青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的克隆、序列分析及原核表達(dá)

王玉林

摘 要：【目的】為了進(jìn)一步明確青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的功能【方法】根據(jù)鑒定得到的青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的序列設(shè)計(jì)了引物，從青稞幼嫩葉片的cDNA中得到目的片段，并對目的基因序列進(jìn)行了測序鑒定和序列分析，同時(shí)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a（+）-RPL11，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）后利用IPTG 誘導(dǎo)外源蛋白質(zhì)表達(dá)并利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測?！窘Y(jié)果】成功擴(kuò)增出了青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的CDS全長序列，得到了重組蛋白。【結(jié)論】青稞核糖體蛋白基因HbRPL11的CDS全長序列大小為543 bp。經(jīng)生物信息學(xué)分析，HbRPL11編碼的蛋白質(zhì)含有181個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為24KD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.17，總平均親水性（GRAVY）為0.766，不穩(wěn)定系數(shù)為37.67為穩(wěn)定蛋白。重建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)表明該蛋白包含14個(gè)β-片狀螺旋結(jié)構(gòu)存在典型的核糖體蛋白L5結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，HbRPL11與小麥和山羊草的RPL11具有較近的親緣關(guān)系。蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，重組蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中。

關(guān)鍵詞：青稞；核糖體蛋白；RPL11；序列分析；原核表達(dá)

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum HooK.f.）為禾本科大麥屬，又名裸大麥、米大麥，為藏族人民主要糧食作物，是高原特色農(nóng)作物之一，有獨(dú)特的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和保健作用。青藏高原環(huán)境條件極端：高寒缺氧， 環(huán)境惡劣， 降雨量少、蒸發(fā)量大，青稞是在這種極端環(huán)境下植物適應(yīng)性進(jìn)化的典型代表。近些年來，研究者們先后對青稞的抗鹽性[2， 3]、抗旱性[4， 5]等方面進(jìn)行了研究，為選育適應(yīng)性強(qiáng)、綜合性狀優(yōu)良的品種奠定基礎(chǔ)。

我們通過轉(zhuǎn)錄組測序和抑制性差減雜交技術(shù)對青稞的抗寒相關(guān)基因進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)了核糖體蛋白基因RPL11（GeneBank登錄號： AK249873.1）。核糖體蛋白主要有70S和80S兩種類型[6， 7]，RPL11是葉綠體50S大亞基中編碼核糖體蛋白L11基因的序列。近期研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白不僅具有組成核糖體參與蛋白質(zhì)合成的功能，還可通過參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)等進(jìn)程調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、增殖、分化、發(fā)育等多種生命活動(dòng)。我們以青稞為材料，進(jìn)行RPL11基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)，旨在為進(jìn)一步了解RPL11功能，明確該蛋白與抗寒相關(guān)性方面提供參考依據(jù)，并為青稞的資源有效保護(hù)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料

供試材料為西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供的青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.）‘320和‘喜馬拉雅8號種子。

2.方法

（1）青稞種苗轉(zhuǎn)錄本的提取及反轉(zhuǎn)錄。將適量的青稞種子播種于富含有機(jī)質(zhì)的盆栽土壤中，正常澆水管理，待植株生長正常，以青稞新鮮幼葉為材料，使用Scientz-48高通量組織研磨儀磨樣，采用Jena InnuPREP RNA Mini Kit試劑盒提取新鮮葉片RNA，采用TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA樣本與-20℃冷凍保存。

（2） HbRPL11基因的克隆。依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異引物RPL11-F：5′- ATGTGCGGATCCATGTCGACGGAGAAG -3′，RPL11-R：5′- ATGTCGCTCGAGTTAGCTCGCATGGGACT -3′。RT-PCR反應(yīng)于S-1000 Thermal Cycler儀器，反應(yīng)體系采用20 μL PCR獲得充足產(chǎn)物：TaqDNA聚合酶（TaKaRa，5 U/μL） 0.2μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液（Takara） 2μL，dNTP（10 mmol/L）1.6μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA 2μL，滅菌水12.6μL。反應(yīng)條件：：94℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 45 s，64 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 60 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min?；厥漳繕?biāo)片段，克隆、測序。

（3）HbRPL11基因的生物信息學(xué)分析。利用NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov/）、ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）、DISPHOS（http：//www.dabi.temple.edu/disphos/）、InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）、Conserved domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signal IP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TargetP 1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、PredictProtein（https：//ppopen.rostlab.org/）、NPS（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopm.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）等網(wǎng)絡(luò)資源對HbRPL11進(jìn)行序列分析。根據(jù)推測的HbRPL11氨基酸序列，利用MEGA5.1軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性比對和進(jìn)化樹分析。

（4）原核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化。挑選測序正確的陽性克隆使用堿裂解法提取質(zhì)粒，采用EcoR I和Hind III分別雙酶切陽性重組質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+），1%瓊脂糖凝膠回收目標(biāo)片段，使用T4 DNA連接酶在16℃條件下過夜進(jìn)行片段連接。挑取單克隆，37℃震蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒。將鑒定正確的陽性質(zhì)粒pET28a-RPL11熱激轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將提取的pET-28a（+）空載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21（DE3）作陽性對照，BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞不轉(zhuǎn)化組作陰性對照。endprint