甘藍(lán)型油菜SHR蛋白基因鑒定與結(jié)構(gòu)分析

劉慧萍，陳永勤，黃毅，頓小玲

(1. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

甘藍(lán)型油菜SHR蛋白基因鑒定與結(jié)構(gòu)分析

劉慧萍1,2，陳永勤1，黃毅2，頓小玲2

(1. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，
農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

植物SHR蛋白屬于GRAS蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族，保守羧基端含有VHIID結(jié)構(gòu)域，氨基端不保守，參與調(diào)控植物物質(zhì)合成和生長(zhǎng)發(fā)育.參照擬南芥AtSHR基因的CDS序列，采用生物信息學(xué)的方法在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出3個(gè)BnSHR基因，進(jìn)而分析其基因結(jié)構(gòu)、生化特性、進(jìn)化關(guān)系和蛋白結(jié)構(gòu).研究結(jié)果顯示3個(gè)BnSHR基因中有2個(gè)位于C基因組(來(lái)源于甘藍(lán))上，1個(gè)位于A基因組(來(lái)源于白菜)；3個(gè)BnSHR基因的氨基酸序列一致性為88.25%，與AtSHR基因在進(jìn)化上也高度同源，SHR基因在結(jié)構(gòu)和功能上保守；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示BnSHR蛋白可能定位于過(guò)氧化物酶體，參與種子萌發(fā)過(guò)程中脂肪轉(zhuǎn)變?yōu)樘欠值倪^(guò)程；PHYRE2預(yù)測(cè)了BnSHR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，由于序列的差異性導(dǎo)致了氨基末端處結(jié)構(gòu)相差較大，但VHIID保守區(qū)結(jié)構(gòu)類似，為β-折疊.

甘藍(lán)型油菜；SHR基因；基因結(jié)構(gòu)；氨基酸序列；三級(jí)結(jié)構(gòu)

0 引言

GRAS蛋白家族是高等植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的羧基末端，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、解毒作用、生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)的應(yīng)答過(guò)程[1].2004年，Bolle等通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析，鑒定出至少33個(gè)蛋白家族成員,可被分為7個(gè)分支，分別為：DELLA、SCR、Ls、HAM、PAT1、SHR、SCL9[2].其保守的羧基末端一般由幾個(gè)典型的結(jié)構(gòu)組成: LXXLL、7個(gè)亮氨酸重復(fù)區(qū)I(LHRI)、NLS、VHIID、7個(gè)亮氨酸重復(fù)區(qū)II(LHRII)、PFYRE和SAW[3].其中，SHORT-ROOT(SHR)蛋白因子與家族其他GRAS蛋白序列相似性相對(duì)較小，其保守羧基端僅含有VHIID 基序和PFYRE 基序[3,4]，導(dǎo)致其在功能上與其他成員也有所不同，成為了進(jìn)化樹(shù)上的單獨(dú)分支[5].

1993年Benfey PN等通過(guò)T-DNA插入突變經(jīng)篩選后得到了擬南芥shr突變體，首次發(fā)現(xiàn)SHR基因與擬南芥根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和輻射形態(tài)形成相關(guān)[6].后來(lái)擬南芥的SHORT-ROOT基因(AtSHR)在2000年被成功克隆，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)全長(zhǎng)1 593 bp，在根和莖中都能檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并且證實(shí)了SHR在擬南芥根基本組織(內(nèi)皮和皮層)形成的不對(duì)稱平周分裂和使內(nèi)皮層細(xì)胞規(guī)則排列中的必要性[4].2011年，Lucas等研究shr突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于主根基本組織發(fā)生變化，中柱鞘細(xì)胞減少，導(dǎo)致從中發(fā)生的側(cè)根數(shù)減少，且側(cè)根形態(tài)也發(fā)生巨大缺陷[7].

此外，進(jìn)一步研究表明SHR蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子在中柱細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)，后移動(dòng)到內(nèi)皮細(xì)胞核中發(fā)揮作用，例如在SCR上游起作用，激活和維持SCR的表達(dá)，正調(diào)控根輻射形態(tài)的形成等生理活動(dòng)[8-10];且SHR蛋白移動(dòng)范圍也決定了皮層細(xì)胞層的數(shù)量[11].關(guān)于SHR蛋白的表達(dá)特性，有GFP熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明SHR最早在球形胚晚期的前形成層中表達(dá)，SCR也在球形胚時(shí)期的基本組織細(xì)胞中開(kāi)始表達(dá)，表明SHR與SCR的相互作用很可能在胚胎發(fā)育早期建立，以非細(xì)胞自主方式發(fā)揮作用[4,12].另外，Levesque等(2006)在對(duì)一系列彼此獨(dú)立的基因芯片結(jié)果(包括在shr突變體背景下直接誘導(dǎo)表達(dá)SHR，SHR功能缺失和異位表達(dá)SHR)進(jìn)行生物信息學(xué)研究后，發(fā)現(xiàn)其下游可能有495個(gè)基因受其調(diào)控，其中106個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，另外389個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，其中又有8個(gè)基因的調(diào)控情況具有高度置信性，極可能是直接被SHR誘導(dǎo)表達(dá)的；另一方面，按照功能可將受SHR間接調(diào)控的基因劃分為轉(zhuǎn)錄因子(46個(gè))、蛋白質(zhì)磷酸化酶(40個(gè))、物質(zhì)代謝類(111個(gè))和激酶(37個(gè))[13].

SHR基因是一個(gè)功能進(jìn)化比較保守的基因，作為植物組成型表達(dá)產(chǎn)物，在除擬南芥的其他植物中也發(fā)揮著重要作用.目前已在水稻(Oryzasativa)、白楊(Populustremula)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和輻射松(Pinusradiata)等植物中都發(fā)現(xiàn)了SHR基因[14-17].其中水稻SHR基因(OsSHR)在根部的作用與擬南芥(AtSHR)類似[7]，但OsSHR基因家族還有特定的成員參與水稻葉片氣孔的形成[14].白楊SHR基因(PttSHR)在芽的形成層表達(dá)，蒺藜苜蓿SHR基因(MtSHR)是在組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的不定根中發(fā)現(xiàn)的，而輻射松SHR基因(PrSHR)參與了根分生組織的形成和維持，同時(shí)在下胚軸形成層區(qū)也有表達(dá).而甘藍(lán)型油菜的BnSHR基因特征與表達(dá)模式尚少見(jiàn)報(bào)道.

本研究利用擬南芥AtSHR序列在油菜全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，找到甘藍(lán)、白菜及甘藍(lán)型油菜的SHR基因與蛋白序列，采用生物信息學(xué)方法加以鑒定，并對(duì)其氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系展開(kāi)分析，為研究甘藍(lán)型油菜SHR蛋白功能提供研究方向和參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料采用的擬南芥(Arabidopsis)SHR基因序列和氨基酸序列從TAIR10(http://www.arabidopsis.org/)下載，白菜(Brassicarapa)、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)和甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)的SHR基因CDS序列和氨基酸序列從Brassica Datebase (http://brassicadb.org/)下載.

1.2甘藍(lán)型油菜SHR蛋白基因鑒別以擬南芥SHR基因的CDS序列在Brassica Database本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn檢索，并在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和油菜全基因組注釋信息網(wǎng)站(http://www.genoscope.cns.fr/blat-server/cgi-bin/colza/webBlat)上驗(yàn)證，篩選到白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的全部SHR基因，經(jīng)SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)[18]分析，確定其GRAS結(jié)構(gòu)域所在位點(diǎn).

采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)[19]預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理論分子量(MW)、等電點(diǎn)(pI)、不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)、脂肪系數(shù)(Aliphatic index)和GRAVY.利用PSORT預(yù)測(cè)甘藍(lán)型油菜SHR蛋白的亞細(xì)胞定位位置.

1.3甘藍(lán)型油菜SHR蛋白基因系統(tǒng)發(fā)生與motif分析為了詳細(xì)地了解各SHR蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，利用Clustal W(MEGA6)[20]對(duì)甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜和擬南芥的SHR基因的CDS序列進(jìn)行了比對(duì)，并以擬南芥的SHR基因(AtSHR)做為外類群，利用MEGA6中的鄰接法(Neighbor-Joining，Psssion模型)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中bootstrap值設(shè)為1 000次重復(fù).

將甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)SHR蛋白的氨基酸序列保存為一個(gè)FASTA格式文檔，用MEME4.10.2(http://meme-suite.org/tools/meme)[21]在線軟件對(duì)其蛋白序列進(jìn)行motif分析，參數(shù)設(shè)置：最優(yōu)寬度6-50個(gè)氨基酸，一次或0次出現(xiàn)，最多預(yù)測(cè)10個(gè)motif.

1.4甘藍(lán)型油菜SHR蛋白氨基酸序列分析和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用DNAMAN軟件(DNAMAN6.0.3.99簡(jiǎn)體中文版)預(yù)測(cè)甘藍(lán)型油菜3個(gè)SHR蛋白和擬南芥SHR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行氨基酸序列分析，比較它們的同源性和GRAS蛋白家族的特征位點(diǎn).DNAMAN軟件同時(shí)預(yù)測(cè)了這4個(gè)蛋白的疏水性，生成圖譜.為了更加詳細(xì)地了解甘藍(lán)型油菜SHR蛋白的立體構(gòu)象，采用PHYRE2軟件進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的在線預(yù)測(cè)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)[22]，同時(shí)用蛋白質(zhì)畫(huà)圖工具PYMOL(http://www.pymol.org/)優(yōu)化蛋白結(jié)構(gòu)圖，找出重要結(jié)構(gòu)域.

2 結(jié)果與分析

2.1甘藍(lán)型油菜SHR基因鑒定在TAIR網(wǎng)站上搜索到擬南芥SHR基因AT4G37650，按習(xí)慣稱為AtSHR，下載其基因序列和蛋白質(zhì)序列，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)擬南芥上沒(méi)有其他同源SHR基因.通過(guò)在NCBI、油菜全基因組注釋信息網(wǎng)站和Brassica Datebase上的BLASTn比對(duì)，獲得了同樣的甘藍(lán)型油菜SHR蛋白基因3個(gè)，白菜SHR蛋白基因3個(gè)，以及甘藍(lán)SHR蛋白基因3個(gè)，如表1.通過(guò)本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)下載上述9個(gè)基因的CDS序列和蛋白質(zhì)序列，并將甘藍(lán)型油菜的3個(gè)SHR基因分別記為BnSHR1、BnSHR2、BnSHR3，下同.

表1 AtSHR在白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中的同源基因的相關(guān)信息

2.2甘藍(lán)型油菜SHR蛋白基因系統(tǒng)發(fā)生及保守性目前SHR基因甚至GRAS蛋白家族都是在擬南芥和水稻中研究的最多，GRAS蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系已有研究[2,17].但SHR蛋白作為其中一個(gè)亞族，其同源基因少且多數(shù)物種的SHR基因序列并未準(zhǔn)確測(cè)定和正式公布.所以本研究主要針對(duì)性地討論BnSHR與其來(lái)源物種和模式生物擬南芥中SHR的進(jìn)化關(guān)系.根據(jù)上述獲得的基因的CDS序列分析它們的進(jìn)化關(guān)系，以AtSHR為外類群，結(jié)果如圖1.從進(jìn)化樹(shù)上可以看出，各基因間同源性較高，且明顯分為四類:A、B、C、D.其中A類包括BnSHR1、Bol018604、Bra017842三個(gè)基因，BnSHR1位于C07染色體，而B(niǎo)ol018604位于C06染色體.B類中的兩個(gè)基因分別為甘藍(lán)的Bol028898和白菜的Bra011777，它們?cè)诟仕{(lán)型油菜中沒(méi)有同源拷貝.C類的BnSHR2和Bra010606都定位于A08染色體上，初步認(rèn)定甘藍(lán)型油菜中的BnSHR2應(yīng)該來(lái)源于白菜的A08染色體.D類中的基因是BnSHR3和Bol032723，位于染色體C03，來(lái)源于甘藍(lán).由此可以看出甘藍(lán)型油菜的SHR基因來(lái)源于其親本組合白菜和甘藍(lán)，且2個(gè)來(lái)自甘藍(lán)，1個(gè)來(lái)自白菜，序列比對(duì)分系析表明其同源性都達(dá)到了100%，在AtSHR為外類群的條件下，各個(gè)BnSHR與AtSHR在進(jìn)化上依然非常相近，這表明了SHR蛋白基因在進(jìn)化上的保守性和嚴(yán)謹(jǐn)性，其中VHIID為SHR蛋白含有的GRAS結(jié)構(gòu)域中的一類保守基序.這些結(jié)果暗示了BnSHR在基因功能上可能與AtSHR相似.

圖1 甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)和擬南芥SHR蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEME4.10.2軟件分析3個(gè)甘藍(lán)型油菜SHR蛋白和其親本蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)10個(gè)保守基序(motif)，一次命名為motif1-10(圖2).motif3為VHIID保守基序，存在于每一個(gè)SHR蛋白質(zhì)中；motif7、motif8和motif10處于高度變異的氨基末端，其中motif10只存在于BnSHR1、BnSHR2和Bol018604中，但總體一致性較高；余下的6個(gè)motif都存在于保守的羧基末端.比較BnSHR2和Bra010606發(fā)現(xiàn)，BnSHR2上多了一個(gè)Bra010606沒(méi)有的motif10，這可能是由于在甘藍(lán)型油菜中A、C基因組發(fā)生了同源性重組的原因[23].

圖2 甘藍(lán)型油菜SHR蛋白的保守motif 組成分析

2.3BnSHR1、BnSHR2、BnSHR3的理化性質(zhì)分析蛋白質(zhì)的功能通常與它的理化性質(zhì)密不可分.從表2中可以看出甘藍(lán)型油菜SHR蛋白所含氨基酸殘基數(shù)在500左右，其中N端380個(gè)左右的氨基酸殘基組成了GRAS結(jié)構(gòu)域，屬于GRAS蛋白家族；BnSHR蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域GRAS中組成基序與其功能密切相關(guān).3個(gè)蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì).在生化特性上BnSHR1、BnSHR2和BnSHR3等電點(diǎn)均小于7，帶負(fù)電荷且都為親水性蛋白質(zhì)，這可能是其作為轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的理化基礎(chǔ).此外，蛋白質(zhì)的脂肪系數(shù)代表其所含脂肪族氨基酸的含量，BnSHR1(脂肪系數(shù)：66.58)、BnSHR2(脂肪系數(shù)：68.23)和BnSHR3(脂肪系數(shù)：69.07)在氨基酸組成成分上的相似性極高.利用PSORT對(duì)BnSHR的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白很可能位于過(guò)氧化物酶體和線粒體.其氨基酸序列比較及蛋白功能的研究將會(huì)在下面通過(guò)生物信息學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步的探索.

表2 甘藍(lán)型油菜中3種SHR蛋白理化性質(zhì)

2.4甘藍(lán)型油菜SHR蛋白序列和構(gòu)型分析比對(duì)分析甘藍(lán)型油菜和擬南芥的SHR蛋白質(zhì)的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，他們的相似性達(dá)到了90.12%.pfam分析也表明3個(gè)甘藍(lán)型油菜的SHR蛋白具有典型的GRAS結(jié)構(gòu)域，屬于GRAS蛋白家族.在C-末端有和擬南芥一樣高度保守的基序和氨基酸，比如SAW基序以及附近的WX7G和WX10W，還有與SHR蛋白核定位和在細(xì)胞間的移動(dòng)密切相關(guān)的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)[24].在不保守的N-末端，發(fā)現(xiàn)BnSHR含有谷氨酰胺聚合物、蘇氨酸聚合物、絲氨酸聚合物和丙氨酸聚合物(圖3)，同樣的聚合物也在AtSHR和OsSHR中出現(xiàn)[4,14].在經(jīng)過(guò)多序列比對(duì)后，預(yù)測(cè)甘藍(lán)型油菜和擬南芥的SHR蛋白的疏水性，如圖4.根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸的疏水性繪制圖譜，從圖中可以看出4個(gè)蛋白質(zhì)的疏水性圖譜幾乎重合，證明了BnSHR與AtSHR在生理特性上的高度相似性.

圖3 甘藍(lán)型油菜和擬南芥的SHR蛋白質(zhì)氨基酸序列分析

圖4 甘藍(lán)型油菜和擬南芥SHR蛋白氨基酸序列的疏水性

表3 SHR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

DNAMAN對(duì)甘藍(lán)型油菜SHR蛋白和AtSHR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示如表3.BnSHR與AtSHR在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成上非常相似，大部分由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋組成，也有顯著的β-折疊結(jié)構(gòu).為了進(jìn)一步分析SHR蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，本研究采用PHYRE2軟件進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的在線預(yù)測(cè)，可信度最高的為同一個(gè)模板c4kifB(來(lái)源于PDB)，以此模板進(jìn)行同源建模結(jié)果如圖5.從圖中可以看出擬南芥和甘藍(lán)型油菜的SHR蛋白的空間構(gòu)象十分相似，除了由于少量的一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同而引起的差異，其余各二級(jí)結(jié)構(gòu)的走向和空間位置都相當(dāng)一致.圖中箭頭所指的第三個(gè)β-折疊在圖5中有單獨(dú)顯示，是SHR蛋白質(zhì)具有的GRAS蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)VHIID,左圖中標(biāo)有氨基酸名稱，在圖5中可以看出VHIID保守基序所在的空間位置和其前后結(jié)構(gòu)都幾乎一致，并且β-折疊的走向全部一致，為平行折疊片，活性更高.以上結(jié)果從蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)說(shuō)明了BnSHR與AtSHR的在各方面的高度相似性，可以推測(cè)BnSHR可能與AtSHR一樣地在根部表達(dá)并發(fā)揮功能.

圖5 同源建模預(yù)測(cè)的SHR蛋白質(zhì)空間結(jié)

3 討論

本研究采用生物信息學(xué)分析方法，參考擬南芥SHR蛋白基因AtSHR的CDS序列和GRAS蛋白結(jié)構(gòu)域序列,從甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了3個(gè)BnSHR基因，比較分析了基因結(jié)構(gòu)、生化特性、進(jìn)化關(guān)系和蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)掘出甘藍(lán)型油菜SHR蛋白基因包含的重要信息.

甘藍(lán)型油菜是來(lái)源于白菜和甘藍(lán)自然雜交和加倍的異源四倍體，含有兩套遺傳信息，分別位于A基因組和C基因組.通過(guò)比對(duì)鑒別出的甘藍(lán)型油菜BnSHR基因有兩個(gè)位于C基因組，一個(gè)位于A基因組.而在白菜和甘藍(lán)的比對(duì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因組上分別有3個(gè)SHR蛋白基因，我們推測(cè)一種可能是由于甘藍(lán)型油菜形成過(guò)程中的種間雜交和染色體加倍打破了物種間的界限，導(dǎo)致基因組間遺傳物質(zhì)的重新調(diào)整與分配，從而在甘藍(lán)型油菜中只保留了3個(gè)SHR蛋白基因；另一種可能是甘藍(lán)型油菜的進(jìn)化過(guò)程中染色體變異導(dǎo)致部分SHR蛋白基因改變或消失.通過(guò)分析甘藍(lán)型油菜和擬南芥、白菜以及甘藍(lán)的SHR蛋白基因的進(jìn)化關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，3個(gè)BnSHR基因雖然位于不同的分支，但它們的相似性極高，且都與擬南芥AtSHR基因高度同源，這說(shuō)明了SHR基因在進(jìn)化上的保守，BnSHR屬于SHR蛋白亞家族.比較分析甘藍(lán)型油菜和擬南芥的SHR蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)型構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)均有較高的相似性.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定它的高級(jí)結(jié)構(gòu)，在4個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一致性達(dá)到90.12%的情況下，他們的高級(jí)結(jié)構(gòu)也應(yīng)有所相似，而通過(guò)各種軟件預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)也恰好證明了這一點(diǎn).蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的功能，所以BnSHR也可能和OsSHR、MtSHR、PrSHR[16,18,19]一樣，與AtSHR[8-10]相似的在根部表達(dá)且有重要功能，即甘藍(lán)型油菜的SHR基因的功能可能也與根的生長(zhǎng)和形態(tài)建成相關(guān)，但有可能在作用機(jī)制上有所不同[25].另外，3個(gè)BnSHR基因表達(dá)的氨基酸序列一致性為88.25%，不是互為拷貝，這也說(shuō)明這3個(gè)蛋白質(zhì)的時(shí)空表達(dá)和功能上可能有所不同.亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示BnSHR蛋白可能定位于過(guò)氧化物酶體，植物中過(guò)氧化物酶體除了參與氧化乙醇酸幫助植物避免氧化毒害外，在油料植物中有一種特有的過(guò)氧化物酶體(乙醛酸循環(huán)體)，參與種子萌發(fā)過(guò)程中脂肪轉(zhuǎn)變?yōu)樘欠值倪^(guò)程[26-27]，BnSHR蛋白可能也參與了這個(gè)過(guò)程[28].

迄今為止，擬南芥SHR蛋白基因的研究較為豐富.AtSHR在擬南芥上的表達(dá)相當(dāng)多樣化，TAIR網(wǎng)站上記錄的表達(dá)位點(diǎn)有心皮、莖葉、集體葉結(jié)構(gòu)、花、花梗、保衛(wèi)細(xì)胞、下胚軸、花序分生組織、葉尖、花瓣、葉柄、植物胚胎、根、根中柱、種子、花萼、莖尖、莖軸系統(tǒng)、莖桿、脈管葉和脈管系統(tǒng).除了上述與根相關(guān)的一些功能外，有研究發(fā)現(xiàn)SHR蛋白同樣也可以影響葉的發(fā)育，SHR和SCR基因的不表達(dá)直接影響葉片細(xì)胞的分裂活性而抑制了葉片的生長(zhǎng)，而不是SHR在根部作用后的二級(jí)作用結(jié)果[29];同時(shí)SHR作為植物維管束鞘細(xì)胞光合作用的分子基礎(chǔ)之一，具有高保守性，影響了維管束鞘細(xì)胞的數(shù)量和生理機(jī)能，是改造C3植物光合效率的有效切入點(diǎn)之一[30].油菜也為C3植物，提高光合作用效率有利于植物生長(zhǎng)，增加產(chǎn)量，且由于SHR蛋白的保守性，BnSHR可以是改造油菜光合作用方式的分子基礎(chǔ).

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了3個(gè)甘藍(lán)型油菜SHR蛋白的結(jié)構(gòu)和基因信息，根據(jù)它們序列和結(jié)構(gòu)的相似性以及在進(jìn)化上的保守性，初步預(yù)測(cè)了BnSHR的相關(guān)功能和可研究性.并已經(jīng)根據(jù)比對(duì)得到的BnSHR 基因序列設(shè)計(jì)了不同的引物，接下來(lái)會(huì)通過(guò)定量PCR進(jìn)行組織特異性表達(dá)的分析，進(jìn)一步辨別這3個(gè)基因的功能，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室油菜根系轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果分析BnSHR基因?qū)τ筒烁蛋l(fā)育和功能的影響.目前對(duì)于藍(lán)型油菜SHR蛋白的研究遠(yuǎn)沒(méi)有水稻等作物透徹，本文中為甘藍(lán)型油菜中這一蛋白的研究提供了相關(guān)的生物信息學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)也為甘藍(lán)型油菜遺傳改良提供了可用基因資源和分子調(diào)控理論指導(dǎo).

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IdentificationandstructuralanalysisofSHRgenesinBrassicanapus

LIU Huiping1,2，CHEN Yongqin1，HUANG Yi2，DUN Xiaoling2

(1. College of Life Science, Hubei University, Wuhan 430062, China;
2. Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Biology and Genetic
Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China)

Plant SHR proteins belong to GRAS protein family of transcription factors, whose conservative C-terminus contains the VHIID domain, while the N-terminus are not conserved, play crucial role in biosynthesis and development regulation. To investigate the homologs inBrassicanapus, 3BnSHRgenes inBrassicanapuswere identified through amino acid sequence ofAtSHRagainst Brassica Database, then analyzed their gene structure, biochemical characteristics, evolutionary relationships and protein structure. The results show that 2BnSHRlocate in C genome fromBrassicaoleracea, 1BnSHRlocates in A genome fromBrassicarapa; the consistency of this amino acid squences is 88.25%, also have highly homology withAtSHRin evolution, may result in the conserved functions; subcellular localization prediction of BnSHR proteins are in peroxysome, may involve in transforming fat into sugar during the germination; the predicted tertiary structure of proteins display the architectural difference during N-terminus, otherwise, show the similar β-plated sheet with VHIID conserved region.

Brassicanapus;SHRgene; gene structure; amino acid sequence; tertiary structure

2017-02-22

國(guó)家自然科學(xué)基金(31501820)資助

劉慧萍(1993-)，女，碩士生，E-mail：huiping.l@139.com；頓小玲，通信作者，助理研究員，E-mail：dunxiaoling@163.com

1000-2375(2017)06-0620-08

S565.4

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2017.06.011

(責(zé)任編輯 游俊)