番紅花種球中虎眼萬年青花葉病毒的分子鑒定與序列分析

廖富榮，林武鎮(zhèn), 2，陳細(xì)紅,，陳青，陳紅運(yùn)，黃蓬英，方志鵬，吳媛，沈建國，林石明

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番紅花種球中虎眼萬年青花葉病毒的分子鑒定與序列分析

廖富榮1，林武鎮(zhèn)1, 2，陳細(xì)紅1,3，陳青1，陳紅運(yùn)1，黃蓬英1，方志鵬1，吳媛1，沈建國3，林石明1

（1廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建廈門361026；2生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350002；3福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福州350003）

對一批荷蘭進(jìn)境番紅花種球（）進(jìn)行病毒鑒定，以防止危險(xiǎn)性病毒傳入危害。根據(jù)已報(bào)道的馬鈴薯Y病毒科（）通用引物(Sprimer和M4T)，采用RT-PCR方法對一批番紅花種球樣品進(jìn)行檢測，取其中一個(gè)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，利用GenBank上的基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）和MEGA 6中的基于對數(shù)期望的多重序列比較（Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation，MUSCLE）進(jìn)行序列比對分析，并根據(jù)外殼蛋白基因（coat protein，）序列利用最大似然法（maximum likelihood method）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。RT-PCR檢測結(jié)果顯示該批樣品擴(kuò)增到一條約1.7 kb的預(yù)期大小片段，說明該批番紅花種球樣品中存在科病毒。測序獲得長度為1 666 bp的序列（命名為2677-NL），含有部分核內(nèi)含體b基因（nuclear inclusion b，）、完整的和3′端非編碼區(qū)（3′-UTR），其核苷酸序列與虎眼萬年青花葉病毒（，OrMV）的SW3.3分離物具有最高序列一致性（99.6%），與OrMV參考基因組序列（Reference genomic sequences，RefSeq；NC_019409）的序列一致性為99.1%。該分離物的與6個(gè)OrMV印度分離物（JQ686722、JQ686720、JN692498、JN692497、JN692496、JF682235）的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為71.5%—77.3%和65.7%—79.7%，與其他32個(gè)OrMV分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為77.9%—99.5%和82.9%—99.2%?；谶M(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，OrMV可分為兩個(gè)類群，而2677-NL與5個(gè)澳大利亞分離物（JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965）相聚成簇，表明其在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上與OrMV澳大利亞分離物的親緣關(guān)系最近。根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)（ICTV）關(guān)于科病毒種類的分類標(biāo)準(zhǔn)，2677-NL為OrMV的一個(gè)分離物，證實(shí)該批番紅花種球受到OrMV的侵染。這是世界上首次在番紅花中發(fā)現(xiàn)OrMV的報(bào)道。

虎眼萬年青花葉病毒；番紅花；RT-PCR；新寄主

0 引言

【研究意義】番紅花（）又名藏紅花、西紅花，為鳶尾科（Iridaceae）番紅花屬（）多年生球莖草本植物，是一種名貴藥材和香料[1]。在番紅花的種植過程中，易受到各種病蟲的危害，包括各種植物病毒[2]。對于番紅花這種以無性繁殖為主的植物來說，一方面，植物病毒可以通過繁殖體從上一生長季傳播到下一生長季，成為重要的初侵染源；另一方面，通過農(nóng)事操作、介體傳播等方式，植物病毒可以從發(fā)病植株傳播給健康植株。因此，一旦用于繁殖的番紅花攜帶植物病毒，即使帶毒率非常小，經(jīng)過多年的繁殖栽培，也能夠造成植物病毒在番紅花植株中普遍存在，且容易造成多種病毒種類復(fù)合侵染現(xiàn)象，導(dǎo)致種球變小、品種退化，嚴(yán)重影響番紅花的產(chǎn)量和質(zhì)量。近年來，隨著中國從國外引進(jìn)優(yōu)良的番紅花品種越來越頻繁，各種有害生物傳入境內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)也越來越高。因此，加強(qiáng)口岸檢疫，可以有效防止各種有害生物的入侵危害?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已報(bào)道的侵染番紅花的病毒至少有10種，分屬于7個(gè)病毒屬，包括馬鈴薯Y病毒屬（）的菜豆黃花葉病毒（，BYMV）、鳶尾重型花葉病毒（，ISMV）、鳶尾輕型花葉病毒（，IMMV）和蕪菁花葉病毒（，TuMV）；馬鈴薯X病毒屬（）的水仙花葉病毒（，NMV）；線蟲傳多面體病毒屬（）的南芥菜花葉病毒（，ArMV）；煙草脆裂病毒屬（）的煙草脆裂病毒（，TRV）；黃瓜花葉病毒屬（）的黃瓜花葉病毒（，CMV）；壞死病毒屬（）的煙草壞死病毒（，TNV）；番茄斑萎病毒屬（）的番茄斑萎病毒（，TSWV）[3-8]。其中，ArMV和TSWV是中國嚴(yán)格禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物。在中國番紅花中已報(bào)道的病毒種類有3種，即BYMV[9]、IMMV[10]和TuMV[11]，均屬屬病毒。電子顯微鏡觀察病毒粒體形態(tài)、細(xì)胞病理學(xué)觀察、鑒別寄主鑒定、DAS-ELISA檢測、RT-PCR檢測及序列測定分析是檢測鑒定番紅花病毒的主要方法[4-11]?；⒀廴f年青花葉病毒（，OrMV）又稱天鵝絨嵌紋病毒、翅柱蘭Y病毒（Pterostylis virus Y，PtVY），屬于馬鈴薯Y病毒科（）、屬的成員[12-13]。病毒粒體線狀，長720—760 nm，寬12 nm[14]?？赏ㄟ^蚜蟲非持久性傳播[14]、汁液傳播[15]。其基因組為一條正ssRNA，長9 442、9 445或9 475 nts，含有一個(gè)大的開放閱讀框，編碼一個(gè)341.5 kD的聚合蛋白，具有典型的屬病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征[16-17]。OrMV最早在美國報(bào)道，目前在荷蘭[18]、南非[14]、法國的留尼汪島[19]、以色列[20]、印度[21-22]、韓國[23]、日本[15,24]、新西蘭[25]和澳大利亞[16,26]等地均有報(bào)道發(fā)生。在中國臺灣地區(qū)曾在進(jìn)境的虎眼萬年青中檢出該病毒[27]，而在中國大陸地區(qū)則在英國等地引進(jìn)種植的圍裙水仙和喇叭水仙上發(fā)現(xiàn)該病毒[28]。自然情況下，OrMV可侵染鳶尾科（Iridaceae）的唐菖蒲屬（）[22]、雄黃蘭屬（）（KF493898）、鳶尾屬（）[14,21]；百合科（Lillaceae）的虎眼萬年青屬（）[14,24,29]；蘭科（Orchidaceae）的香莢蘭屬（）[19]、雙尾蘭屬（）[16]、絨唇蘭屬（）[26]、翅柱蘭屬（）[26]、鎧蘭屬（）[26]、鳥蘭屬（）[26]；天門冬科（Asparagaceae）的非洲蓮香屬（）[14,29]、石蒜科（Amaryllidaceae）的水仙屬（）[28,30]、六出花科（Alstroemeriaceae）的六出花屬（）[18]等植物。【本研究切入點(diǎn)】基于PCR技術(shù)的分子檢測方法，已越來越多應(yīng)用于口岸植物病毒的快速檢測鑒定中。其中，根據(jù)基因組序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物所建立的病毒屬或病毒科的通用PCR或RT-PCR方法，是快速篩查檢測同一類病毒的一種高效、靈敏的檢測方法，結(jié)合序列分析可在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)同一類病毒（如某個(gè)病毒屬）種類的檢測與鑒定[31-33]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用科通用RT-PCR方法[34]對一批旅客攜帶的番紅花種球進(jìn)行檢測，以證實(shí)該批番紅花種球攜帶OrMV，防止該病毒入境危害。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年在廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心植物檢疫實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 番紅花種球

一袋番紅花種球，共計(jì)25粒，從來自香港航班的旅客行李中截獲，包裝袋上顯示來自荷蘭（Aviflora Trading B.V.）。

1.2 樣品制備及核酸提取

混合樣品：把種球分為兩組（12粒、13粒），每粒球莖切取約0.05 g的薄片，用植物汁液提取儀（MEKU Erich Poll?hne Gmbh）研磨，然后用3.0 mL樣品提取緩沖液沖洗收集。經(jīng)8 000 r/min離心后，取250 μL的上清液，根據(jù)操作說明用TRIzol方法（Invitrogen公司）提取總RNA。

單粒種球：切取約0.1 g的球莖薄片，用研缽研磨后用TRIzol方法提取總RNA。

1.3 RT-PCR檢測

取4 μL的總RNA和2 μL Oligo(dT)18引物（10 μmol·L-1），于65℃水浴中處理10 min，然后迅速冰浴5 min。繼續(xù)加入5×M-MLV buffer 4 μL、dNTP Mixture（10 mmol·L-1；寶生物工程（大連）有限公司）1 μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μL-1；Promega公司）1 μL、RNase inhibitor（40 U·μL-1；寶生物工程（大連）有限公司）1.0 μL，無菌水補(bǔ)足至20 μL。37℃水浴處理1 h，70℃水浴10 min，冰上冷卻，即得到作為PCR模板的cDNA。

采用科通用引物Sprimer：（5′-GGNAAYAAYAGYGGNCARCC-3′，N=A，T，G，C；Y=T，C；R=A，G）和M4T（5′-GTTTTCCCAGTC ACGAC(T)15-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[34]。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×EasyTaq Buffer（plus Mg2+）5 μL，引物Sprimer和M4T各2 μL（10 μmol·L-1），cDNA模板6 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）4 μL，EasyDNA聚合酶0.5 μL（5 U·μL-1；北京全式金生物技術(shù)有限公司），雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，47℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，結(jié)束后4℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后在凝膠成像儀上觀察、拍照。

1.4 序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，進(jìn)行克隆測序，由寶生物工程（大連）有限公司完成。序列拼接后，用基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）、MEGA等軟件進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析。其中，用MEGA 6中的最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[35]，自舉檢驗(yàn)（bootstrap）1 000次，并以石蒜花葉病毒（，ValMV，EF114726）為外群；用BLAST和基于對數(shù)期望的多重序列比較（Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation，MUSCLE）進(jìn)行序列比對分析。用于比較分析的虎眼萬年青花葉病毒（OrMV）其他分離物序列下載自GenBank，其寄主、國家或地區(qū)等信息見表1。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增

利用科的通用RT-PCR方法，在兩組混合樣品中均擴(kuò)增到約1.7 kb的條帶，且未見其他條帶產(chǎn)生（圖1-A）。對其中14粒種球進(jìn)行單獨(dú)檢測，結(jié)果顯示14個(gè)種球樣品中8個(gè)種球樣品明顯擴(kuò)增到約1.7 kb的預(yù)期條帶，5號、11號樣品也出現(xiàn)預(yù)期大小條帶，但條帶比較弱（圖1-B）。該結(jié)果初步表明，該批番紅花種球攜帶有科病毒，且種球帶毒率在57 %以上。

表1 2677-NL分離物與其他虎眼萬年青花葉病毒分離物的外殼蛋白基因核苷酸（nt）和氨基酸（aa）序列一致性

M：TaKaRa DL2000 DNA Marker；H1、H2：混合種球樣品mixed corm sample；1—14：單粒種球樣品single corm sample；15：空白對照Blank control

2.2 序列測定與分析

隨機(jī)取其中一個(gè)混合樣品的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，共測定1 666 nts的序列（不包括22 nts的A尾），GenBank登錄號為KJ194467，命名為2677-NL。該分離物與OrMV SW3.3分離物（JQ807996）的序列一致性最高，為99.6%；與NCBI中OrMV參考基因組序列（Reference genomic sequences，RefSeq；NC_019409）的序列一致性為99.1%。序列分析顯示，該序列含有部分聚合蛋白（polyprotein）基因和3′-端非編碼區(qū)（3′-UTR）。其中，1—636 nts為部分核內(nèi)含體b基因（nuclear inclusion b，）的3′端序列，637—1 395 nts為完整的外殼蛋白基因（coat protein，）序列。

基因序列分析顯示，2677-NL與其他OrMV分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為71.5%— 99.5%和65.7%—99.2%（表1）。其中，2677-NL的核苷酸序列與Glad-4（JN692496）、Glad-6（JQ686720）、Glad-8（JQ686722）和Glad-7（JN692498）4個(gè)分離物的序列一致性＜76%；與Glad-4（JN692496）、Glad-6（JQ686720）、Glad-7（JN692498）、Glad-8（JQ686722）、Glad-9（JN692497）和Lucknow（JF682235）6個(gè)分離物的氨基酸序列一致性＜80%。2677-NL與其他32個(gè)OrMV分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為77.9%—99.5%和82.9%—99.2%，分別＞76%和80%。國際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）關(guān)于科病毒種類區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)之一是：的核苷酸和氨基酸序列一致性分別＜76%和80%。因此，根據(jù)ICTV分類標(biāo)準(zhǔn)，2677-NL屬于OrMV的一個(gè)分離物。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，來自不同地區(qū)、不同寄主的OrMV分離物主要分歸為2個(gè)大類群（I和II）。雖然這2個(gè)類群并沒有完全根據(jù)寄主或地域進(jìn)行分類群（如澳大利亞分離物的其中2個(gè)分離物和另外5個(gè)分離物在分屬于2個(gè)不同的大類群中），但在小分支中，還是具有一定的寄主和地域相關(guān)性。如來自澳大利亞的5個(gè)分離物（JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965）處于同一個(gè)小分支中，與地域相關(guān)；而來自日本的2個(gè)分離物（AB079648、AB079649）和來自美國的2個(gè)分離物（FJ159374、FJ159375）也處于同一小分支中，寄主均為虎眼萬年青屬，與寄主相關(guān)；來自印度的7個(gè)分離物（JQ686720、JQ686722、JQ686723、JF682235、JN692496、JN692497和JN692498）也處于同一個(gè)小分支中，與寄主和地域相關(guān)。本研究的2677-NL分離物屬于I群中，與來自荷蘭的Crocosmia分離物（KF493898）處于不同類群中，與其中5個(gè)澳大利亞分離物（JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965）處于同一分支，顯示出最近的親緣關(guān)系（圖2）。這5個(gè)澳大利亞分離物寄主并不相同，有侵染雙尾蘭屬的SW3.1（JQ807995）、SW3.3（JQ807996）、KP（NC_019409）分離物，侵染白兔蘭的Eriochilus分離物（AF185965），侵染翅柱蘭的Pterostylis分離物（AF185964），但均屬蘭科。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)2677-NL屬于OrMV的一個(gè)分離物。

*為本研究的2677-NL分離物；▲NCBI中OrMV的參考基因組序列。節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值為1 000次檢驗(yàn)后的自舉檢驗(yàn)值（≥50） * was the 2677-NL isolate used in this study. ▲ wasNCBI reference genomic sequence of OrMV. The numbers on nodes indicated bootstrap values (≥50) after 1 000 replicates

3 討論

ICTV第9次分類報(bào)告關(guān)于科病毒種類區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)之一為CP蛋白序列一致性約＜80%；或整個(gè)基因組的核苷酸序列一致性＜76%[12,36]。本研究所測定的2677-NL部分3′末端序列與OrMV分離物最高序列一致性達(dá)99.6%，與OrMV的RefSeq（NC_019409）的序列一致性為99.1%，其與其中32個(gè)分離物（包括OrMV的RefSeq）的核苷酸和氨基酸序列一致性分別＞76%和80%。因此，根據(jù)ICTV分類標(biāo)準(zhǔn)，2677-NL分離物應(yīng)屬于OrMV的一個(gè)分離物。這是首次在番紅花中發(fā)現(xiàn)OrMV的報(bào)道，是侵染番紅花的又一種屬病毒。

在已知的OrMV分離物中，2677-NL與其中4個(gè)分離物的核苷酸序列一致性＜77%，與6個(gè)分離物的氨基酸序列一致性＜80%。其中，2677-NL與Lucknow分離物（JF682235）[21]的核苷酸序列一致性＞76%（77.3%），但氨基酸序列一致性略＜80%（79.7%），根據(jù)ICTV分類標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)為同一病毒的不同分離物。2677-NL與Glad-9（JN692497）分離物的核苷酸序列一致性＞76%但氨基酸序列明顯＜80%（77.7%），與Glad-4（JN692496）、Glad-6（JQ686720）、Glad-7（JN692498）、Glad-8（JQ686722）分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性分別＜76%和80%，無法通過基因序列確定為同一病毒種類。ICTV第10次分類報(bào)告中，除了明確作為科病毒種類區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)外，還確定了整個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）以及各個(gè)編碼區(qū)作為種類區(qū)分的標(biāo)準(zhǔn)[37]。因此，對于這些分離物，應(yīng)該進(jìn)一步比較分析整個(gè)ORF或不同的編碼區(qū)序列，以確認(rèn)這些分離物是否為同一病毒種類。

BYMV、ISMV、IMMV和TuMV是番紅花中比較常見的病毒種類，均屬于屬，中國的番紅花已報(bào)道除ISMV外的其他3種病毒[9-11]。在本研究中，利用基于簡并引物的通用檢測方法并結(jié)合序列分析，發(fā)現(xiàn)的病毒并不是在番紅花中已報(bào)道的4種屬病毒，而是一種在番紅花中還沒有報(bào)道的OrMV。因此，利用通用RT-PCR檢測方法不僅可以用來快速檢測已報(bào)道的番紅花病毒，而且還可以用來快速檢測未報(bào)道的同一病毒屬的其他病毒。該類方法通常只要一對引物、一次RT-PCR就可以檢測不同種類的病毒，是特異性RT-PCR方法不能夠?qū)崿F(xiàn)的，是該類檢測方法的一大優(yōu)勢。該類方法不僅可以減輕實(shí)驗(yàn)操作強(qiáng)度、縮短檢測周期，而且可以快速檢測鑒定寄主中未報(bào)道的病毒種類、甚至新的病毒種類。

另一方面，基于簡并引物的通用RT-PCR方法，可以快速得知一個(gè)樣品中是否受到多種病毒的復(fù)合侵染。在本試驗(yàn)中，如果不僅有OrMV，而且還有BYMV、IMMV、ISMV、TuMV中的一種或多種病毒的復(fù)合侵染，當(dāng)PCR產(chǎn)物直接測序時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)疊峰、套峰現(xiàn)象。然后進(jìn)一步把PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，并挑取多個(gè)克隆子進(jìn)行測序，就可以得到不同種類的病毒序列。因此，利用通用RT-PCR方法檢測時(shí)，可以利用PCR產(chǎn)物直接測序以快速辨別是否為單一侵染或多種病毒的復(fù)合侵染。因此，進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆測序時(shí)，建議至少單獨(dú)測5個(gè)或以上的克隆子，以辨別是否有多種病毒的復(fù)合侵染。

本研究所使用的科病毒通用RT-PCR檢測方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于該科病毒的檢測。在原文獻(xiàn)中，先使用M4T引物作為反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的起始引物，而后用Sprimer和M4引物作為PCR擴(kuò)增引物[34]。在本研究中，反轉(zhuǎn)錄時(shí)使用Oligo(dT)18引物代替M4T引物，而PCR時(shí)用M4T引物代替M4引物。Oligo(dT)18引物是反轉(zhuǎn)錄時(shí)常用的起始引物，在各實(shí)驗(yàn)室或反轉(zhuǎn)錄試劑盒中基本都有配置。因此，在科病毒通用RT-PCR檢測中，省去M4引物，操作更為便捷。

本研究測定了2677-NL分離物的基因組3′端部分序列，含有部分、完整的和3′-UTR序列，與OrMV的SW3.3分離物具有最高的序列一致性（99.6%）。根據(jù)進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明，在2個(gè)大類群中，沒有明顯的地域、寄主相關(guān)性，但在各小分支中，具有一定的寄主、地域相關(guān)性。從包裝信息來看，本次截獲的番紅花種球來自荷蘭。2677-NL分離物與來自荷蘭的Crocosmia分離物（KF493898）分屬于2個(gè)類群中，顯示出比較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。這可能是由于當(dāng)前的種子苗木貿(mào)易非常頻繁，OrMV隨著種子苗木的貿(mào)易在世界范圍內(nèi)快速擴(kuò)散傳播。

侵染番紅花的病毒，不僅有常見的BYMV、CMV、NMV等病毒，而且還有中國嚴(yán)格禁止進(jìn)境的檢疫性病毒ArMV和TSWV[3-8]。在此之前中國口岸部門在進(jìn)境的番紅花種球中還未發(fā)現(xiàn)植物病毒，該批番紅花種球中發(fā)現(xiàn)OrMV，是口岸部門首次在進(jìn)境番紅花種球中發(fā)現(xiàn)植物病毒。因此，口岸檢驗(yàn)檢疫部門不僅應(yīng)該加強(qiáng)郵寄的包裹、旅客隨身攜帶的行李檢疫，而且應(yīng)該加強(qiáng)對大規(guī)模引進(jìn)種植的番紅花種球的病毒檢疫，以防止各種檢疫性病毒的傳入危害。此外，OrMV不僅寄主范圍比較廣泛，而且地理分布也越來越廣[18-30]。應(yīng)該進(jìn)一步對OrMV進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析、危害等方面的研究，并采取相應(yīng)檢疫措施，以避免該病毒對中國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境生態(tài)產(chǎn)生新的威脅。

4 結(jié)論

根據(jù)ICTV分類標(biāo)準(zhǔn)，2677-NL屬于OrMV的一個(gè)分離物。該批來自荷蘭的番紅花種球攜帶有OrMV，這是OrMV首次侵染番紅花的報(bào)道，是番紅花上發(fā)現(xiàn)的又一種屬病毒。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Molecular identification and sequence analysis ofin saffron () corms

LIAO FuRong1, LIN WuZhen1,2, CHEN XiHong1,3, CHEN Qing1, CHEN HongYun1, HUANG PengYing1, FANG ZhiPeng1, WU Yuan1, SHEN JianGuo3, LIN ShiMing1

(1Inspection and Quarantine Technology Center, Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361026, Fujian;2Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, Fuzhou 350002;3Inspection and Quarantine Technology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350003)

The objective of this study is to identify viruses in saffron () corms imported from the Netherlands and to prevent the entry of dangerous virus into China.Using theuniversal primers (Sprimer and M4T), the saffron corms samples were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. After cloning and sequencing of the RT-PCR products, the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) and Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation (MUSCLE) methods were used for multiple sequence alignment. The maximum likelihood method was used to construct the phylogenetic tree according to the coat protein () nucleotide sequences.The about 1.7 kb RT-PCR products were amplified from the samples, indicating a member ofvirus was present in the samples of saffron corms. A sequence of 1 666 bp segments was obtained from a positive sample (designated 2677-NL) and it contained a portion of nuclear inclusion b gene (), the completeand 3′ untranslated region (3′-UTR). This isolate shared the highest nucleotide sequence identity (99.6%) with the SW3.3 isolate of(OrMV) and shared 99.1% nucleotide sequence identity with the Reference genomic sequences (RefSeq) of OrMV (GenBank accession number: NC_019409). Of those, theof the 2677-NL isolate shared 71.5%-77.3% and 65.7%-79.7% nucleotide and amino acid identities, respectively, with those of six OrMV isolates from India (GenBank accession number: JQ686722, JQ686720, JN692498, JN692497, JN692496 and JF682235) whereas 77.9%-99.5% and 82.9%-99.2%, respectively, with the other 32 OrMV isolates. Phylogenetic analysis based on thegenes showed that the OrMV could be divided into two groups, in which 2677-NL was clustered together with five OrMV isolates from Australia (GenBank accession number: JQ807995, JQ807996, NC_019409, AF185964 and AF185965), suggesting these OrMV were highly homologous in the phylogenetic relationship.According to the species demarcation criteria of the familyon the International Committee on Taxonomy (ICTV), the 2677-NL was an isolate of OrMV, and it showed that the saffron corms sample was infected by OrMV. this is the first report on OrMV infectingin the world.

;; RT-PCR; new host

2017-05-02；接受日期：2017-06-25

福建省自然科學(xué)基金（2015J01148）、國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃（2015IK190）、廈門市科技計(jì)劃（3502Z20154080）

廖富榮，Tel：0592-6806943；E-mail：lfr005@163.com。通信作者林石明，Tel：0592-6803996；E-mail：smlink@163.com