咯菌腈對四種牡丹葉片病原真菌的抑制活性

徐建強(qiáng)，平忠良，劉瑩，馬世闖，許道超，楊嵐，鄭偉，劉圣明，夏彥飛，林曉民

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咯菌腈對四種牡丹葉片病原真菌的抑制活性

徐建強(qiáng)，平忠良，劉瑩，馬世闖，許道超，楊嵐，鄭偉，劉圣明，夏彥飛，林曉民

（河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南洛陽 471003）

探究咯菌腈對牡丹黑斑病菌（）、黃斑病菌（）、腔孢葉斑病菌（）和葉霉病菌（）菌絲生長、孢子萌發(fā)、芽管伸長及產(chǎn)孢的抑制活性，分析咯菌腈在牡丹病害化學(xué)防治上的應(yīng)用前景。采用菌絲生長速率法測定咯菌腈對菌絲生長的抑制活性，采用涂布平板法測定咯菌腈對孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢時(shí)間及產(chǎn)孢量、芽管伸長及芽管和孢子形態(tài)的影響?？┚鎸η绘呷~斑病菌菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.01 μg·mL-1，其次為黑斑病菌和黃斑病菌，分別為0.07和0.35 μg·mL-1；咯菌腈對4種病菌的孢子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制作用，對腔孢葉斑病菌的抑制作用最強(qiáng)，其EC50為1.26 μg·mL-1，對其他3種病菌孢子萌發(fā)的EC50在3.27—3.45 μg·mL-1；0.1 μg·mL-1咯菌腈對4種病菌分生孢子芽管伸長的抑制率在40%—70%，表明咯菌腈對4種病菌分生孢子芽管伸長均有明顯的抑制作用，濃度越大抑制作用越強(qiáng)，各濃度間差異顯著，其中對腔孢葉斑病菌芽管伸長抑制的EC50為0.04 μg·mL-1，抑制作用最強(qiáng)，對其他3種病菌芽管伸長的EC50在0.08—0.22 μg·mL-1；咯菌腈對黑斑病菌和黃斑病菌分生孢子和芽管的致畸作用強(qiáng)烈，可導(dǎo)致孢子及芽管膨大、過度分枝，而對葉霉病菌和腔孢葉斑病菌致畸作用較弱，芽管及孢子形態(tài)基本正常；咯菌腈可推遲黑斑病菌、黃斑病菌及葉霉病菌的產(chǎn)孢時(shí)間，對黑斑病菌產(chǎn)孢量的抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.05 μg·mL-1，對葉霉病菌次之，EC50為0.38 μg·mL-1，但對腔孢葉斑病菌產(chǎn)孢有促進(jìn)作用。咯菌腈對牡丹黑斑病菌及腔孢葉斑病菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)及芽管伸長均有很強(qiáng)的抑制作用，但對腔孢葉斑產(chǎn)孢具有一定的促進(jìn)作用；對葉霉病菌和黃斑病菌孢子萌發(fā)及芽管伸長、黃斑病菌菌絲生長及葉霉病菌產(chǎn)孢的抑制作用強(qiáng)烈；由于咯菌腈內(nèi)吸活性較弱，無法抑制已侵入牡丹葉片的病原真菌的生長，故建議作為保護(hù)劑在病害發(fā)生前施用。

咯菌腈；牡丹病原真菌；菌絲生長；孢子萌發(fā)；產(chǎn)孢；芽管伸長

0 引言

【研究意義】牡丹隸屬于芍藥科芍藥屬，在國內(nèi)作為傳統(tǒng)名花深受人們的喜愛，兼具觀賞和藥用價(jià)值[1]。近年來，在牡丹栽培管理過程中，由于土壤和苗木消毒不嚴(yán)，栽培方法不當(dāng)，管理不善以及氣候等因素，真菌病害有逐年加重趨勢，且出現(xiàn)了幾種新病害[2-3]?！吨袊档と珪饭矆?bào)道27種牡丹病害[2]，《河南省經(jīng)濟(jì)植物病害志》共報(bào)道25種牡丹病害[4]。種植面積的擴(kuò)大和各種傳統(tǒng)病害的積累以及新型病害的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了牡丹原有價(jià)值的表現(xiàn)。因此，篩選防治牡丹病害的有效藥劑具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，對牡丹病害的研究僅限于病原菌的鑒定及病害的大田防治，對病害防治藥劑篩選的研究較少[5]。苯并咪唑類殺菌劑如多菌靈和甲基托布津在牡丹葉霉病的大田防治上顯示出良好的控制效果[6]。研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈、戊唑醇及嘧菌酯對葉霉病菌（）孢子萌發(fā)均有很強(qiáng)的抑制作用，表明3種殺菌劑均可作為保護(hù)劑在病害發(fā)生前期噴施[7]。嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑和多菌靈3種殺菌劑對牡丹黑斑病菌（）的菌絲生長及孢子萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制作用，在防治牡丹黑斑病上表現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力[8]。多菌靈、嘧菌酯及苯醚甲環(huán)唑均可用于牡丹黃斑病的化學(xué)防治[9]。此外，百菌清可濕性粉劑對牡丹黃斑病也有很好的抑制效果[10]。多菌靈、氟環(huán)唑及嘧菌酯可作為柱枝孢葉斑病化學(xué)防治的備選藥劑而應(yīng)用在牡丹病害的綜合防控中[11]。戊唑醇和嘧菌酯可以抑制牡丹腔孢葉斑病菌（）的生長[12]。咯菌腈屬于苯吡咯類保護(hù)性殺菌劑，商品名適樂時(shí)。咯菌腈對鏈格孢（）、玉米小斑離蠕孢（）、灰葡萄孢（）、油菜菌核病菌（）及禾谷絲核菌（）的菌絲生長均有很強(qiáng)的抑制作用，敏感性基線分別為0.77[13]、0.04[14]、0.01[15]、0.02[16]及0.03 μg·mL-1[17]。咯菌腈處理可使油菜菌核病菌菌絲細(xì)胞膨大，原生質(zhì)濃縮、外滲等，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡；田間試驗(yàn)則表明，咯菌腈對油菜菌核病具有很好的保護(hù)作用及一定的治療作用[18]?？┚媾c噻菌靈無交互抗性，已對噻菌靈產(chǎn)生抗藥性的擴(kuò)展青霉（）的菌絲生長及孢子萌發(fā)對咯菌腈均較為敏感，是采后蘋果青霉病防治上的一種理想藥劑[19]。進(jìn)一步的研究則證實(shí)真菌對咯菌腈的敏感性受其體內(nèi)組氨酸激酶的調(diào)控，III組組氨酸激酶中保守氨基酸的突變或缺失均可引起病菌對咯菌腈的敏感性降低[20-21]?？┚娌坏珜Χ喾N病原菌有抑制活性，而且能促進(jìn)幼苗生長，提高抗病性相關(guān)酶的活性[22]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2017年3月30日，在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)（http://www.chinapesticide.gov.cn/hysj/index. jhtml）上查詢，咯菌腈原藥、制劑及其為主要成分的復(fù)配劑共99條，而在該網(wǎng)上登記注冊用于防治牡丹病蟲害的藥劑僅一種——烯酰嗎啉水分散粒劑，用來防治觀賞牡丹霜霉病?？┚嫔形从性谀档げ『Ψ乐紊蠎?yīng)用的報(bào)道，在牡丹病害防治方面的前景有待探索?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以牡丹葉霉病菌、牡丹黑斑病菌、牡丹黃斑病菌（）及牡丹腔孢葉斑病菌為研究對象（前兩種引起的病害比較嚴(yán)重和普遍，腔孢葉斑病是洛陽地區(qū)出現(xiàn)的新型病害），明確咯菌腈對這4種病菌生長的抑制作用，分析咯菌腈在牡丹病害化學(xué)防治上的應(yīng)用前景，為牡丹病害的化學(xué)防控打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年2—6月在河南科技大學(xué)林學(xué)院植物病原物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 2013年實(shí)驗(yàn)室分離保存的牡丹葉霉病菌、牡丹黑斑病菌、牡丹黃斑病菌、牡丹腔孢葉斑病菌菌株，由河南科技大學(xué)林學(xué)院植物病原物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試藥劑 97.9%咯菌腈原藥，先正達(dá)中國投資有限公司生產(chǎn)，預(yù)溶于甲醇中，配制成1.0×104μg·mL-1的母液備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（potato sugar agar，PSA）用于菌株活化、菌絲生長和產(chǎn)孢試驗(yàn)。水瓊脂培養(yǎng)基（water agar，WA）用于孢子萌發(fā)和芽管伸長試驗(yàn)。磷酸二氫鉀葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（KH2PO4dextrose agar，KDA）用于產(chǎn)孢時(shí)間試驗(yàn)，其成分KH2PO41.0 g、KNO31.0 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、淀粉0.2 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g、瓊脂18—20 g、H2O 1 L[15]。

1.2 儀器設(shè)備

SW-CJ-IFD型雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，蘇州智凈技術(shù)有限公司；SPX-250B5H-II型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LS-50LD型立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；CX41型Olympus系統(tǒng)顯微鏡，Olympus（中國）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 咯菌腈對病菌菌絲生長的影響 采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法即菌絲生長速率法進(jìn)行測定[23]。將分離純化的菌株在PSA平板上培養(yǎng)5—10 d后，用打孔器在菌落邊緣打制直徑5 mm的菌餅，接種在含系列濃度藥劑的PSA平板正中央，其中對牡丹腔孢葉斑病菌濃度梯度設(shè)置為0、0.0003125、0.000625、0.00125、0.0025、0.005、0.01 μg·mL-1，對牡丹黑斑病菌和牡丹黃斑病菌濃度梯度均設(shè)置為0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 μg·mL-1，25℃黑暗培養(yǎng)一定天數(shù)（黑斑7 d、黃斑12 d、腔孢葉斑12 d），待不含藥的對照平板菌落直徑達(dá)到70—80 mm時(shí)，用十字交叉法測量每個(gè)平板的菌落直徑，每處理3個(gè)重復(fù)，計(jì)算各濃度處理下咯菌腈對菌絲生長的抑制率。菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.3.2 咯菌腈對病菌孢子萌發(fā)的影響 采用涂布平板法測定[24]。菌株在PSA平板上25℃培養(yǎng)10 d后，用0.1%吐溫80溶液洗下分生孢子，4層紗布過濾除去菌絲，將濾液在5 000 r/min下離心10 min，去除上清液，將分生孢子重懸于0.1%吐溫80溶液中，調(diào)節(jié)孢子濃度至105個(gè)/mL，制成孢子懸浮液備用。吸取100 μL孢子懸液涂布在含0、0.1、0.5、1、5、10、50 μg·mL-1咯菌腈的WA平板上，每處理3次重復(fù)，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)病菌（葉霉病菌24 h、黃斑病菌12 h、黑斑病菌12 h、腔孢葉斑病菌18 h），直到對照的萌發(fā)率達(dá)到95%以上，每皿隨機(jī)觀察100個(gè)孢子，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)，以芽管長度超過孢子最大直徑的一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算萌發(fā)抑制率。孢子萌發(fā)抑制率=（對照孢子萌發(fā)率-藥劑處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率×100%。

1.3.3 咯菌腈對病菌孢子芽管伸長和芽管形態(tài)的影響 操作步驟同1.3.2，涂布平板黑暗培養(yǎng)一定時(shí)間后，在顯微鏡下使用測微尺對芽管長度進(jìn)行測量，每皿隨機(jī)選取10根芽管測量，求出平均芽管長度，計(jì)算各藥劑濃度對芽管伸長的抑制率。芽管伸長抑制率=（對照芽管平均長度-藥劑處理芽管平均長度）/對照芽管平均長度×100%。測量結(jié)束后對各個(gè)藥劑濃度下的孢子及芽管形態(tài)拍照。

1.3.4 咯菌腈對病菌產(chǎn)孢時(shí)間的影響 參照康業(yè)斌等[25]的方法進(jìn)行。按照1.3.2的方法制作孢子懸浮液，取0.1 mL孢子懸浮液涂布在含CK、0.1、0.5、1、5、10、50 μg·mL-1咯菌腈的KDA平板上，每處理3次重復(fù)，于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每隔12 h觀察記錄產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成情況，直到分生孢子出現(xiàn)，記錄分生孢子產(chǎn)生的時(shí)間。

1.3.5 咯菌腈對病菌產(chǎn)孢量的影響 對于牡丹黑斑病菌及腔孢葉斑病菌，結(jié)合1.3.1進(jìn)行，十字交叉法測完菌落直徑后，繼續(xù)培養(yǎng)18 d（黑斑病菌）及7 d（腔孢葉斑病菌）后測定產(chǎn)孢量。對于葉霉病菌，取0.1 mL孢子懸液，涂布在含0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6及0.8 μg·mL-1咯菌腈的PSA平板上，培養(yǎng)3 d后測量產(chǎn)孢量。取10 mL 0.1%吐溫80溶液至平板中，用玻璃刮鏟刮下孢子，然后用移液槍將孢子液移入10 mL的離心管中，在振蕩器上振蕩降低孢子間的表面張力使孢子充分溶解在溶劑中，用移液槍吸取50或100 μL孢子液打入血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，對每格孢子計(jì)數(shù)并確定稀釋倍數(shù)，孢子濃度大的稀釋至105個(gè)/mL，濃度小的不稀釋，在10×鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算各濃度處理下藥劑對病原菌產(chǎn)孢的抑制率。產(chǎn)孢抑制率=（對照產(chǎn)孢量-藥劑處理產(chǎn)孢量）/對照產(chǎn)孢量×100%。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用DPS-6.55Patch軟件中的數(shù)量型數(shù)據(jù)機(jī)值分析模塊計(jì)算藥劑抑制菌絲生長、孢子萌發(fā)、芽管伸長及產(chǎn)孢量的有效中濃度EC50，并采用最小顯著差異法（Least-Significant Difference，LSD）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 咯菌腈對病菌菌絲生長的抑制作用

咯菌腈對3種牡丹病原真菌均有很強(qiáng)的抑制作用，其中對腔孢葉斑病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.01 μg·mL-1；對黑斑病菌的抑制作用較強(qiáng)，EC50＜0.1 μg·mL-1；而對黃斑病菌的抑制作用較弱（表1）。由于葉霉病菌在PSA上培養(yǎng)時(shí)菌絲少，不易測定，故本文未對葉霉進(jìn)行菌絲生長抑制作用的測定。

2.2 咯菌腈對病菌孢子萌發(fā)的影響

由表1可知，咯菌腈對葉霉病菌、黃斑病菌、黑斑病菌、腔孢葉斑病菌的孢子萌發(fā)都有較強(qiáng)的抑制作用，相比較下，咯菌腈對腔孢葉斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，EC50僅為1.26 μg·mL-1，對葉霉病菌、黃斑病菌、黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用較弱，但咯菌腈對這3種病菌孢子萌發(fā)的抑制作用相差不大，EC50在3.27—3.45 μg·mL-1。

2.3 咯菌腈對病原真菌芽管伸長及形態(tài)的影響

咯菌腈對葉霉病菌、黃斑病菌、黑斑病菌、腔孢葉斑病菌的芽管伸長都有較強(qiáng)的抑制作用，其中對腔孢葉斑病菌芽管伸長的EC50為0.04 μg·mL-1，抑制作用最強(qiáng)（表1）?？┚鎸?種病原菌分生孢子芽管伸長均有明顯抑制作用，最小藥劑濃度對病原菌分生孢子芽管伸長的抑制率已達(dá)到40%—70%，而且隨著濃度增大，抑制作用越強(qiáng)，各濃度間差異顯著（表2）。

2.3.1 牡丹黑斑病菌 黑斑病菌孢子在培養(yǎng)12 h后，芽管長度達(dá)到317 μm，不同濃度的咯菌腈對芽管伸長均有很強(qiáng)的抑制作用，0.1 μg·mL-1抑制率即達(dá)到50.16%，隨著濃度升高，抑制率逐漸增大；50 μg·mL-1時(shí)，抑制率達(dá)到95%（表2）?？┚鎸诎卟【抗苌扉L的EC50為0.08 μg·mL-1，表明藥劑對黑斑病菌芽管伸長有很強(qiáng)的抑制作用（表1）。

在WA上涂布12 h后，黑斑病菌分生孢子從一端或兩端萌發(fā)形成菌絲狀芽管，細(xì)胞形態(tài)正常，能正常生長并分化形成菌絲，但并未產(chǎn)生分枝（圖1-A）。在含藥平板上，分生孢子及芽管均出現(xiàn)畸形。低濃度下（0.1 μg·mL-1），藥劑對孢子及芽管致畸作用不明顯（圖1-B）。隨著藥劑濃度升高，致畸作用增強(qiáng)，0.5、1和5 μg·mL-1時(shí)，分生孢子兩端、中間均有細(xì)胞萌發(fā)，在萌發(fā)時(shí)，芽管已開始產(chǎn)生分枝（圖1-C—E）。而在10和50 μg·mL-1時(shí)，分生孢子及芽管均有腫脹現(xiàn)象，生出的芽管不規(guī)則畸形，并表現(xiàn)為基部膨大，頂端膨大及中間局部膨大；芽管分枝間距縮短，分生孢子變形嚴(yán)重（圖1-F、1-G）。

表1 咯菌腈對牡丹病原真菌菌絲生長、孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢量及芽管伸長的抑制作用

表2 咯菌腈對牡丹4種病原真菌芽管伸長的影響

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)LSD法檢驗(yàn)在＜0.05水平差異顯著

Data were mean±SD. Different letters in the same column indicated significant difference at＜0.05 level by LSD test

A: CK (100×); B: 0.1 μg·mL-1 (100×); C: 0.5 μg·mL-1 (400×); D: 1 μg·mL-1 (400×); E: 5 μg·mL-1 (400×); F: 10 μg·mL-1 (400×); G: 50 μg·mL-1 (400×)

2.3.2 牡丹葉霉病菌 葉霉病菌分生孢子涂布24 h后，芽管長度可達(dá)到239 μm（表2）。低濃度藥劑（0.1 μg·mL-1）即對芽管伸長產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制作用，芽管長度僅138.67 μm，抑制率達(dá)到41.84%；濃度升高，抑制作用增強(qiáng)。咯菌腈對葉霉病菌芽管伸長的EC50為0.22 μg·mL-1，抑制作用明顯（表1）。

分生孢子涂布24 h后，在WA平板上，分生孢子一端萌發(fā)形成菌絲狀芽管，細(xì)胞形態(tài)正常，幾乎不形成分枝（圖2-A）。藥劑濃度為0.1、0.5 μg·mL-1的平板上，咯菌腈對芽管的致畸作用不明顯（圖2-B、2-C）。藥劑濃度在1 μg·mL-1以上時(shí)，分生孢子可以從一端或兩端萌發(fā)，長出兩根芽管；咯菌腈對葉霉病菌孢子及芽管致畸作用較弱，芽管基部稍有膨大，但畸形現(xiàn)象均不太明顯（圖2-D—G）。

A: CK (100×); B: 0.1 μg·mL-1 (100×); C: 0.5 μg·mL-1 (200×); D: 1 μg·mL-1 (200×); E: 5 μg·mL-1 (200×); F: 10 μg·mL-1 (200×); G: 50 μg·mL-1 (200×)

2.3.3 牡丹腔孢葉斑病菌 分生孢子涂布18 h后，其芽管長度可達(dá)316 μm（表2）。低濃度藥劑即對芽管伸長產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，0.1 μg·mL-1時(shí)，芽管長度僅為68 μm，抑制率達(dá)到78.48%，而在高濃度50 μg·mL-1時(shí)，孢子芽管可以萌發(fā)，但長出的芽管基本不伸長，僅為2.33 μm，抑制率在99%以上。咯菌腈對腔孢葉斑病菌芽管伸長的EC50為0.04 μg·mL-1，抑制作用最為強(qiáng)烈（表1）。

涂布平板18 h后，在不含藥劑的WA平板上，分生孢子從一端萌發(fā)，形成較長的形態(tài)正常的菌絲狀芽管，尚未產(chǎn)生分枝（圖3-A）；低濃度藥劑（0.1、0.5 μg·mL-1）可導(dǎo)致分生孢子從兩端萌發(fā)長出芽管，芽管形態(tài)正常，不分枝（圖3-B、3-C）；高濃度藥劑（1、5、10、50 μg·mL-1）時(shí)，分生孢子略膨大，一般從一端開始萌發(fā)，甚至不萌發(fā)，但咯菌腈對分生孢子及芽管的致畸作用均不太明顯（圖3-D—G）。

A: CK (100×); B: 0.1 μg·mL-1 (400×); C: 0.5 μg·mL-1 (400×); D: 1 μg·mL-1 (400×); E: 5 μg·mL-1 (400×); F: 10 μg·mL-1 (400×); G: 50 μg·mL-1 (400×)

2.3.4 牡丹黃斑病菌 涂布平板12 h后，黃斑病菌芽管長度可達(dá)248.33 μm（表2）。0.1 μg·mL-1時(shí)，咯菌腈對芽管伸長的抑制率已達(dá)50%以上，說明抑制作用強(qiáng)烈；隨著濃度升高，抑制作用增強(qiáng)（表2）?？┚鎸S斑病菌芽管伸長的EC50為0.18 μg·mL-1，抑制作用明顯（表1）。

涂布平板12 h后，分生孢子周圍可長出2—3根芽管，并且已開始產(chǎn)生分枝（圖4-A）。低濃度下（0.1、0.5、1 μg·mL-1），芽管可正常生長和分枝，但基部有膨大現(xiàn)象（圖4-B—D）。隨著濃度升高（5、10 μg·mL-1），芽管基部及中間部位膨大明顯，分枝數(shù)明顯增多（圖4-E、4-F），但芽管頂端的菌絲形態(tài)正常。50 μg·mL-1時(shí)，分生孢子不能萌發(fā)或僅從一端萌發(fā)，且芽管形態(tài)正常（圖4-G）。

2.4 咯菌腈產(chǎn)孢時(shí)間和產(chǎn)孢量的影響

黑斑病菌分生孢子在KDA平板上培養(yǎng)120 h后，對照平板及0.1 μg·mL-1的平板上出現(xiàn)了分生孢子梗及分生孢子，其他含藥平板均未出現(xiàn)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。由圖5可知，在PSA上黑斑病菌可大量產(chǎn)孢，咯菌腈對黑斑病菌產(chǎn)孢有強(qiáng)烈的抑制作用，0.03125 μg·mL-1時(shí)，抑制率即可達(dá)到20%以上；隨著藥劑濃度增高，產(chǎn)孢量越來越少，抑制率逐漸增大。咯菌腈對黑斑病菌產(chǎn)孢的EC50為0.05 μg·mL-1，抑制作用強(qiáng)烈（表1）。

A: CK (100×); B: 0.1 μg·mL-1 (200×); C: 0.5 μg·mL-1 (200×); D: 1 μg·mL-1 (200×); E: 5 μg·mL-1 (200×); F: 10 μg·mL-1 (200×); G: 50 μg·mL-1 (200×)

圖5 咯菌腈對牡丹黑斑病病菌產(chǎn)孢的影響

葉霉病菌分生孢子在KDA平板上培養(yǎng)60 h后，對照及含藥平板上均出現(xiàn)了分生孢子梗和分生孢子，對照平板上，分生孢子梗發(fā)生3—6次分枝，每個(gè)分枝上有4—6個(gè)相連排列成念珠狀的分生孢子；濃度為0.1 μg·mL-1時(shí)，分生孢子梗發(fā)生3—4次分枝，每個(gè)分枝上有3—4個(gè)分生孢子；0.5、1 μg·mL-1時(shí)，分生孢子梗發(fā)生1—2次分枝，每個(gè)分枝含1—3個(gè)孢子；5、10 μg·mL-1時(shí)，分生孢子?？砂l(fā)生分枝，僅1—2個(gè)孢子；而50 μg·mL-1時(shí)，很少能觀察到產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。葉霉病菌在PSA上可大量產(chǎn)孢（圖6）。低濃度下，0.2 μg·mL-1時(shí)，藥劑對產(chǎn)孢有一定的抑制作用，且隨著藥劑濃度升高，抑制作用增強(qiáng)，0.5 μg·mL-1時(shí)抑制率即可達(dá)到90%左右?？┚鎸θ~霉病菌產(chǎn)孢的EC50為0.38 μg·mL-1，抑制作用稍弱于黑斑病菌（表1）。

腔孢葉斑病菌在KDA平板上培養(yǎng)84 h后，對照平板出現(xiàn)了分生孢子座和分生孢子；繼續(xù)培養(yǎng)至120 h，各供試藥劑濃度均未出現(xiàn)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。腔孢葉斑在PSA上培養(yǎng)時(shí)可大量產(chǎn)孢，但不同濃度的咯菌腈卻對腔孢葉斑產(chǎn)孢有促進(jìn)作用，產(chǎn)孢量同對照相比差別顯著（圖7）。

黃斑病菌分生孢子在KDA平板上培養(yǎng)36 h后，對照平板上出現(xiàn)了分生孢子器；繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，低濃度（0.1、0.5、1 μg·mL-1）的平板上出現(xiàn)了分生孢子器，其余平板均未觀察到產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。由于黃斑病菌分生孢子產(chǎn)生于分生孢子器中，不易計(jì)數(shù)，故未進(jìn)行黃斑病菌產(chǎn)孢量測定。

圖6 咯菌腈對牡丹葉霉病病菌產(chǎn)孢的影響

圖7 咯菌腈對牡丹腔孢葉斑病病菌產(chǎn)孢的影響

3 討論

由于牡丹的觀賞時(shí)間在每年的4月份，此時(shí)牡丹新葉生出不久，生長健壯，對不良環(huán)境的抵抗力強(qiáng)。且4月份時(shí)溫度較低，病原菌尚不活躍，牡丹園沒有太多的接種體，故此時(shí)間牡丹上很少有病蟲害的危害。進(jìn)入7、8月份后，溫度升高，日照加強(qiáng)，不利于喜涼耐蔭的牡丹的生長，生長勢下降，易造成牡丹葉片干枯。溫度升高會(huì)導(dǎo)致病原菌繁殖速度加快，牡丹園接種體數(shù)量加大，易侵染生長勢下降的牡丹葉片，造成牡丹葉部病害大片發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)牡丹園一片枯焦。由于此時(shí)已過了牡丹的觀賞時(shí)節(jié)，此外7、8月份后牡丹的長勢并不會(huì)引起人們的關(guān)注，故嚴(yán)重發(fā)生的牡丹葉部病害一直未能引起人們足夠的重視[26]。但牡丹葉片所合成的有機(jī)物，不但滿足牡丹當(dāng)年生長的需要，且為牡丹來年的開花提供充足的養(yǎng)分供應(yīng)。感染葉斑病后，牡丹葉片光合作用及營養(yǎng)物質(zhì)合成等生理功能受到破壞，導(dǎo)致根養(yǎng)分貯藏減少，這會(huì)對當(dāng)年的花芽長勢及來年的開花品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，故對牡丹葉部病害的防治不能松懈[27]。目前，防治牡丹葉部病害的藥劑少之又少，在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)上僅能查詢到一種用于防治牡丹病害的藥劑，生產(chǎn)中的用藥多為波爾多液、多菌靈等傳統(tǒng)藥劑為主。多菌靈盡管對黑斑病菌的芽管伸長和產(chǎn)孢有一定的抑制作用，但對葉霉病菌、腔孢葉斑病菌、黃斑病菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)及產(chǎn)孢量的抑制作用均較弱，不適合應(yīng)用于牡丹病害的化學(xué)防治，故對牡丹葉部病害的防治效果并不明顯[7-9,12]。

咯菌腈屬于苯吡咯類的保護(hù)性殺菌劑，可抵抗多種病原真菌的侵染。由本試驗(yàn)可看出，咯菌腈對牡丹4種病原真菌的抑制活性由強(qiáng)到弱依次為腔孢葉斑病菌、黑斑病菌、黃斑病菌及葉霉病菌?？┚鎸Χ喾N病原真菌的菌絲生長均有強(qiáng)烈的抑制作用[13-17]，而本研究則表明，咯菌腈除對病菌菌絲生長有影響外，對孢子萌發(fā)、芽管伸長及產(chǎn)孢也有很強(qiáng)的抑制作用，說明咯菌腈對病菌的影響是全面的。Errampalli[19]研究表明，咯菌腈抑制擴(kuò)展青霉分生孢子萌發(fā)的EC50為0.08—0.11 μg·mL-1；這比本研究測定的咯菌腈對4種病菌孢子萌發(fā)的EC50小，這可能是由于供試病菌的不同造成。范子耀等[28]研究表明，咯菌腈對馬鈴薯早疫病菌的敏感性基線為0.04 μg·mL-1。本研究中咯菌腈

對牡丹黑斑病菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)、芽管伸長及產(chǎn)孢都有強(qiáng)烈的抑制作用，這同范子耀等的結(jié)果一致?？┚鎸ζ渌湼矜邔僬婢鸬牟『?，如煙草赤霉病、早疫病、多種作物黑斑病是否有效果，尚需進(jìn)一步研究。

牡丹葉部病害較為復(fù)雜，7、8月份的牡丹園除了多發(fā)性的葉霉病、黑斑病外，腔孢葉斑病、黃斑病也時(shí)有發(fā)生，且往往是多種病害同時(shí)發(fā)生，牡丹葉片上可同時(shí)見到多種病害，使用一種藥劑很難同時(shí)對當(dāng)前多種牡丹病害均有防治效果，故有必要篩選同時(shí)對多種牡丹病原真菌有抑制活性的殺菌劑或復(fù)配組合[11]。三唑類藥劑對牡丹病原真菌菌絲生長的抑制作用較強(qiáng)，而甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對病菌的孢子萌發(fā)有強(qiáng)烈的抑制作用[7-9,12]。而由本試驗(yàn)可以看出，咯菌腈對供試的4種病原真菌的孢子萌發(fā)及芽管伸長均有強(qiáng)烈的抑制活性?？┚媾c苯醚甲環(huán)唑以5﹕1復(fù)配對馬鈴薯早疫病菌的增效比可達(dá)到2.02，田間防效可達(dá)85%以上，增產(chǎn)率40%以上[29]。這為生產(chǎn)中通過將三唑類殺菌劑與咯菌腈或甲氧基丙烯酸酯類藥劑復(fù)配來達(dá)到同時(shí)防治多種牡丹病害提供了參考。

由于牡丹是園林植物，栽培管理較為精細(xì)，生產(chǎn)中對牡丹病害的防治應(yīng)注重多種方法的綜合應(yīng)用。牡丹是耐蔭植物，遮陽棚的搭建對保持牡丹長勢及病蟲害防治都有一定的促進(jìn)作用。田間遮光30%條件下，牡丹葉片內(nèi)總酚、類黃酮、谷胱甘肽的含量顯著高于未遮光及其他遮光處理[30]。牡丹園調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，遮陽棚或樹蔭下的牡丹，不但花期延長，且其7、8月份病害發(fā)生的嚴(yán)重度明顯比在陽光下暴曬的??；12月份調(diào)查時(shí)，遮陽棚或樹蔭下的牡丹仍能看到綠色的葉片，但陽光下暴曬的牡丹葉片，則全部落葉；此外，秋季清除病枝落葉對牡丹病害的發(fā)生也有一定程度的緩解作用（未發(fā)表資料）。但在病害暴發(fā)流行時(shí)，化學(xué)防治是必要甚至是唯一可依賴的手段。本研究結(jié)果表明，咯菌腈對4種牡丹病原真菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)及芽管伸長均有很強(qiáng)的抑制活性，可以單劑或復(fù)配劑應(yīng)用于牡丹病害的綜合防治中。

4 結(jié)論

咯菌腈對牡丹黑斑及腔孢葉斑病菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)及芽管伸長均有很強(qiáng)的抑制作用，但對腔孢葉斑產(chǎn)孢卻有一定的促進(jìn)作用；對葉霉和黃斑病菌孢子萌發(fā)及芽管伸長、黃斑病菌菌絲生長及葉霉病菌產(chǎn)孢的抑制作用強(qiáng)烈；由于咯菌腈內(nèi)吸活性較弱，無法抑制已侵入牡丹葉片的病原真菌的生長，故建議作為保護(hù)劑在病害發(fā)生前施用。

[1] 黃興琳, 陸俊杏, 廖冰楠, 白輝揚(yáng), 管麗, 張濤. 油用牡丹脂肪酸脫氫酶基因的克隆與表達(dá)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(10): 1914-1921.

Huang X L, Lu J X, Liao B N, Bai H Y, Guan L, Zhang T. Cloning and expression analysis of fatty acid desaturase genefrom oil peony., 2017, 50(10): 1914-1921. (in Chinese)

[2] 藍(lán)保卿, 李嘉鈺, 段全緒. 中國牡丹全書（上）. 北京: 中國科學(xué)技術(shù)出版社, 2002: 269-277.

Lan B Q, Li J Y, Duan Q X.. Beijing: China Science and Technology Press, 2002: 269-277. (in Chinese)

[3] 趙新蘭, 李寧, 劉愛新, 劉會(huì)香. 牡丹腔孢葉斑病及其病原物的共無性型. 菌物學(xué)報(bào), 2010, 29(4): 475-480.

Zhao X L, Li N, Liu A X, Liu H X. The causal agent of coelomycete leaf spot ofand its synanamorphs., 2010, 29(4): 475-480. (in Chinese)

[4] 王守正. 河南省經(jīng)濟(jì)植物病害志. 鄭州: 河南科學(xué)技術(shù)出版社, 1994: 323-328.

Wang S Z.. Zhengzhou: Henan Science and Technology Press, 1994: 323-328. (in Chinese)

[5] 張運(yùn)興, 李衛(wèi)國. 我國牡丹研究核心期刊載文分析. 北方園藝, 2014(19): 213-215.

Zhang Y X, Li W G. Bibliometric analysis onAndr. research literatures published in core journals in China., 2014(19): 213-215. (in Chinese)

[6] 吳玉柱, 季延平, 劉慇, 趙桂華, 牛迎福, 王海明, 趙海軍. 牡丹紅斑病的研究. 林業(yè)科學(xué)研究, 2005, 18(6): 711-716.

Wu Y Z, Ji Y P, Liu Y, Zhao G H, Niu Y F, Wang H M, Zhao H J. Study on red disease of peony tree., 2005, 18(6): 711-716. (in Chinese)

[7] 徐建強(qiáng), 楊改鳳, 田娟, 車志平, 康業(yè)斌. 三種殺菌劑對牡丹紅斑病病菌分生孢子形成和萌發(fā)的影響. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2016, 43(5): 850-857.

Xu J Q, Yang G F, Tian J, Che Z P, Kang Y B. Effects of carbendazim, tebuconazole and azoxystrobin on sporulation and conidial germination ofcausing tree peony red spot., 2016, 43(5): 850-857. (in Chinese)

[8] 侯穎, 徐建強(qiáng), 宋宇州, 胡建功, 都勝芳, 康業(yè)斌. 三種殺菌劑對牡丹黑斑病菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2014, 41(3): 367-372.

HOU Y, XU J Q, SONG Y Z, HU J G, DU S F, KANG Y B. Effects of carbendazim, difenoconazole and azoxystrobin on mycelial growth and conidial germination of., 2014, 41(3): 367-372. (in Chinese)

[9] 徐建強(qiáng), 楊改鳳, 田娟, 胡建功, 李慧凱, 林曉民. 7種殺菌劑對牡丹黃斑病菌生長和發(fā)育的影響. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 50(2): 229-234.

Xu J Q, Yang G F, Tian J, Hu J G, Li H K, Lin X M. Effects of seven fungicides on growth and development ofcausing yellow leaf spot of., 2016, 50(2): 229-234. (in Chinese)

[10] 賀春玲, 侯小改, 何童童, 王禎, 關(guān)云霄, 劉改秀. 12種殺菌劑對牡丹黃斑病的室內(nèi)毒力測定. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2015, 31(19): 122-125.

He C L, Hou X G, He T T, Wang Z, Guan Y X, Liu G X. Toxicity measurement of 12 fungicides onfrom peony., 2015, 31(19): 122-125. (in Chinese)

[11] 徐建強(qiáng), 楊改鳳, 田娟, 康業(yè)斌. 牡丹柱枝孢葉斑病化學(xué)防治藥劑篩選的研究. 北方園藝, 2015(15): 114-117.

Xu J Q, Yang G F, Tian J, Kang Y B. Effect of eight fungicides on mycelial ofcausing peony leaf spot., 2015(15): 114-117. (in Chinese)

[12] 徐建強(qiáng), 楊改鳳, 田娟, 刁興旺. 三類殺菌劑對牡丹腔孢葉斑病菌生長和發(fā)育的影響. 植物保護(hù), 2016, 42(5): 86-91.

Xu J Q, Yang G F, Tian J, Diao X W. Effects of fungicide on growth and development ofcausing coelomycete leaf spot of., 2016, 42(5): 86-91. (in Chinese)

[13] Avenot H F, Michailides T J. Detection of isolates ofwith multiple-resistance to fludioxonil, cyprodinil, boscalid and pyraclostrobin in California pistachio orchards., 2015, 78: 214-221.

[14] Han X, Zhao H, Ren W C, Lv C Y, Chen C J. Resistance risk assessment for fludioxonil in., 2017, 139: 32-39.

[15] Zhao H, Kim Y K, Huang L, Xiao C L. Resistance to thiabendazole and baseline sensitivity to fludioxonil and pyrimethanil inpopulations from apple and pear in Washington State., 2010, 56: 12-18.

[16] Kuang J, Hou Y P, Wang J X, Zhou M G. Sensitivity ofto fludioxonil:determination of baseline sensitivity and resistance risk., 2011, 30: 876-882.

[17] Hamada M S, Yin Y N, Ma Z H. Sensitivity to iprodione, difenoconazole and fludioxonil ofisolates collected from wheat in China., 2011, 30: 1028-1033.

[18] Duan Y B, Ge C Y, Liu S M, Chen C J, Zhou M G. Effect of phenylpyrrole fungicide fludioxonil on morphological and physiological characteristics of., 2013, 106: 61-67.

[19] Errampalli D. Effect of fludioxonil on germination and growth ofand decay in apple cvs. Empire and Gala., 2004, 23: 811-817.

[20] Furukawa K, Randhawa A, Kaur H, Mondal A K, Hohmann S. Fungal fludioxonil sensitivity is diminished by a constitutively active form of the group III histidine kinase., 2012, 586: 2417-2422.

[21] Duan Y B, Ge C Y, Liu S M, Wang J X, Zhou M G. A two-component histidine kinasecontrols stress response, sclerotial formation and fungicide resistance in., 2013, 14(7): 708-718.

[22] 吳學(xué)宏, 李飛武, 張文華, 劉鵬飛, 鄭樂, 劉西莉. 咯菌睛對西瓜幼苗生長及抗病性相關(guān)酶活性的影響. 植物病理學(xué)報(bào), 2004, 34(6): 531-535.

Wu X H, Li F W, Zhang W H, Liu P F, Zheng L, Liu X L. Effects of fludioxonil on growth of watermelon seedlings and activity of disease resistance-related enzyme., 2004, 34(6): 531-535. (in Chinese)

[23] 慕立義. 植物化學(xué)保護(hù)研究方法. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1994: 76-82.

Mu L Y.. Beijing: China Agriculture Press, 1994: 76-82. (in Chinese)

[24] 陳雨, 張文芝, 周明國. 氰烯菌酯對禾谷鐮孢菌分生孢子萌發(fā)及菌絲生長的影響. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 9(3): 235-239.

Chen Y, Zhang W Z, Zhou M G. Effects of JS399-19 on conidial germination and mycelial growth of., 2007, 9(3): 235-239. (in Chinese)

[25] 康業(yè)斌, 商鴻生, 成玉梅. 丹皮酚對植物病原真菌的體外抑制作用. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2007, 34(6): 580-584.

Kang Y B, Shang H S, Cheng Y M. Inhibition activities of paeonol to plant pathogenic fungi., 2007, 34(6): 580-584. (in Chinese)

[26] 吳玉柱, 季延平, 劉慇, 牛迎福, 王海明, 趙海軍. 牡丹紅斑病發(fā)病規(guī)律的觀察. 中國森林病蟲, 2004, 23(5): 6-10.

Wu Y Z, Ji Y P, Liu Y, Niu Y F, Wang H M, Zhao H J. Occurrence regularity of tree peony red spot., 2004, 23(5): 6-10. (in Chinese)

[27] 楊德翠, 劉超, 蓋樹鵬, 鄭國生, 郭平毅. 牡丹柱枝孢葉斑病 ()對葉片光合系統(tǒng)功能的影響. 園藝學(xué)報(bào), 2013, 40(3): 515-522.

Yang D C, Liu C, Gai S P, Zheng G S, Guo P Y. Effect of infection byon behaviors of photosystems in tree peony leaves., 2013, 40(3): 515-522. (in Chinese)

[28] 范子耀, 孟潤杰, 韓秀英, 馬志強(qiáng), 王文橋, 劉穎超. 馬鈴薯早疫病菌對咯菌腈的敏感基線及其對不同藥劑的交互抗性. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2012, 39(2): 153-158.

Fan Z Y, Meng R J, Han X Y, Ma Z Q, Wang W Q, Liu Y C. Sensitivity baseline of, causal agent of potato early blight, to fludioxonil and cross-resistance to different fungicides., 2012, 39(2): 153-158. (in Chinese)

[29] 范子耀, 孟潤杰, 馬志強(qiáng), 韓秀英, 張小風(fēng), 王文橋, 劉穎超. 咯菌腈與苯醚甲環(huán)唑等三種藥劑復(fù)配對馬鈴薯早疫病菌 ()的聯(lián)合毒力. 植物保護(hù), 2012, 38(5): 184-188.

Fan Z Y, Meng R J, Ma Z Q, Han X Y, Zhang X F, Wang W Q, Liu Y C. Joint-toxicity of the mixtures of fludioxonil with coumoxystrobin, pyraclostrobin or difenoconazole against., 2012, 38(5): 184-188. (in Chinese)

[30] 周曙光, 孔祥生, 張妙霞, 王麗亞, 王福云, 周桂勤. 遮光對牡丹光合及其他生理生化特性的影響. 林業(yè)科學(xué), 2010, 46(2): 56-60.

Zhou S G, Kong X S, Zhang M X, Wang L Y, Wang F Y, Zhou G Q. Effects of shading on photosynthesis, and other physiological and biochemical characteristics in tree peony., 2010, 46(2): 56-60. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 岳梅）

Inhibitory Activity of Fludioxonil to Four Pathogenic Fungi of Peony Leaves

XU Jianqiang, PING Zhongliang, LIU Ying, Ma Shichuang, Xu Daochao, Yang Lan, ZHENG Wei, LIU Shengming, Xia Yanfei, Lin Xiaomin

(College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan)

The objective of this study is to make clear the activity of fludioxonil on mycelial growth, conidia germination, germ tube elongation and sporulation of four peony foliar pathogenic fungi, including,,and, and to analyze whether fludioxonil could be used in the chemical control of peony disease.The inhibitory activity of fludioxonil against mycelial growth was measured through a mycelial linear growth test and the efficacy of fludioxonil on conidial germination, germ tube elongation and sporulation was determined on the PSA or KDA amended with fludioxonil at various concentrations.Fludioxonil had a strongest inhibition on mycelial growth ofwith the EC50of 0.01 μg·mL-1, followed by 0.07 μg·mL-1ofand 0.35 μg·mL-1of. Fludioxonil could strongly inhibit the conidia germination of four peony pathogenic fungi and the inhibitory activity onwas the strongest, with the EC50of1.26 μg·mL-1. The EC50to other three fungi ranged from 3.27 to 3.45 μg·mL-1. Fludioxonil could also strongly inhibit the germ tube elongation of four fungi, and the suppression ratio of 0.1 μg·mL-1fludioxonil reached 40% to 70%. The germ tube ofwas the most sensitive to fludioxonil, and the EC50was 0.04 μg·mL-1. The EC50of fludioxonil to other three fungi’s germ tube elongation varied from 0.08 to 0.22 μg·mL-1. Fludioxonil could cause the abnormality of conidia and the germ tube of.and., including expanding of spore and germ tube and excessively branching of germ tube. However, the effect of fludioxonil on that of.and.was unconspicuous. Fludioxonil could delay sporulation of.,.and.. The EC50of.sporulation was 0.05 μg·mL-1, followed by the 0.38 μg·mL-1of., whereas fludioxonil could promote the sporulation of..Fludioxonil had a strong inhibitory activity on the mycelial growth, conidia germination and germ tube elongation of.and., but could promote the sporulation of.. Fludioxonil could also inhibit powerfully conidia germination and germ tube elongation of.and., mycelial growth of.and sporulation of..Fludioxonilshould be used preferentially as a curative fungicide to avoid the pathogenic fungi infection, as it could not be absorbed by the plant tissue and inhibit the fungi that had penetrated and parasitized the plant.

fludioxonil; peony pathogenic fungi; mycelial growth; conidia germination; sporulation; germ tube elongation

2017-04-21；接受日期：2017-06-23

國家自然科學(xué)基金（31401774）

徐建強(qiáng)，Tel：0379-64282345；E-mail：xujqhust@126.com