鮑魚來(lái)源褐藻膠裂解酶菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

李云濤，汪立平、2，張孟，張宇

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

鮑魚來(lái)源褐藻膠裂解酶菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

李云濤1，汪立平1、2，張孟1，張宇1

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

為篩選得到高效產(chǎn)褐藻膠裂解酶(Alginate lyase)微生物菌株，實(shí)現(xiàn)其商業(yè)化應(yīng)用，采用平板透明圈法從皺紋盤鮑Haliotisdiscushannai腸道中篩選得到1株高效產(chǎn)胞外褐藻膠裂解酶的菌株SS-1，在掃描電子顯微鏡下觀察菌株形態(tài)和平板菌落特征，并根據(jù)其16S rRNA基因序列分析結(jié)果，鑒定該菌株為弧菌Vibriosp.SS-1。對(duì)SS-1菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，該菌株最適發(fā)酵溫度為30 ℃，初始pH值為7.2，培養(yǎng)28 h后酶活力可達(dá)38.6 U/mL；通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，結(jié)果為麥芽糖11.86 g/L、酵母粉16.72 g/L、K2HPO41.36 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g/L、NaCl 6.75 g/L；在最佳培養(yǎng)條件下，酶活力可達(dá)191.8 U/mL，較優(yōu)化前提高了4.97倍。研究表明：該菌株具有生長(zhǎng)快速、酶活較高的特點(diǎn)，可為褐藻寡糖的制備提供技術(shù)積累。

褐藻膠裂解酶；褐藻寡糖；海洋弧菌；篩選與鑒定；響應(yīng)面法

褐藻膠(Alginate)作為一種高分子多糖，廣泛存在于海帶、海藻、羊棲菜等海洋藻體的細(xì)胞壁中，并以褐藻酸鹽的形式存在，其分子結(jié)構(gòu)是由α-L-古羅糖醛酸(PolyG)與β-D-甘露糖醛酸(PolyM)通過(guò)α/β-1,4糖苷鍵鏈接而成的線性多聚合體化合物。褐藻膠裂解酶(Alginate lyase)是以海洋褐藻類中所含褐藻膠為底物制備的具有多功能活性低聚褐藻寡糖的關(guān)鍵酶，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及海藻資源的開(kāi)發(fā)利用具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。作為一種新型多功能生物酶，褐藻膠裂解酶能通過(guò)β-1,4糖苷鍵的方式進(jìn)行消除反應(yīng)，催化褐藻膠等大分子的非還原末端C4,5間不飽和雙鍵，并有效降解褐藻膠，生產(chǎn)制備低聚褐藻寡糖(Alginate-derived oligosaccharide，ADO)。低聚不飽和褐藻寡糖因具有多重功能活性，廣泛應(yīng)用于食品保健[1-2]、醫(yī)療醫(yī)藥[3-4]、農(nóng)業(yè)化工[5-8]、生物原料[9]和飼料添加劑[10]等行業(yè)中。江曉路等[11]研究表明，以添加褐藻寡糖的飼料喂食海參可提高海參機(jī)體免疫力，顯示了其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的巨大潛力。因此，褐藻膠裂解酶在海洋資源的開(kāi)發(fā)利用及水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中具有重要價(jià)值，已成為當(dāng)前研究的新熱點(diǎn)。

1984年，Hansen等[12]首次從土壤和海水中分離得到一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的芽孢桿菌JBH2，此后，不同來(lái)源的菌株開(kāi)始不斷被關(guān)注，尋找新的產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株及不同類型的褐藻膠裂解酶成為該領(lǐng)域的研究方向。近年來(lái)，諸多研究者從海洋藻類及土壤中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株，并從馬尾藻、巨藻、海帶等大型海藻資源中得到了假交替單孢菌PseudoalteromonasQZ-4[13]、嗜鹽白蟻菌屬IsoptericolaWX[14]、Cobetiasp.WG-007[15]、黃桿菌Flavobacteriumsp.LXA[16]、Flavobacteriumsp.S20和假單胞菌Pseudomonassp.E03[17]、芽孢桿菌BacillusweihaiensisAlg07[18]、產(chǎn)微球莖菌Microbulbifersp.6532A[19]等，但大部分菌株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的活力低、發(fā)酵周期長(zhǎng)，從而無(wú)法使產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株應(yīng)用到實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)中；此外，在海洋軟體動(dòng)物如皺紋盤鮑Haliotisdiscushannai[20]、歐洲大鮑螺Haliotistuberculata[21]、黑斑海兔Aplysiakurodai[22]、短濱螺Littorinabrevicula[23]等肝胰腺組織消化液中也發(fā)現(xiàn)有褐藻膠裂解酶蛋白。與來(lái)源于微生物的褐藻膠裂解酶相比，海洋軟體動(dòng)物受其生存環(huán)境及自身?xiàng)l件的影響，其分泌得到的褐藻膠裂解酶存在活性低、含量少、專一性差且不穩(wěn)定等缺陷，不適用于工業(yè)生產(chǎn)[13]。因此，在實(shí)際研究中篩選得到高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的微生物菌株具有更高使用價(jià)值。

皺紋盤鮑Haliotisdiscushannai作為植食性海洋軟體動(dòng)物以海藻等藻類植物為主要食物，其腸道中極有可能存在與消化酶共同參與褐藻膠消化及吸收的微生物菌群，而從皺紋盤鮑的腸道中篩選得到高效產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本試驗(yàn)中，以皺紋盤鮑腸道內(nèi)容物作為研究對(duì)象，從中篩選高效產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株，并通過(guò)觀察菌株菌落形態(tài)及采用16S rRNA分子技術(shù)對(duì)所得菌種進(jìn)行鑒定，然后用單因素試驗(yàn)優(yōu)化菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件，通過(guò)響應(yīng)面法確定最佳的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基成分，以期為開(kāi)發(fā)高效產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株提供技術(shù)支撐，豐富海洋微生物酶資源，促進(jìn)海洋資源的開(kāi)發(fā)及商業(yè)化應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品及藥品 皺紋盤鮑及內(nèi)臟樣品采集于上海市浦東新區(qū)蘆潮港鎮(zhèn)水產(chǎn)交易市場(chǎng)；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；海藻酸鈉、蛋白胨、酵母粉、麥芽糖等(分析純)購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.2 儀器與設(shè)備 試驗(yàn)用儀器主要有GHP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；pHS-3C型pH計(jì)(上海精密儀器有限公司)；A300型梯度PCR儀[杭州朗基科學(xué)儀器有限公司(LongGene)]；H2050型冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；UV-2000型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)UNICO公司)；S-3400N型掃描電子顯微鏡[天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司]。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)富集培養(yǎng)基(g/L)：海藻酸鈉 5.0 g、蛋白胨 2.0 g、葡萄糖 1.0 g，加入過(guò)濾后海水 1.0 L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至7.2。

(2)篩選培養(yǎng)基(g/L)：海藻酸鈉 5.0 g、(NH4)2SO45.0 g、CaCl20.1 g、瓊脂粉12.0 g，加入過(guò)濾后海水1.0 L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至7.2。

(3) 液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：海藻酸鈉 5.0 g、K2HPO42.0 g、(NH4)2SO45.0 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、MgSO4·7H2O 2.0 g，NaCl 10.0 g，加入蒸餾水1.0 L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至7.2。種子培養(yǎng)基與液體發(fā)酵培養(yǎng)基為同一培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1 產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選 取5.0 g鮮活皺紋盤鮑腸道內(nèi)容物作為試驗(yàn)樣品，加入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中，于30 ℃條件下富集培養(yǎng)48 h，將富集后的樣品進(jìn)行無(wú)菌均質(zhì)5 min (頻率為10次/s)，梯度稀釋至10-6，取各梯度下樣品100 μL涂布于以海藻酸鈉為唯一碳源的選擇性固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃ 下恒溫培養(yǎng)48 h，待平板長(zhǎng)出菌落后，依據(jù)單菌落周圍形成透明圈的大小，判斷菌株降解褐藻膠能力大小。此過(guò)程可初步分離得到產(chǎn)褐藻膠裂解酶的疑似菌株。將所得菌株進(jìn)一步于平板劃線分離純化3次，得到的產(chǎn)褐藻膠裂解酶典型單菌落，分別接種于種子液培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h后，以1.5%的接種量接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，30 ℃下以120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)36 h，將菌體發(fā)酵液在4 ℃條件下，以12 000 r/min離心20 min，然后取其上清液，用無(wú)菌0.22 μm濾膜過(guò)濾，得到無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，檢測(cè)產(chǎn)酶活力大小，選擇比酶活力(U/mg)最高的菌株作為后續(xù)試驗(yàn)菌株。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 以牛血清白蛋白配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用改良Lowry法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定[24]。

1.2.3 酶活力的測(cè)定 褐藻膠裂解酶能作用于褐藻膠產(chǎn)生不飽和低聚糖醛酸，在波長(zhǎng)為235 nm條件下有強(qiáng)烈吸收峰，可依據(jù)吸光值大小來(lái)確定酶活力[25]。取0.1 mL發(fā)酵上清液與2.9 mL質(zhì)量濃度為2 g/L的海藻酸鈉溶液(0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.2)混合均勻，30 ℃下水浴反應(yīng)20 min后，以滅活的酶液添加相同體積的反應(yīng)底物作為空白對(duì)照，設(shè)3組平行試驗(yàn)，用紫外分光光度計(jì)于235 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定其吸光值。

酶活力單位定義為：1 mL酶液在30 ℃恒溫條件下，每分鐘裂解海藻酸鈉反應(yīng)底物，使其吸光度值增加0.01為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 菌種的鑒定

(1)菌株菌落形態(tài)觀察。以篩選的固體培養(yǎng)基在30 ℃下培養(yǎng)48 h后，觀察平板上菌落形態(tài)，利用掃描電鏡觀察菌株形態(tài)特征及鞭毛著生情況，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定。

(2)16S rRNA分子鑒定[26]。以提取菌株的總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，-20 ℃下保存，送樣測(cè)序。

將得到的測(cè)序結(jié)果與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST對(duì)比，并在EzBioCloud網(wǎng)站上找出與之同源性接近的不同菌株序列，應(yīng)用CLUSTAL、MEGA 5.0等軟件進(jìn)行聚類與同源性分析[27]。遵循鄰接法(Neighbor-Joining method)和最大相似法(Maximum Likelihood method)原則，并通過(guò)自舉分析(boostrap)進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉數(shù)據(jù)集為1000次，構(gòu)建分支系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 以初始發(fā)酵培養(yǎng)基作為菌株SS-1的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)化結(jié)果用于后續(xù)試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)中，通過(guò)單一控制變量原則，選擇以不同的培養(yǎng)溫度(25、30、35、40、45 ℃)、初始pH(5.2、5.7、6.2、6.7、7.2、7.7、8.2、8.7)、接種量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)和搖床轉(zhuǎn)速(120、140、160、180、200、220 r/min)進(jìn)行考察，以檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下菌株的生物量及產(chǎn)酶活力大小，確定該菌株的最佳產(chǎn)酶條件。所有試驗(yàn)均設(shè)3組平行。

1.2.6 菌株生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶曲線的繪制 在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種3次傳代后的菌株SS-1，在優(yōu)化培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、接種量和搖床轉(zhuǎn)速等單因素基礎(chǔ)上，選擇最佳的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，在菌株生長(zhǎng)過(guò)程中以每間隔4 h取樣一次，測(cè)定發(fā)酵液的OD600 nm及酶活力值大小，繪制出菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線。

1.2.7 采用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成

(1)Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單一控制變量來(lái)考察不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株SS-1產(chǎn)酶活力的影響，將其中具有顯著性影響的因素作為后續(xù)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素變量。

依據(jù)菌株SS-1的生長(zhǎng)產(chǎn)酶特點(diǎn)，對(duì)影響菌株SS-1產(chǎn)酶活力培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，主要對(duì)碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽3種營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行考察，采用PB法設(shè)計(jì)11因素2水平試驗(yàn)，以測(cè)定出的酶活力值作為試驗(yàn)的響應(yīng)值，篩選出影響菌株產(chǎn)酶活力的主效因素，試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的高水平(+1)和低水平(-1)的濃度選擇是依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果中的最優(yōu)值進(jìn)行選擇，設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及編碼見(jiàn)表1，按照“1.2.3”

節(jié)的試驗(yàn)方法進(jìn)行產(chǎn)酶活力的測(cè)定。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及因素水平Tab.1 Factors and levels of Plackett-Burman design

(2)最陡爬坡試驗(yàn)。由PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析得到了影響菌株SS-1產(chǎn)酶活力(U/mL)的顯著性因素，由各因素的P值大小來(lái)判斷模型及各個(gè)因素的顯著性水平，以P<0.05表示模型或因素有顯著性影響，P<0.01表示模型或因素有極顯著性影響，通過(guò)P值大小篩選出影響菌株SS-1產(chǎn)酶活力的顯著因素，依據(jù)其顯著性因素的正負(fù)效應(yīng)及酶活力變化來(lái)確定爬坡試驗(yàn)的方向，以各因素的效應(yīng)值大小來(lái)確定變化步長(zhǎng)，可更快速、經(jīng)濟(jì)地逼近試驗(yàn)最佳區(qū)域。

(3)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用二次回歸的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，由PB試驗(yàn)確定的顯著因素作為設(shè)計(jì)因素，在最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上確定最優(yōu)水平作為中心水平，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)(BBD)方法，通過(guò)菌株SS-1的產(chǎn)酶活力最佳值作為響應(yīng)值，利用Desigen Expert 8.05軟件選擇N=17的中心組合方案，設(shè)計(jì)3因素3水平的試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，將所得結(jié)果利用分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，獲得二次回歸方程模型進(jìn)行可行性和方差分析，確定最佳培養(yǎng)基配方，并進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及因素水平Tab.2 Factors and levels of Box-Behnken design g/L

2 結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選

通過(guò)初篩條件將海藻酸鈉作為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，從鮑魚腸道內(nèi)容物中篩選出了8株產(chǎn)胞外褐藻膠裂解酶菌株(分別編號(hào)為A、B、C、K、L、M、SS-1、Y)，通過(guò)振蕩搖床發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定不同菌株發(fā)酵上清液的酶活力大小及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如表3所示。其中，SS-1編號(hào)菌株的比酶活力最高，且經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)后，其遺傳穩(wěn)定性及產(chǎn)酶活力穩(wěn)定，將此菌株作為目標(biāo)菌株，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究。

表3 不同菌株產(chǎn)褐藻膠裂解酶活力、蛋白質(zhì)濃度和比酶活力大小比較Tab.3 The alginate lyase activity, protein concentration and enzyme specific activity in different strains

2.2菌種的鑒定

菌株SS-1在初篩平板上培養(yǎng)48 h后，菌體周圍產(chǎn)生明顯水解透明圈，單菌落呈不透明圓形，顏色微白泛淡黃色，直徑約2 mm，邊緣整齊、表面光滑、濕潤(rùn)，稍有隆起，革蘭氏染色顯示為陰性菌。在掃描電子顯微鏡放大倍數(shù)為15 000倍下觀察，結(jié)果如圖1所示，該菌株呈長(zhǎng)彎桿狀，無(wú)鞭毛，無(wú)孢子形成，具有典型弧菌形態(tài)特征，根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步鑒定為弧菌。

通過(guò)分子生物學(xué)手段，測(cè)得菌株SS-1的16S rRNA基因序列為1456 bp(GenBank 登錄號(hào)：KX266239)，經(jīng)過(guò)序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其16S rRNA與弧菌屬菌株的相似性最高，為99%，依據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚類分析，與Vibriosp.SA2在同一分支上(圖2)，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征觀察，故將其鑒定為Vibriosp.屬，并命名為Vibriosp.SS-1。

圖1 菌株SS-1掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 Scanning electron micrographs of strain SS-1

圖2 菌株SS-1的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of bacterial strain SS-1

2.3菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.3.1 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 從圖3可見(jiàn)，溫度直接影響菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶，菌株SS-1產(chǎn)酶在溫度為30 ℃時(shí)其產(chǎn)酶活力和菌體生物量均達(dá)到最大值，因此，菌株SS-1產(chǎn)酶的最適溫度為30 ℃。與Fu等[27]報(bào)道的海洋環(huán)境中產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的最適生長(zhǎng)溫度范圍為25～30 ℃的結(jié)論相吻合。

圖3 溫度對(duì)菌株SS-1生長(zhǎng)及酶活力的影響Fig 3 Effect of temperature on growth and enzyme activity of strain SS-1

2.3.2 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 從圖4可見(jiàn)：隨著pH值的增加，菌株SS-1的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶均呈先增高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)pH值達(dá)到7.0～7.5時(shí)，菌株產(chǎn)酶活力較高，當(dāng)pH值為7.2時(shí)產(chǎn)酶達(dá)到最大值，而過(guò)高或過(guò)低的pH值直接影響到細(xì)胞膜的電位變化，并控制菌株的代謝過(guò)程，均不利于菌株SS-1的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。因此，該菌株最佳產(chǎn)酶條件的初始pH值為7.2。

圖4 pH對(duì)菌株SS-1生長(zhǎng)及酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on growth and enzyme activity of strain SS-1

2.3.3 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 從圖5可見(jiàn)：隨著接種量的增加，菌株SS-1的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)性；接種量為1.5%時(shí)，菌株生物量達(dá)最大值，當(dāng)接種量繼續(xù)增加時(shí)，菌株生物量反而有所降低且對(duì)酶活力影響不明顯。故綜合考慮，該菌株產(chǎn)酶的最佳接種量為1.5%。

圖5 接種量對(duì)菌株SS-1生長(zhǎng)及酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum concentration on growth and enzyme activity of strain SS-1

2.3.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響 從圖6可見(jiàn)：隨著搖床轉(zhuǎn)速的不斷增加，菌株的生物量也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到220 r/min時(shí)，菌株的生長(zhǎng)逐漸趨于穩(wěn)定，同時(shí)可以看出，搖床轉(zhuǎn)速的改變對(duì)其產(chǎn)酶活力并無(wú)較大影響。分析其原因，可能在于搖床轉(zhuǎn)速的增加有助于培養(yǎng)基中溶氧量的提高，從而使得菌株生長(zhǎng)快速，但轉(zhuǎn)速的改變對(duì)其產(chǎn)酶活力并無(wú)較大影響。魏丹等[14]在探究IsoptericolahalotoleransWX的產(chǎn)酶條件時(shí)也呈現(xiàn)出了類似規(guī)律。結(jié)合實(shí)際情況，后續(xù)試驗(yàn)選擇搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min作為發(fā)酵條件。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株SS-1生長(zhǎng)及酶活力的影響Fig.6 Effect of rotate speed on growth and enzyme activity of strain SS-1

2.3.5 菌株SS-1的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶曲線 從圖7可見(jiàn)：菌體的生長(zhǎng)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在28 h后開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，菌株生物量接近最大值，此時(shí)酶活力達(dá)到最高值，為38.6 U/mL，與已報(bào)道的弧菌Vibriosp.YKW-34[28]、Vibriosp.QY107[29]等菌株相比較，菌株SS-1的發(fā)酵產(chǎn)酶周期更短，生產(chǎn)速度較快，在工業(yè)化生產(chǎn)中，極大縮短了發(fā)酵時(shí)間，從而降低了雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)約了經(jīng)濟(jì)成本，具有較大的優(yōu)勢(shì)。

圖7 菌株SS-1的生長(zhǎng)曲線及發(fā)酵酶活力曲線Fig.7 Growth curve and enzyme activity of of strain SS-1

2.4響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基的結(jié)果

表4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Tab.4 The design and response values in Plackett-Bueman experiment

注：表中α1、α2、 α3為試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的3個(gè)虛擬因子
Note:the α1, α2and α3are three virtual factors in designs of the test

表5 各因素對(duì)響應(yīng)值的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Significance testing results of all factors

注：**表示對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響(P<0.01)，*表示對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響(P<0.05)，下同
Note:**means very significant influence on the results of the experiment (P<0.01), * means significant influence on the results of the experiment (P<0.05), et sequentia

2.4.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果 由PB試驗(yàn)擬合的一階回歸方程可知，麥芽糖、酵母粉和磷酸氫二鉀的系數(shù)均為正值，說(shuō)明這3個(gè)因素對(duì)菌株SS-1的產(chǎn)酶影響具有正效應(yīng)，因此，依據(jù)步長(zhǎng)以PB試驗(yàn)中的零水平開(kāi)始沿著這3因素增大的方向移動(dòng)，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)。由表6可見(jiàn)：當(dāng)麥芽糖為10.0 g/L、酵母粉為15.0 g/L、磷酸氫二鉀為1.50 g/L時(shí)，菌株SS-1的產(chǎn)酶活力達(dá)到最高(200.1 U/mL)，因此，將第5組水平作為中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)(BBD)的中心點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.6 Design and results of steepest ascent experiment

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)編碼表及響應(yīng)值Tab.7 Design code table and response values of Box-Behnken experiment

利用Design-Expert 8.05軟件對(duì)回歸方程中的X1X2、X1X3、X2X3繪制響應(yīng)面分析圖，得到3因素交互作用的曲面圖(圖8～圖10)?？梢钥闯?，3因素交互作用的曲面圖均為開(kāi)口向下的凸型曲面，有極大值點(diǎn)，說(shuō)明試驗(yàn)存在最大酶活力點(diǎn)。比較圖8和圖9可以看出，圖8響應(yīng)面陡峭程度最高，這說(shuō)明麥芽糖和酵母粉的交互作用對(duì)菌株SS-1的產(chǎn)酶活力影響最為顯著。圖10直觀顯示出了酵母粉與磷酸氫二鉀兩者對(duì)菌株SS-1的產(chǎn)酶活力也有較大影響。分析可能的原因是麥芽糖及酵母粉作為菌株生長(zhǎng)中不可或缺的碳源及氮源，兩者的比例直接影響著菌株Vibriosp.SS-1的代謝過(guò)程，其代謝產(chǎn)物的積累與酶活力存在顯著相關(guān)，磷酸氫二鉀作為無(wú)機(jī)鹽成分，主要是為其生長(zhǎng)環(huán)境提供一定的緩沖，維持菌株生長(zhǎng)pH的平衡。

圖8 麥芽糖與酵母粉交互作用的響應(yīng)面曲面圖Fig.8 Response surface plots showing the interactivity of both maltose and yeast extract

圖9 麥芽糖與磷酸氫二鉀交互作用的響應(yīng)面曲面圖Fig.9 Response surface plots showing the interactivity of both maltose and K2HPO4

圖10 酵母粉與磷酸氫二鉀交互作用的響應(yīng)面曲面圖Fig.10 Response surface plots showing the interactivity of both yeast extract and K2HPO4

表8 回歸方程的方差分析及參數(shù)估計(jì)Tab.8 Variance analysis and parameter estimation for the regression equation

2.5最佳發(fā)酵條件的驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，對(duì)所得回歸方程進(jìn)行求解，利用Design-Expert 8.05軟件預(yù)測(cè)得到菌株SS-1的最佳產(chǎn)酶條件為麥芽糖11.86 g/L、酵母粉16.72 g/L、磷酸氫二鉀1.36 g/L，其他條件為MgSO4·7H2O 1.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g/L、NaCl 6.75 g/L。設(shè)計(jì)驗(yàn)證試驗(yàn)并設(shè)置5組平行，測(cè)得菌株SS-1的實(shí)際產(chǎn)酶活力值為191.8 U/mL，與理論預(yù)測(cè)值193.04 U/mL的誤差較小，說(shuō)明優(yōu)化后的回歸方程對(duì)預(yù)測(cè)菌株SS-1的產(chǎn)酶活力具有可靠性。

3 討論

3.1產(chǎn)酶菌株SS-1的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

褐藻膠是海洋大型褐藻類植物細(xì)胞壁的主要成分，通過(guò)生物降解可得到具有多種功能活性的褐藻寡糖，包括半乳糖、木糖、糖醛酸、甘露糖等，褐藻膠具有多種功能活性[30]，應(yīng)用價(jià)值極高。褐藻膠裂解酶作為降解褐藻膠的關(guān)鍵酶，對(duì)實(shí)現(xiàn)海洋藻類資源的高值化利用具有重要意義。當(dāng)前能得到的褐藻膠裂解酶菌株種類多、來(lái)源廣，但受到菌株發(fā)酵產(chǎn)酶周期長(zhǎng)、產(chǎn)酶活力低等諸多不利因素的影響[14,18]，褐藻膠裂解酶菌株的工業(yè)化應(yīng)用受到了極大地限制。

本研究中從皺紋鮑魚腸道中篩選得到高效產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株SS-1，經(jīng)16S rRNA鑒定為海洋弧菌Vibriosp.SS-1，該菌最佳產(chǎn)酶周期為28 h，酶活力可達(dá)38.6 U/mL。與Fu等[28]和郭恩文等[29]篩選得到的產(chǎn)酶菌株相比較，本試驗(yàn)中得到的菌株SS-1具有生長(zhǎng)速度快、發(fā)酵時(shí)間短等明顯優(yōu)勢(shì)(圖7)，可為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵褐藻膠制備功能性低聚寡糖提供技術(shù)支撐，并能降低發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)成本。同時(shí)作者通過(guò)對(duì)菌株厭氧培養(yǎng)發(fā)酵表明，該菌在無(wú)氧環(huán)境中也能生長(zhǎng)并分泌褐藻膠裂解酶(該數(shù)據(jù)本文未列出)，與魏丹等[14]和劉旭梅等[15]得到的好氧性產(chǎn)酶菌相比，菌株SS-1還具有一定的極端低氧環(huán)境適應(yīng)性能力，這可能與該菌株來(lái)自于鮑魚腸道低氧環(huán)境有關(guān)，但是具體的調(diào)控機(jī)制還需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行深入分析。

此外，本試驗(yàn)中將菌株SS-1置于以海藻酸鈉作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，收集發(fā)酵液離心后，在上清液中檢測(cè)到大量酶蛋白(表3)，驗(yàn)證了SS-1是產(chǎn)胞外褐藻膠裂解酶菌株，可以實(shí)現(xiàn)褐藻膠的胞外降解。鮑魚等植食性海洋動(dòng)物主要以馬尾藻、海帶、大葉藻等大型海藻及沉積物為食[31]，其體內(nèi)極有可能存在降解褐藻膠的微生物菌群，可以分泌胞外褐藻膠裂解酶，降解褐藻膠為小分子，促進(jìn)腸道吸收，并可因其酶解產(chǎn)物得到的褐藻寡糖提高水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體免疫力[11]。因此，菌株SS-1可作為微生態(tài)制劑的潛在菌株[32]應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。

3.2響應(yīng)面法優(yōu)化菌株SS-1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基

響應(yīng)面分析法作為微生物發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的經(jīng)典方法，比傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)具有更大的優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)中，采用響應(yīng)面法確定了菌株SS-1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，使優(yōu)化后菌株的酶活力達(dá)191.8 U/mL，酶活力比優(yōu)化前提高4.97倍，與李恒等[33]、王霽寧等[34]、嚴(yán)芬等[35]、吳海哥等[36]和劉旭梅等[15]的研究結(jié)果相比，菌株SS-1的酶活力更高。此外，從試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，將菌株SS-1的培養(yǎng)基配方中最佳碳源替換為麥芽糖時(shí)，產(chǎn)酶活力提高(表7)，與劉旭酶等[15]分離的Cobetiasp.WG-007，陳朋等[18]分離的BacillusweihaiensisAlg07，侯士昌等[37]篩選的Alteromonassp.H4為誘導(dǎo)酶產(chǎn)生菌相比，菌株SS-1可不受誘導(dǎo)底物限制，從而更具產(chǎn)褐藻膠裂解酶優(yōu)勢(shì)。但本試驗(yàn)中僅以搖瓶培養(yǎng)作為發(fā)酵條件，未經(jīng)過(guò)大批量放大培養(yǎng)驗(yàn)證，后續(xù)會(huì)選擇發(fā)酵罐模擬工業(yè)發(fā)酵條件進(jìn)一步確定菌株SS-1的工業(yè)參數(shù)，為工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。此外，關(guān)于酶學(xué)性質(zhì)及酶底物專一性還需深入研究，以便更好地實(shí)現(xiàn)褐藻膠裂解酶的商業(yè)化應(yīng)用。

綜上所述，菌株SS-1可以作為一株具有潛在應(yīng)用價(jià)值的高效產(chǎn)褐藻膠裂解酶的新菌株培養(yǎng)，為實(shí)現(xiàn)褐藻寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供新酶源微生物資源，使其成為以藻類為食的海洋動(dòng)物養(yǎng)殖用飼料的潛在微生態(tài)添加劑，為促進(jìn)海洋資源的深加工利用發(fā)揮作用。

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Screeningofalginatelyase-producingmicroorganismsandoptimizationoffermentationconditionsindiscabalone

LI Yun-tao1, WANG Li-ping1,2, ZHANG Meng1, ZHANG Yu1

(1. Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Engineering Research Center of Food Thermal-processing Technology, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

A bacterial strain producing alginate lyase named SS-1 was isolated from intestine of disc abaloneHaliotisdiscushannaiusing sodium alginate as the sole carbon source on agar medium by transparent circle method, and initially identified asVibriosp. by morphological observation and 16S rRNA gene sequence analysis in order to screen biodegradable alginate lyase microbial strain. The best fermentation of SS-1 producng the aximal activity of alginate enzyme was observed under conditions of 30 ℃, initial pH 7.2 with activity of about 38.6 U/mL in 28 h. The optimization by a response surface methodology revealed that the optimal fermentation medium of SS-1 was comprised of maltose 11.86 g/L, yeast extract 16.72 g/L, K2HPO41.36 g/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, FeSO4·7H2O 0.1 g/L, and NaCl 6.75 g/L. The supernatant of strain SS-1 had activity of 191.8 U/mL in optimized medium, 4.97 times higher compared with the basic medium, indicating that strain SS-1 is of a potential strain for alginate-derived oligosaccharide (ADO) industrial fermentation.

alginate lyase; alginate-derived oligosaccharide; marineVibrio; screening and identification; response surface methodology

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.05.012

2095-1388(2017)05-0574-10

Q815

A

2017-02-23

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)工程中心建設(shè)項(xiàng)目(11DZ2280300)

李云濤(1991—)，男，碩士研究生。 E-mail：1176452076@qq.com

汪立平(1968—)，女，博士，副教授。 E-mail：lpwang@shou.edu.cn