離子抑制色譜法測(cè)定伊班膦酸鈉原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

李欣，陳紅，張億（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都610045）

離子抑制色譜法測(cè)定伊班膦酸鈉原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

李欣＊，陳紅#，張億（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都610045）

目的：采用離子抑制色譜法測(cè)定伊班膦酸鈉原料藥中的有關(guān)物質(zhì)。方法：色譜柱為Dionex IonPac AS11-HC，流動(dòng)相為氫氧化鉀溶液（梯度洗脫），流速為1.1 mL/min，柱溫為45℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)器為抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為35℃。結(jié)果：亞磷酸鹽、雜質(zhì)Ⅰ、磷酸鹽檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為3.08～30.83 μg/mL（r＝0.999 9）、2.84～28.43 μg/mL（r＝0.999 1）、2.95～29.52 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限分別為2.47、56.7、3.31 ng，檢測(cè)限分別為0.75、17.2、1.0 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜4.0%；加樣回收率分別為101.49%～103.57%（RSD＝0.7%，n＝9）、100.00%～104.85%（RSD＝1.8%，n＝9）、101.35%～104.08%（RSD＝0.9%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，適用于測(cè)定伊班膦酸鈉原料藥中的有關(guān)物質(zhì)。

離子抑制色譜法；伊班膦酸鈉；有關(guān)物質(zhì)；亞磷酸鹽；雜質(zhì)Ⅰ；磷酸鹽

伊班膦酸鈉是新一代雙膦酸鹽類藥物，化學(xué)名為3-（N-甲基-N-戊基）胺基-1-羥基丙烷-1，1-雙磷酸單鈉鹽一水合物，臨床主要用于治療伴有或不伴有骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤引起的高鈣血癥和絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥[1-3]?！吨袊?guó)藥典》《歐洲藥典》《美國(guó)藥典》均未收載伊班膦酸鈉。該藥在我國(guó)現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-250）-2003Z，其中有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下采用剩余滴定法測(cè)定亞磷酸鹽，采用比色法測(cè)定游離磷酸鹽[4]；也有報(bào)道采用比色分析法、高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法等測(cè)定伊班膦酸鈉原料藥中的有關(guān)物質(zhì)[5-7]，但是上述各方法均專屬性較差、操作費(fèi)力，且易受輔料干擾，步驟煩瑣。鑒于此，筆者采用離子抑制色譜法建立了測(cè)定伊班膦酸鈉原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法，以期為完善該原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ICS-3000型離子色譜儀，包括自再生抑制器、淋洗液發(fā)生器、電導(dǎo)檢測(cè)器（美國(guó)Dionex公司）；CAP225D型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli2Q型去離子水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

伊班膦酸鈉原料藥（A廠，批號(hào)：101011517、102011517、010614）；伊班膦酸鈉對(duì)照品（批號(hào)：58113，純度：99.84%）、雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)：IBD.01.01，純度：99.7%）均購(gòu)自波蘭Pharmaceutical Works POLPHARMA S.A.公司；磷酸氫二鈉對(duì)照品（德國(guó)Merck公司，批號(hào)：F1696586，純度：99.5%）；亞磷酸對(duì)照品（德國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：MKBS4781V，純度：100.0%）；氫氧化鉀為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dionex IonPac AS11-HC（250 mm×4.0 mm，9μm）；流動(dòng)相：氫氧化鉀溶液，梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.1 mL/min；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器；檢測(cè)器溫度：35℃；檢測(cè)方式：抑制電導(dǎo)檢測(cè)；抑制器：Dionex ASRS 4-mm；抑制電流：109 mA；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：25℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液精密稱取磷酸氫二鈉對(duì)照品46.20 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，得磷酸鹽對(duì)照品貯備液；精密稱取亞磷酸對(duì)照品32.76 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，得亞磷酸鹽對(duì)照品貯備液；精密稱取伊班膦酸鈉對(duì)照品31.98 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，得伊班膦酸對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述單一對(duì)照品貯備液各2 mL，置于同一50 mL量瓶中，加水定容，搖勻，得混合對(duì)照品貯備液。精密稱取雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品11.88 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，得雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述混合對(duì)照品貯備液和雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品貯備液各3 mL，置于同一25 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2.2 供試品溶液取樣品適量，加水溶解，制成每1 mL中約含伊班膦酸10 mg的供試品溶液。

2.2.3 空白對(duì)照溶液取去離子水作為空白對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均＞2.1；理論板數(shù)以伊班膦酸峰計(jì)為6 836，保留時(shí)間為48 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定不干擾。

2.4 破壞性試驗(yàn)

（1）酸破壞樣品溶液：取樣品（批號(hào)：101011517）100 mg，置于10 mL量瓶中，加1.0 mol/L鹽酸溶液1.0 mL，水?。?7℃）1 h，放至室溫，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至中性，加水定容，搖勻，即得。（2）堿破壞樣品溶液：取樣品（批號(hào)：101011517）100 mg，置于10 mL量瓶中，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液1.0 mL，水浴（37℃）1 h，放至室溫，加1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，加水定容，搖勻，即得。（3）氧化破壞樣品溶液：取樣品（批號(hào)：101011517）100 mg，置于10 mL量瓶中，加30%過(guò)氧化氫溶液1.0 mL，水?。?7℃）1 h，放至室溫，加水定容，搖勻，即得。（4）高溫破壞樣品溶液：取樣品（批號(hào)：101011517）100 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，水?。?00℃）2 h，放至室溫，即得。（5）光照破壞樣品溶液：取樣品（批號(hào)：101011517）100 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，置于4 500 lx強(qiáng)光下照射48 h，即得。分別取上述各破壞樣品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖2。由圖2可知，破壞性試驗(yàn)分解產(chǎn)生的雜質(zhì)均能與主成分峰完全分離，互不干擾，說(shuō)明本方法專屬性好，能夠滿足測(cè)定要求。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)離子抑制色譜圖Fig 1 Ion suppression chromatograms of system suit ability test

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.6、2.1、3.0、4.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得亞磷酸鹽回歸方程為y＝0.102 9x－0.048 2（r＝0.999 9）、雜質(zhì)Ⅰ回歸方程為y＝0.028 7x－0.075 4（r＝0.999 1）、磷酸鹽回歸方程為y＝0.089 5x－0.000 8（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，亞磷酸鹽、雜質(zhì)Ⅰ、磷酸鹽檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為3.08～30.83、2.84～28.43、2.95～29.52 μg/mL。

2.6 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD。結(jié)果，亞磷酸鹽、雜質(zhì)Ⅰ、磷酸鹽的LOQ分別為2.47、56.7、3.31 ng，LOD分別為0.75、17.2、1.0 ng。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，亞磷酸鹽、雜質(zhì)Ⅰ、磷酸鹽峰面積的RSD分別為0.5%、3.6%、0.3%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖2 破壞性試驗(yàn)離子抑制色譜圖Fig 2 Ion suppression chromatograms of destructive test

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：101011517）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、10、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，亞磷酸鹽未檢出，只檢出雜質(zhì)Ⅰ和磷酸鹽，其峰面積的RSD分別為2.7%、1.1%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：101011517）適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，亞磷酸鹽未檢出，雜質(zhì)Ⅰ和磷酸鹽峰面積的RSD均為0.06%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：101011517）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品，各置于10 mL量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量，結(jié)果見(jiàn)表3（注：“-”表示未檢出）。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 3 Results of determination related substance of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 梯度洗脫方式的選擇

由于伊班膦酸鈉原料藥中存在較多的陰離子，故采用梯度洗脫的方式[8-10]，即改變流動(dòng)相中氫氧化鉀溶液的濃度，使各雜質(zhì)之間、雜質(zhì)與主成分之間分離度均能達(dá)到要求；且在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氫氧化鉀溶液的濃度梯度在45 min內(nèi)由初始的10 mmol/L增加至30 mmol/L時(shí)，亞磷酸鹽、雜質(zhì)Ⅰ、磷酸鹽與主成分峰之間能夠達(dá)到分離要求，各陰離子峰之間均無(wú)干擾。

3.2 檢測(cè)方式的選擇

由于亞磷酸鹽、雜質(zhì)Ⅰ和磷酸鹽均無(wú)強(qiáng)紫外吸收[11]，其本身也無(wú)電化學(xué)活性，故選擇電導(dǎo)檢測(cè)方式。該檢測(cè)方式具有靈敏度高、選擇性好、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)以氫氧化鉀溶液為流動(dòng)相，采用陰離子交換-抑制電導(dǎo)方式進(jìn)行檢測(cè)，不僅可以得到很低的背景電導(dǎo)，提高檢測(cè)靈敏度，而且樣品前處理簡(jiǎn)單，只需溶解稀釋即可進(jìn)樣分析[12-15]。

3.3 雜質(zhì)Ⅰ的計(jì)算及系統(tǒng)適用性溶液的制備

由于雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品不易得，在計(jì)算時(shí)可采取加校正因子的主成分自身對(duì)照法，以節(jié)約檢驗(yàn)成本，同時(shí)使該檢驗(yàn)方法具有普遍適用性。所以本試驗(yàn)只用少量雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品制備混合對(duì)照品溶液。又由于混合對(duì)照品溶液中已含有主成分，因此本試驗(yàn)不單獨(dú)制備系統(tǒng)適用性溶液。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，適用于測(cè)定伊班膦酸鈉原料藥中的有關(guān)物質(zhì)。

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Determination of Related Substances in Ibandronate Sodium Raw Materials by Ion Suppression Chromatography

LI Xin，CHEN Hong，ZHANG Yi（Chengdu Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610045，China）

OBJECTIVE：To adopt ion suppression chromatography to determine related substance in ibandronate sodium raw materials.METHODS：The separation was performed on a Dionex IonPac AS11-HC column with mobile phase consisted of potassium hydroxide（gradient elution）at the flow rate of 1.1 mL/min.The column temperature was set at 45℃，and sample size was20 μL.Suppressed conductivity detector was adopted with temperature of 35℃.RESULTS：The linear ranges of phosphite，impurityⅠand phosphate were 3.08-30.83 μg/mL（r＝0.999 9），2.84-28.43 μg/mL（r＝0.999 1），2.95-29.52 μg/mL（r＝0.999 9），respectively.The limits of quantitation were 2.47，56.7，3.31 ng，and the limits of detection were 0.75，17.2，1.0 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 4.0%.The recoveries were 101.49%-103.57%（RSD＝0.7%，n＝9），100.00%-104.85%（RSD＝1.8%，n＝9），101.35%-104.08%（RSD＝0.9%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and sensitive，and is suitable for the determination of related substance in ibandronate sodium raw materials.

Ion suppression chromatography；Ibandronate sodium；Related substance；Phosphite；ImpurityⅠ；Phosphate

R927

A

1001-0408（2017）30-4288-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.30

＊主管藥師。研究方向：藥物分析及質(zhì)量控制。電話：028-85362213。E-mail：474519950@qq.com

#通信作者：主任藥師，碩士。研究方向：藥物分析及質(zhì)量控制。E-mail：redchen333@sohu.com

2017-03-28

2017-05-08）

（編輯：劉柳）