通過比較準(zhǔn)一級動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)R2，可知R-NIPs對LTL的吸附過程更符合準(zhǔn)一級動力學(xué)模型，屬于物理吸附，R-MIPs對LTL的吸附過程更符合準(zhǔn)二級動力學(xué)模型，屬于化學(xué)吸附。說明其吸附過程受化學(xué)吸附機(jī)理的控制，這種化學(xué)吸附涉及到吸附劑與吸附質(zhì)之間的電子共用或電子轉(zhuǎn)移，即LTL的羥基與功能單體AM的羰基之間存在電荷轉(zhuǎn)移。

圖4 R-MIPs與R-NIPs對三種底物的選擇性吸附Fig.4 Selective adsorption of R-MIPs and R-NIPs on three kinds of substrates

2.5 吸附選擇性

為考察MIPs對模板分子的選擇性能，選用與木犀草素結(jié)構(gòu)類似的香葉木素和芹菜素為對照物，測定聚合物對三者的吸附容量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖可知，R-MIPs對木犀草素的吸附容量遠(yuǎn)大于對香葉木素(Diosmetin)和芹菜素(Apigenin)的吸附容量，這是由于在R-MIPs中有與木犀草素結(jié)構(gòu)相匹配的印跡孔穴，這個印跡孔穴與其他兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不匹配，而R-NIPs對三種物質(zhì)的吸附容量無明顯差別，這是因?yàn)镽-NIPs中沒有與模板分子相匹配印跡孔穴，所以在吸附容量上差別很小。

圖5 花生殼在固相萃取前后的色譜圖Fig.5 Chromatograms of peanut shell before and after solid phase extraction

2.6 花生殼中木犀草素的提取

以R-MIPs作為固相萃取填料制備MISPE柱，將MISPE與HPLC法相結(jié)合，用于花生殼中木犀草素的富集與檢測。在花生殼中檢測出木犀草素，經(jīng)過測定其含量為5.69 mg/g，色譜圖見圖5，經(jīng)過MISPE處理后有效地去除了基質(zhì)雜質(zhì)，得到較好的富集分離效果，表明該印跡材料可用于對復(fù)雜樣品中木犀草素的分離純化。

3 結(jié)論

采用RAFT-沉淀聚合法制備了木犀草素分子印跡聚合物(R-MIPs)，并利用掃描電鏡進(jìn)行了表征。靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)表明，R-MIPs對LTL具有較大吸附容量，飽和吸附容量達(dá)到32.6 mg/g。以R-MIPs作為固相萃取填料對花生殼中木犀草素進(jìn)行分離富集，能有效去除基質(zhì)雜質(zhì)，該印跡聚合物表現(xiàn)出對LTL優(yōu)異的分離富集效果，為工業(yè)生產(chǎn)中LTL的分離提純提供了一種可能的途徑。