10種淫羊藿屬植物核型分析及其分類學(xué)的意義

王霖嬌 ，田靜 ，盛茂銀 ，3*

（1.貴州師范大學(xué)喀斯特研究院，貴陽 550001；2.國家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心，貴陽 550001；3.貴州省喀斯特石漠化防治與衍生產(chǎn)業(yè)工程實驗室，貴陽 550001）

10種淫羊藿屬植物核型分析及其分類學(xué)的意義

王霖嬌1，2，田靜1，2，盛茂銀1，2，3*

（1.貴州師范大學(xué)喀斯特研究院，貴陽 550001；2.國家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心，貴陽 550001；3.貴州省喀斯特石漠化防治與衍生產(chǎn)業(yè)工程實驗室，貴陽 550001）

【目的】開展10種淫羊藿屬植物核型分析，為該屬植物系統(tǒng)分類和起源進化等領(lǐng)域的深入研究提供細胞學(xué)證據(jù)?！痉椒ā窟\用壓片法對10個淫羊藿屬（Epimedium）植物的根尖有絲分裂進行觀察，并對其核型進行比較研究。【結(jié)果】供試的10種淫羊藿屬植物根尖細胞染色體數(shù)目均為12，都為二倍體，2n=2x=12。10個種的核型基本相似，都為2A對稱核型。第1對同源染色體都具有中間隨體；除E.perralderianum核型公式為2n=2x=8m（2SAT）+4sm外，其他9個種核型公式均為2n=2x=6m（2SAT）+6sm?！窘Y(jié)論】核型分析結(jié)果支持該屬屬下Epimedium和Rhizophyllum 2個亞屬的劃分，也顯示淫羊藿屬植物在小檗科明顯是一個起源上更古老的類群，且與其他屬植物的親緣關(guān)系較遠。核型分析對淫羊藿屬屬下類群系統(tǒng)學(xué)研究意義有限，但對屬上分類級別的系統(tǒng)進化研究具有重要的參考價值。

淫羊藿；核型分析；系統(tǒng)學(xué)；起源；演化

淫羊藿是我國重要的傳統(tǒng)藥用植物，又名仙靈脾、羊合葉，多年生草本植物，在分類上屬于小檗科（Berberidaceae）淫羊藿屬（Epimedium L.）[1]。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》即記載其“主陰痿絕傷、徑中痛、益氣力、強志”等藥用功效[2]。近年來，藥理研究顯示，淫羊藿不僅在免疫、生殖、核酸代謝、心腦血管、抗衰老等方面具有顯著的藥效[3]，同時在腫瘤治療方面也具有明顯的應(yīng)用前景[4]。此外，淫羊藿屬植物具有奇異的花朵、多變的花色、常綠多年生的植株等優(yōu)良園藝特性，在歐美、日本等地是十分受歡迎的園藝植物。近年來，淫羊藿屬植物的研究已成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點。

該屬目前全球已報道約60種[5]，間斷分布于日本至北非的阿爾及利亞之間的廣大區(qū)域，可以分成3個分布區(qū)：①地中海和西亞地區(qū)，分布有4個種；②日本地區(qū)，分布約有5個種；③中國地區(qū)，是該屬目前的分布中心，報道有約50種、5變種[6-7]。該屬種類繁多，且種間差異不明顯，在分類上一直是一個難以處理的類群[8]。迄今為止，Stearn[5]對該屬的分類最為全面，依據(jù)該屬地理分布、花莖上葉的數(shù)目和花的形態(tài)（包括花的大小、花瓣形態(tài)、花瓣與內(nèi)輪萼片的相對大?。?，將該屬劃分Epimedium和Rhizophyllum兩個亞屬，Epimedium亞屬劃分為4個組：Diphyllon（中國類群）、Macroceras、Polyphyllon 和 Epimedium，Diphyllon組下又劃分為 4 個系：Campanulatae、Davidianae、Dolichocerae和Brachycerae[5]。但該屬系統(tǒng)分類研究仍存在一些明顯問題，類群間的關(guān)系以及類群界限的劃分仍不清楚，其起源與進化仍沒有定論[9-11]。

細胞學(xué)的核型分析已廣泛應(yīng)用于植物分類學(xué)研究，可以為植物系統(tǒng)起源進化和種間親緣關(guān)系研究提供重要的細胞學(xué)資料[12]。盡管淫羊藿屬植物核型分析已開展了大量的工作[1，12-17]，但由于該屬物種繁多、分布廣泛、材料采集困難，導(dǎo)致該屬細胞學(xué)核型研究一直不系統(tǒng)、不深入，限制了核型分析在該屬植物分類學(xué)研究中的應(yīng)用。本文在長期收集的淫羊藿屬植物資源的基礎(chǔ)上，開展了來源于中國、日本、德國、美國等全世界不同地區(qū)10種該屬植物的核型分析，以期為該屬植物的系統(tǒng)分類和起源進化等領(lǐng)域的深入研究提供細胞學(xué)證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及來源

實驗材料1～4號由作者及其團隊實地野外采集，實驗材料5～10號由作者與該地區(qū)相關(guān)研究機構(gòu)學(xué)術(shù)交流收集獲得。憑證標(biāo)本存于貴州師范大學(xué)植物標(biāo)本室，活體植株種植于貴州師范大學(xué)貴州省喀斯特石漠化防治與衍生產(chǎn)業(yè)工程實驗室植物栽培室，詳情見表1。

表1 供試材料及來源Table 1 Materials used in this study

1.2 實驗方法

春季上午9:00—10:00從生長旺盛活體植株上剪取長1～2cm新生長的根尖，室溫下置于飽和α-溴萘溶液中預(yù)處理5～6 h，卡諾I氏固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）中固定 12 h 以上，1 mol/L HCl溶液 60 ℃恒溫解離10min，改良苯酚品紅染色30～45min，壓片法制片。用顯微攝像系統(tǒng)（Olympus BX53-DP72）選取著絲粒清晰、分散良好的中期分裂細胞相進行顯微拍照。每個材料選取30個以上良好的中期分裂細胞相進行染色體計數(shù)，并選出5個最佳的中期分裂細胞相進行核型分析。核型分析按李懋學(xué)等的標(biāo)準[18]，染色體命名按A.Levan等的方法[19]，核型分類按G.L.Stebbins的標(biāo)準[20]。

2 結(jié)果與分析

對10種淫羊藿植物的根尖有絲分裂中期細胞進行染色體計數(shù)和核型分析，結(jié)果顯示，該10種植物染色體數(shù)均為12條（二倍體，2n=2x=12），每個物種均有1對隨體染色體，且每個物種的核型均屬Stebbins標(biāo)準[20]的2A型。10種淫羊藿屬植物的根尖有絲分裂中期染色體參數(shù)見表2，中期染色體形態(tài)和配對核型分別見圖1～3。

2.1 粗毛淫羊藿（E.acuminatum Franch.）

原產(chǎn)主要分布于中國西南，貴州各縣份均有分布，四川、重慶、云南、廣西、湖南、湖北也有分布，生于海拔290～2100 m的山坡、溝谷林下或灌叢中。花大，具長距，明顯大于內(nèi)輪萼片，聚傘狀圓錐花序，三出復(fù)葉，小葉下面密被粗短硬毛。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Epimedium亞屬Diphyllon組Dolichocerae系[5]。

表2 10種淫羊藿屬植物根尖細胞有絲分裂中期染色體核型參數(shù)Table 2 The karyotype parameters in mitosis metaphase of root tip cells of the ten Epimedium species

圖1 6種淫羊藿屬植物的根尖細胞有絲分裂中期染色體Figure 1 The metaphase chromosomes in root tip cells of the six Epimedium species

核型公式為 2n=2x=6m（2SAT）+6sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.01～2.66，平均臂比值為1.76，最長與最短染色體之比為1.45，核型屬2A型。

2.2 箭葉淫羊藿（E.sagittatum Maxim.）

廣布種，原產(chǎn)廣泛分布于中國各個地區(qū)，生于海拔500～1500 m的山坡林下、灌叢及草叢中。花小，具短距，圓錐花序，三出復(fù)葉，葉背具粗短硬毛。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Epimedium亞屬Diphyllon組 Brachycerae 系[5]。

圖2 4種淫羊藿屬植物的根尖細胞有絲分裂中期染色體Figure 2 The metaphase chromosomes in root tip cells of the four Epimedium species

核型公式為 2n=2x=6m（2SAT）+6sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.01～2.32，平均臂比值為1.67，最長與最短染色體之比為1.60，核型屬2A型。

2.3 E.diphyllum （Morr.et Decne.） Lodd.

原產(chǎn)分布于日本海沿岸，生于海拔500～1500 m的山坡林下、灌叢及草叢中。三出復(fù)葉基生或莖生，花瓣無長距，短于或小于內(nèi)輪萼片，圓錐花序，小葉膜質(zhì)。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Epimedium亞屬Macroceras組[5]。

核型公式為 2n=2x=6m（2SAT）+6sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.13～2.99，平均臂比值為1.80，最長與最短染色體之比為1.42，核型屬2A型。

2.4 朝鮮淫羊藿（E.koreanum Nakai）

原產(chǎn)分布于日本海沿岸，朝鮮，中國吉林、遼寧、浙江、安徽等地區(qū)。生于海拔400～1500 m的林下或灌叢中。二回三出復(fù)葉基生和莖生，小葉紙質(zhì)，總狀花序頂生，具4～16朵花，花大，直徑2～4.5cm，花瓣具長距通常遠較內(nèi)萼片長。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Epimedium亞屬Macroceras組[5]。

核型公式為 2n=2x=6m（2SAT）+6sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.01～2.98，平均臂比值為1.81，最長與最短染色體之比為1.42，核型屬2A型。

圖3 10種淫羊藿屬植物的根尖細胞有絲分裂中期染色體核型Figure 3 The karyotypes of root tip cells of the ten Epimedium species

2.5 E.grandiflorum Morr.

原產(chǎn)分布于日本、朝鮮北部，生于海拔400～1500m的林下或灌叢中。二回三出復(fù)葉基生或莖生，小葉紙質(zhì)，卵形，花大，直徑2～4.5cm，總狀花序頂生，具4～16朵花，花瓣通常遠較內(nèi)萼片長。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Epimedium亞屬Macroceras組[5]。

核型公式為 2n=2x=6m（2SAT）+6sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.01～2.50，平均臂比值為1.72，最長與最短染色體之比為1.16，核型屬2A型。

2.6 柔毛淫羊藿（E.pubescens Maxim.）

原產(chǎn)分布于中國陜西、甘肅、湖北、四川、河南、貴州、安徽等地，生于海拔300～2000 m的林下、灌叢中、山坡地邊或山溝陰濕處。一回三出復(fù)葉基生或莖生，莖生葉2枚對生，小葉3枚，背面密被絨毛，花小，圓錐花序具30～100余朵花，花瓣遠較內(nèi)萼片短。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Epimedium亞屬Diphyllon組Brachycerae系[5]。

核型公式為 2n=2x=6m（2SAT）+6sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.06～2.25，平均臂比值為1.67，最長與最短染色體之比為1.29，核型屬2A型。

2.7 E.trifoliatobinatum （Koidz.）Koidz

原產(chǎn)分布于日本、朝鮮北部，生于海拔400～1500m的林下或灌叢中。三出復(fù)葉基生或莖生，小葉革質(zhì)，花大，直徑 2.5～4.5cm，總狀花序頂生，具4～10朵花，花瓣具長距明顯較內(nèi)萼片長。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Epimedium亞屬Macroceras組[5]。

核型公式為 2n=2x=6m（2SAT）+6sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.11～2.50，平均臂比值為1.77，最長與最短染色體之比為1.46，核型屬2A型。

2.8 E.perralderianum Coss.

原產(chǎn)分布于非洲阿爾及利亞東北部，生長于海拔1200～1500 m的櫟樹林和雪松林的山坡。小葉心形、邊緣密被鋸齒狀小刺，花尺寸中等，直徑1.5～2.3cm，黃色，花瓣2.5mm長，短于內(nèi)輪萼片。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Rhizophyllum亞屬[5]。

核型公式為 2n=2x=8m（2SAT）+4sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.13～2.75，平均臂比值為1.70，最長與最短染色體之比為1.38，核型屬2A型。

2.9 E.alpinum L.

淫羊藿屬的模式種，原產(chǎn)分布于阿爾卑斯山脈，生于海拔1000～2000 m的山坡上。花較小，具短距，萼片多為深紅色；總狀花序；三出復(fù)葉，葉背無毛著生。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Epimedium亞屬Epimedium 組[5]。

核型公式為 2n=2x=6m（2SAT）+6sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.01～2.67，平均臂比值為1.70，最長與最短染色體之比為1.64，核型屬2A型。

2.10 E.pubigerum （DC.） Morr.et Decne.

原產(chǎn)分布于地中海及阿爾卑斯山脈地區(qū)，生于海拔600～1200 m的山坡上?；ㄝ^小而多，具短距，復(fù)總狀花序，三出復(fù)葉，小葉膜質(zhì)。在Stearn分類系統(tǒng)中劃分在Epimedium亞屬Epimedium組[5]。

核型公式為 2n=2x=6m（2SAT）+6sm，1、2、3 號為中部著絲粒染色體，4、5、6號為近中著絲粒染色體，1號具有中間隨體。染色體臂比的變異幅度為1.01～2.66，平均臂比值為1.78，最長與最短染色體之比為1.45，核型屬2A型。

3 討論與結(jié)論

筆者自2007年以來即開展了大量的淫羊藿屬植物細胞學(xué)研究，2007年分別報道了6種淫羊藿屬植物核型[1]和12種淫羊藿屬植物核型分析[12]，2010年報道了18種淫羊藿屬植物核型[7]和14種淫羊藿屬植物45S和5S rDNA中期染色體定位[16]。在此基礎(chǔ)上，本研究報道了來自中國、日本、美國、德國等廣泛區(qū)域的10個淫羊藿植物的核型，其中E.grandiflorum，E.diphyllum，E.trifoliatobinatum和E.perralderianum等4個種的核型系首次報道。研究結(jié)果使該屬植物細胞學(xué)核型分析研究更加系統(tǒng)全面，為該屬植物的系統(tǒng)分類、起源進化等相關(guān)研究提供了更為全面的細胞學(xué)證據(jù)。

研究結(jié)果顯示，供試的10種淫羊藿植物染色體數(shù)均為12條，基數(shù)均為6，均為二倍體（2n=2x=12），且每個物種第1對體染色體均具有隨體染色體，這與前人的研究報道結(jié)果一致[12-17]。該屬植物除印江淫羊藿（E.yinjiangense M.Y.Sheng&Tian X.J.）報道為四倍體（2n=4x=24）外[21]，目前有細胞學(xué)研究報道的物種均為二倍體。系統(tǒng)進化研究表明，具有對稱核型的物種在進化上屬于古老原始類群，進化的類群在核型上表現(xiàn)明顯的不對稱[22]。本研究供試的10種淫羊藿屬植物的核型均屬Stebbins標(biāo)準[20]的2A型，典型的對稱性核型，與前人對該屬植物核型分析的結(jié)果一致[12-17]，進一步證實了淫羊藿屬在進化上是一個較為保守的植物類群[16]。

本研究供試的10種淫羊藿屬植物核型公式，除 E.perralderianum 為 2n=2x=8m（2SAT）+4sm，其他9個種均為2n=2x=6m（2SAT）+6sm。結(jié)合前人對該屬植物的核型分析結(jié)果[1，12，16]，可以看出淫羊藿屬植物核型穩(wěn)定、種間核型較一致。盡管如此，核型分析在該屬植物屬下分類與系統(tǒng)進化研究仍具有明顯意義。供試材料E.perralderianum屬下劃分在Rhizophyllum亞屬，而其他9個種劃分在Epimedium亞屬[5]，核型研究結(jié)果支持這一形態(tài)學(xué)上亞屬的劃分。而Epimedium亞屬內(nèi)各類群的劃分，尤其是Diphyllon組類群間的劃分和關(guān)系，還無法從核型分析得到支撐證據(jù)，有待于開展該屬植物染色體分帶、rDNA等特征基因染色體定位等更深入的細胞學(xué)研究。

應(yīng)用核型分析對淫羊藿屬植物屬下類群進行種類鑒定、親緣關(guān)系闡明十分困難，核型系統(tǒng)學(xué)的意義有限，但在屬上的分類級別的系統(tǒng)進化研究具有重要的參考價值。與小檗科其他類群比較，山荷葉屬（Diphylleia）、八角蓮屬（Dysosma）、足葉草屬（Podophyllum）、桃兒七（Sinopodophyllum）屬等 4個屬植物的核型公式分別為2n=2x=8m（2SAT）+2st+2t、2n=2x=8m（2SAT）+2st（2SAT）+2t、2n=2x=6m（4SAT）+2sm+2t 和 2n=2x=8m（2SAT）+2st（2SAT）+2t[23-24]，淫羊藿屬植物的核型與上述類群具有明顯差異，且淫羊藿屬植物核型明顯具有對稱性，反映出淫羊藿屬植物在小檗科明顯是一個起源上更古老的類群，且與其他屬植物的親緣關(guān)系較遠[25]。這一結(jié)果被孢粉學(xué)[26-27]、分子標(biāo)記[28-31]、同工酶[32]及化學(xué)分類學(xué)[3-4]等研究得到很好的支持。

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Karyotype Analysis of Ten Epimedium Species and Its Taxonomic Implications

WANG Lin-jiao1，2，TIAN jing1，2，SHENG Mao-yin1，2，3*
（1.Institute of Karst Research，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China;2.National Engineering Research Center for Karst Rocky Desertification Control，Guiyang 550001，China;3.GuizhouEngineeringLaboratoryforKarstRockyDesertificationControlandDerivativeIndustry，Guiyang550001，China）

【Objective】The aim of this study was to analyse the karyotype of ten Epimedium species，and to offer some important evidences for the further studies on phylogenesis，genetics and evolution of Epimedium genus.【Method】The metaphase chromosomes of the root tip cells of ten Epimedium species were studied by traditional chromosome tabletting technique.【Results】Ten Epimedium species used in this study were diploids with 12 chromosomes（2n=2x=12）.Their karyotypes were symmetric（2A）and similar to each other，with one pair of middle satellite chromosomes.The karyotype formula of E.perralderianum was 2n=2x=8m（2SAT）+4sm but the other 9 species were 2n=2x=6m（2SAT）+6sm.【Conclusion】The results supported the conclusion that Epiemdium genus was divided into two subgenus（Epimedium and Rhizophyllum），suggesting that Epimedium is an old taxa and is far relation with other taxa in family Berberidaceae.Although karyotype analysis only provide limited data for systematic studies under genus Epimedium，it can offer important and significant evidences for the phylogenesis studies between genus Epimedium and other taxa in family Berberidaceae.

Epimedium；karyotype analysis；phylogenesis；origin；evolution

Q949.746.8；R282.2

A

1000-2650（2017）03-0389-07

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.03.016

2017-06-17

國家“十三五”重點研發(fā)計劃項目（2016YFC0502603）；貴州省科技合作計劃重點項目（黔科合LH字[2015]7779號）。

王霖嬌，碩士，講師。*責(zé)任作者：盛茂銀，博士，教授，主要從事特色植物利用與喀斯特生態(tài)研究，E-mail:shmoy@163.com。

（本文審稿：唐宗祥；責(zé)任編輯：鞏艷紅；英文編輯：徐振鋒）