2型糖尿病患者KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)甲基化與胰島β細(xì)胞功能的相關(guān)性研究

李雯翀，朱詠瑤，劉抐岢，陳毅光，林志堅(jiān)

(東莞市第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科1、檢驗(yàn)科2，廣東 東莞 523320)

2型糖尿病患者KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)甲基化與胰島β細(xì)胞功能的相關(guān)性研究

李雯翀1，朱詠瑤1，劉抐岢1，陳毅光1，林志堅(jiān)2

(東莞市第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科1、檢驗(yàn)科2，廣東 東莞 523320)

目的探討2型糖尿病(T2DM)患者KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)甲基化與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、胰島素抵抗指數(shù)(Homa-IR)、胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(Homa-β)等指標(biāo)的關(guān)系。方法選取2014年4月至2015年4月在東莞市第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科初治的T2DM患者15例，根據(jù)糖化血紅蛋白(HbA1c)水平，將HbA1c≤9%的患者納入A組(n=5)，HbA1c＞9%者納入B組(n=10)；選擇15例健康者納入對(duì)照組。用亞硫酸鹽法測(cè)定KCNJ11基因啟動(dòng)子5'端300 bp中的46個(gè)CpG位點(diǎn)DNA甲基化水平，用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定KCNJ11基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并對(duì)KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)甲基化與Homa-IR、Homa-β的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果對(duì)照組受檢者的CpG+62、CpG+66、CpG+351甲基化比率分別為(58±24)%、(46±17)%、(96±8)%，A組分別為(60±19)%、(42±18)%、(99±7)%，B組分別為（60±18）%、(41±20)%、(98±4)%，三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；T2DM組與對(duì)照組mRNA表達(dá)分別為（1.27±0.56）、(0.95±0.49)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；B組患者的CpG+66與Homa-IR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.696，P＜0.05)，CpG+62與CpG+66甲基化總和則與Homa-β呈負(fù)相關(guān)(r=-0.664，P＜0.05)。結(jié)論2型糖尿病患者KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能與胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能相關(guān)，并參與2型糖尿病的發(fā)病。

2型糖尿??；DNA甲基化；聚合酶聯(lián)反應(yīng)；基因

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，近年來(lái)基因研究已成為糖尿病發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)，一些影響胰島素分泌、胰島素作用的基因位點(diǎn)發(fā)生變異，共同作用導(dǎo)致糖尿病的發(fā)病。內(nèi)向整流加通道Kir6.2亞基主要分布在胰島素β細(xì)胞，與磺酰脲受體1共同組成了β細(xì)胞ATP敏感性鉀通道(K-ATP通道)，在胰島素分泌的作用過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用[1]。因此，編碼構(gòu)成K-ATP通道兩亞基的基因是研究T2DM發(fā)病機(jī)制的重要候選基因。Kir6.2亞基由KCNJ11基因編碼，是目前得到較好重復(fù)的基因之一。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)遺傳與表觀遺傳機(jī)制共同在T2DM患者的發(fā)病過(guò)程中起重要作用[2]。本研究探討T2DM患者KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)甲基化與其mRNA、糖化血紅蛋白(HbA1c)、胰島素抵抗指數(shù)(Homa-IR)、胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(Homa-β)之間的關(guān)系，嘗試從表觀遺傳學(xué)角度解釋T2DM可能的致病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年4月至2015年4月在東莞市第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科確診的新發(fā)T2DM患者15例，其中男性9例，女性6例，平均年齡(57±13.1)歲。根據(jù)糖化血紅蛋白(HbA1c)水平，將HbA1c≤9%的患者納入A組(n=5)，HbA1c＞9%者納入B組(n=10)；選擇年齡、性別匹配的無(wú)糖尿病、自身免疫性疾病及其家族史的健康志愿者15例納入對(duì)照組，其中男性9例，女性6例，平均年齡(56.7±10.1)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)既往明確診斷為糖尿病患者；合并有嚴(yán)重感染、免疫功能疾病、惡性腫瘤、肝腎功能不全及心功能障礙患者；妊娠期、哺乳期患者；治療和隨訪期間失訪患者。所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本收集 收集所有受試者晨起空腹靜脈血各4 mL分別注入EDTA-K2的抗凝管內(nèi)(2支管各2 mL)和干燥管內(nèi)(1支管3 mL)，一支EDTA-K2的抗凝管常規(guī)分離血漿行靜脈血漿血糖測(cè)定，干燥管常規(guī)分離血漿后取血清行胰島素測(cè)定。葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖(FPG)，HbA1c檢測(cè)采用高壓液相色譜法。使用德國(guó)西門(mén)子ADVIACENTAUR CP全自動(dòng)免疫分析儀化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定血清胰島素(FINS)。Homa-IR=FINS×FPG/22.5，Homa-β=FINS×20/(FPG-3.5)。

1.2.2 CpG島預(yù)測(cè) KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)總長(zhǎng)度為1 417 bp，通過(guò)http://www.urogene.org/cgi-bin/met在線軟件預(yù)測(cè)285～910 bp(共626 bp)是一個(gè)CpG富含區(qū)域(CpG島)，位于第一外顯子下游游用“+”表示，檢測(cè)5’端300 bp左右區(qū)域，見(jiàn)圖1。

圖1 預(yù)測(cè)的KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)富含CpG島區(qū)域

1.2.3 BSP-測(cè)序 取受試者靜脈血1 mL，采用基因組DNA提取試劑盒(GENERAY，GK1022)抽提受試者外周血白細(xì)胞DNA，紫外分光光度法檢測(cè)DNA純度，置于-80°C凍存待用。應(yīng)用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN，cat：59824)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA亞硫酸氫鹽修飾處理，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后變?yōu)槟蜞奏?，甲基化的胞嘧啶不改變。MethPrimer軟件設(shè)計(jì)甲基化KCNJ11引物(見(jiàn)表1)，引物由GENERAY公司合成。PCR擴(kuò)增總體系50μL，加入經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA模板2μL，2×PCR buffer 25μL，上下游引物各1μL，用雙蒸水調(diào)整至終體積為50μL。PCR條件及設(shè)定反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性4 min；94°C變性30 s，55°C退火30 s，72°延伸40 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)；72°C修復(fù)延伸5 min結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，挑取陽(yáng)性克隆送GENERAY公司測(cè)序。BSP擴(kuò)增基因包含46個(gè)CpG位點(diǎn)，本研究設(shè)定原始系列中所有的CpG都是甲基化的，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后KCNJ11修飾序列所有的CpG均不發(fā)生改變，以避免原始序列中的TG感染甲基化率，見(jiàn)圖2。使用Vector NTI 8軟件對(duì)比序列，研究發(fā)現(xiàn)甲基化發(fā)生在第+62位、+66位、+351位3個(gè)CpG位點(diǎn)上，因此，以甲基化胞嘧啶(mC)克隆數(shù)目/10×100%計(jì)算個(gè)體甲基化率。

表1 本文中所用各種引物

圖2 假定檢測(cè)區(qū)域CG均甲基化經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后的KCNJ11基因+62～356序列

1.2.4 QPCR檢測(cè)信使RNA(mRNA) 用HiPure Blood/Liquid RNA Kit(Magen，R4163)提取外周血白細(xì)胞RNA，按Reverse Transcription System(Promega，A3500)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。QPCR擴(kuò)增總體系20μL，加cDNA模板1.5μL，GoTaq?qPCR Master Mix(Promega，A6002)10 μL，上下游引物(見(jiàn)表1)1 μL，用雙蒸水調(diào)整至終體積為20μL。PCR條件及設(shè)定反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性120 s；95°C變性15 s，60℃ 退火延伸30 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本均數(shù)的比較，多組間均數(shù)的比較采用方差分析；相關(guān)分析用Spearman相關(guān)分析，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組間啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率比較 對(duì)照組與2型糖尿病組各組(A組、B組)的三個(gè)位點(diǎn)甲基化比率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2、圖3。對(duì)照組mRNA相對(duì)定量為(0.95±0.49)，2型糖尿病組mRNA相對(duì)定量為(1.27±0.56)，兩組間mRNA表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.124，P＞0.05)。

2.2 啟動(dòng)子區(qū)域甲基化比率與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 分別對(duì)對(duì)照組、2型糖尿病A組和B組的KCNJ11啟動(dòng)區(qū)的三個(gè)位點(diǎn)CpG+62、CpG+66、CpG+351甲基化比率與mRNA、HbA1c、Homa-IR、Homa-β行相關(guān)性分析：該三個(gè)位點(diǎn)甲基化率在各組與mRNA、HbA1c、Homa-β均無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，CpG+62、CpG+351在各組與Homa-IR無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，CpG+66在2型糖尿病B組與Homa-IR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.696，P＜0.05)，見(jiàn)圖4A，CpG+62與CpG+66甲基化比率的總和在對(duì)照組、A組與Homa-β無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，在2型糖尿病B組與Homa-β呈負(fù)相關(guān)(r=-0.664，P＜0.05)，見(jiàn)圖4B。

表2 各組間啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率比較(%)

圖3 各組間KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)甲基化比率比較

圖4 A-B KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)域甲基化比率與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

2型糖尿病是成人發(fā)病型糖尿病，此類(lèi)患者并未完全喪失產(chǎn)生胰島素的能力，但是其胰島素的作用效果較差[3]。2型糖尿病的病因較為復(fù)雜，一方面胰島素分泌相對(duì)不足，另一方面則是因?yàn)榛颊弋a(chǎn)生了胰島素抵抗[4]。2型糖尿病的發(fā)病除了受到環(huán)境因素的影響外，基因遺傳因素也具有重要作用[5]。在2型糖尿病的易感基因的研究中，KCNJ11一直是一個(gè)熱點(diǎn)。KCNJ11基因全長(zhǎng)約2 kb，編碼內(nèi)向整流鉀通道Kir6.2亞基。Kir6.2亞基主要分布于胰島β細(xì)胞，并與磺脲受體1共同組成β細(xì)胞ATP敏感的鉀通道。而Kir6.2亞基在其中組成通道中心通透孔，該通道在胰島素分泌和作用過(guò)程中扮演著十分重要的角色，成為2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中易感基因之一[6]。目前有大量的研究提示KCNJ11基因突變是2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一，并把其發(fā)病機(jī)制的研究提升到了表觀遺傳學(xué)的水平[7]。但是也有國(guó)內(nèi)的一些研究發(fā)現(xiàn)KCNJ11的E23K位點(diǎn)、rs5219等位點(diǎn)的核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病的易感性沒(méi)有顯著相關(guān)性[8-9]。因此我們將研究的方向轉(zhuǎn)向KCNJ1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率方面，研究是否其對(duì)胰島β細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響胰島素的分泌及機(jī)體對(duì)胰島素的抵抗。Olsson等[10]報(bào)道，胰島β細(xì)胞相關(guān)基因之一KCNJ11甲基化與胰島β細(xì)胞mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而在我國(guó)目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本研究創(chuàng)新性地將新發(fā)T2DM患者KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與其相對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)及應(yīng)用于Homa-IR、Homa-β的評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在研究區(qū)域的甲基化比率與其mRNA表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性，在均有甲基化的位點(diǎn)-CpG+62、CpG+66、CpG+351，正常組與2型糖尿病組各組(A組、B組)的KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)的這三個(gè)位點(diǎn)甲基化比率均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這可能是由于樣本量較小的原因，也可能說(shuō)明KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)甲基化與2型糖尿病的易感性無(wú)關(guān)。雖然本研究樣本量較小，但在其甲基化比率與上述臨床相關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析中，部分結(jié)果已具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故在2型糖尿病血糖升高患者中KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)存在某些位點(diǎn)的甲基化率與Homa-IR、Homa-β指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)可能是2型糖尿病患者啟動(dòng)子區(qū)的某些位點(diǎn)的甲基化水平變化影響了胰島β分泌胰島素功能，這可能與該基因某些位點(diǎn)突變相關(guān)[11]，而對(duì)mRNA表達(dá)影響不明顯。

綜上所述，2型糖尿病患者KCNJ11啟動(dòng)子區(qū)某些位點(diǎn)的甲基化率與Homa-IR、Homa-β存在負(fù)相關(guān)性。本研究旨在為2型糖尿病發(fā)病機(jī)制在表觀遺傳學(xué)研究的發(fā)展提供幫助，期望為今后2型糖尿病發(fā)病機(jī)制及新藥的研究提供方向。本研究所用樣本量較小，后續(xù)深入研究需采用較大的樣本量。

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Relationship between the DNA methylation of KCNJ11's promoter and islet β-cell function in patients with type 2 diabetes.

LI Wen-chong1,ZHU Yong-yao1,LIU Rui-ke1,CHEN Yi-guang1,LIN Zhi-jian2.Department of Endocrinology1,Department of Clinical Laboratory2,The Third People's Hospital of Dongguan,Dongguan 523320,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the relationship between KCNJ11 promoter methylation and gene transcription,Homa-IR and Homa-β in patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM).MethodsA total of 15 new cases of T2DM patients,who admitted Department of Endocrinology of the Third People's Hospital of Dongguan from April 2014 to April 2015,were selected and divided into A group(5 cases of HbA1c≤9%)and B group(10 cases of HbA1c＞9%)according to the level of HbA1c,and 15 healthy subjects were included into the control group.DNA methylation level of 5'end of 300 bp in the 46 CpG loci of KCNJ11 gene promoter was determined by sulfite method,The transcriptional expression of KCNJ11 gene was measured by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The relationship between KCNJ11 promoter methylation and Homa-IR,Homa-β was analyzed.Results The methylation ratio of CpG+62,CpG+66,CpG+351 in the control group were(58±24)%,(46±17)%,(96±8)%,respectively,(60±19)%,(42±18)%,(99±7)%inAgroup,and(60±18)%,(41±20)%,(98±4)%in B group,respectively,with no significant difference between the three groups(P＞0.05).There was no significant difference in the expression of mRNA between T2DM patients(1.27±0.56)and the control group(0.95±0.49)(P＞0.05),but in the B group,CpG+66 was negatively correlated with Homa-IR(r=-0.696,P＜0.05),and CpG+62 and CpG+66 methylation sum was negatively correlated with Homa-β (r=-0.664,P＜0.05).ConclusionThe methylation of KCNJ11 promoter region in type 2 diabetic patients may be related to the insulin secretion function of islet beta cells,and involved in the morbidity of type 2 diabetes mellitus.

Type 2 diabetes mellitus(T2DM);DNAmethylation;Polymerase chain reaction(PCR);Gene

R587.1

A

1003—6350（2017）20—3287—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.20.007

東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201410515000819）

李雯翀。E-mail：elimy123@sina.com

2017-06-20)