免疫防御酶類：海洋動物L-氨基酸氧化酶的研究進展

侯玉林，高延奇，金士博,李安興，黎睿君

(1.大連海洋大學 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,大連市海珍品疾病防控重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.中山大學 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室, 水產(chǎn)品安全教育部重點實驗室, 廣東 廣州 510275)

免疫防御酶類：海洋動物L-氨基酸氧化酶的研究進展

侯玉林1，高延奇1，金士博1,李安興2，黎睿君1

(1.大連海洋大學 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,大連市海珍品疾病防控重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.中山大學 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室, 水產(chǎn)品安全教育部重點實驗室, 廣東 廣州 510275)

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，LAAO)是一類以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黃素單核苷酸(FMN)為輔酶的黃素蛋白酶, 該酶具有明顯的抑菌、抗病毒、殺滅寄生蟲、誘導細胞凋亡和細胞毒性等生物學功能。LAAO在自然界分布廣泛，以有關蛇毒源LAAO研究最為深入，但有關海洋動物LAAO的報道與研究尚處于起步階段。本研究中對海洋動物LAAO的結(jié)構特征、相對分子質(zhì)量、等電點、氧化催化特異性、熱穩(wěn)定性、組織分布、生物學功能和異源表達等方面進行綜述，旨在為后續(xù)海洋動物LAAO的進一步研究提供參考。

L-氨基酸氧化酶(LAAO)；海洋動物；理化特性；生物學功能；組織分布；異源表達

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，LAAO)是一類以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黃素單核苷酸(FMN)為輔酶的黃素蛋白酶,該酶能夠立體特異性催化L-氨基酸氧化脫氨生成α-酮酸、氨和H2O2[1-2]。研究表明，LAAO具有抗病毒、抗細菌、抗真菌、殺寄生蟲和抗腫瘤等生物學功能[3-8]。在自然界中LAAO分布廣泛，細菌、真菌、藻類、蛇類、魚類和哺乳動物類中均已有報道[5,9-12]，其中，對蛇毒源LAAO的研究最為深入。目前，已發(fā)現(xiàn)海洋動物LAAO具有抑制細菌的生長、殺滅病原寄生蟲和誘導腫瘤細胞凋亡的生物學功能(表1)。Nagashima等[13]報道，從許氏平鮋Sebastesschlegeli黏液中分離純化出的LAAO，對殺鮭氣單胞菌Aeromonassalraonicida、美人魚發(fā)光桿菌Photobacteriumdamselae和腐敗希瓦氏菌Shewanellaputrefaciens等革蘭氏陰性細菌具有顯著的抑制作用；Wang等[14]研究表明，從黃斑藍子魚Siganusoramin血清中分離的LAAO對刺激隱核蟲Cryptocaryonirritans、多子小瓜蟲Ichthyophthiriusmultifiliis、布氏錐蟲Trypanosomabrucei具有強烈的殺滅作用；Iijima等[15]報道，從截尾海兔Dolabellaauricularia蛋白腺分泌物中純化到的LAAO可誘使小鼠淋巴瘤細胞EL-4凋亡，推測其具有抗腫瘤作用。本研究中，綜述了目前有關海洋動物LAAO的研究進展，并對存在問題及后續(xù)研究進行了展望，旨在為海洋動物源LAAO的深入研究提供參考。

1 海洋動物LAAO的基本特征

1.1結(jié)構特征、分子質(zhì)量和等電點

LAAO多由兩個非共價結(jié)合的亞基組成，亞基相對分子質(zhì)量范圍為52 000～85 000，如許氏平鮋黏液LAAO為同源二聚體結(jié)構，亞基相對分子質(zhì)量為53 000[16]。對三聚體和四聚體結(jié)構的海洋動物LAAO也有報道，如黑斑海兔Aplysiakurodai卵的勻漿液上清中分離出由3個不同亞基組成的LAAO，相對分子質(zhì)量為250 000[17]；用蛋白質(zhì)譜分析黃斑藍子魚LAAO的單體相對分子質(zhì)量約為61 700，非變性凝膠電泳的結(jié)果顯示其為同源四聚體結(jié)構[14]。研究表明，海洋動物LAAO具有3個結(jié)構域:FAD結(jié)合域、底物結(jié)合域和螺旋域[2,11-12]，從斑點海兔Aplysiapunctata墨汁、大西洋鱈魚Gadusmorhua黏液中分離的LAAO證實了其單體結(jié)構中具有輔酶FAD及FAD結(jié)合域[18-19]。海洋動物LAAO的相對分子質(zhì)量范圍在93 000～150 000[12]，關于其晶體結(jié)構的報道匱乏。目前的研究中海洋動物LAAO等電點在4.0～6.2之間[13-14,18-20]，偏酸性。

表1 海洋動物LAAO的組織分布及主要生物學功能Tab.1 Tissue distribution and principal biological functions of L-amino acid oxidase isolated from marine animals

1.2氧化催化特異性

L-氨基酸氧化酶在自然界分布較為廣泛，不同物種來源的LAAO催化底物范圍具有差異，關于海洋動物LAAO的氧化催化活性機制有待進一步驗證和深入研究。已有調(diào)查表明，海洋動物LAAO對氨基酸的氧化催化活性譜較窄，如從許氏平鮋黏液[13]和加州海兔Aplysiacalifornica墨汁[20]中分離出的LAAO只檢測到對L-賴氨酸具有氧化催化活性；從斑點海兔墨汁中分離出的LAAO[19]只對L-賴氨酸和L-精氨酸具有氧化催化特異性。

1.3熱穩(wěn)定性

海洋動物LAAO能夠在較廣的溫度范圍內(nèi)保持活性，當環(huán)境溫度超過其閾值上升時，酶的活性隨之下降。研究表明，斑點海兔LAAO保持活力穩(wěn)定的溫度范圍為0～50 ℃，當溫度升至60 ℃時，酶活性減少80%，溫度達到70 ℃時該酶失去活性[19]。此外，部分海洋動物LAAO在室溫下亦可保持較長時間的生物學活性。Yang等[20]從加州海兔墨汁中純化出的LAAO室溫存放5個月后依然保持其抑菌能力。

2 海洋動物LAAO的組織分布

海洋動物LAAO集中分布在生物體的皮膚、鰓、脾臟和腎臟中。Kitani等[18]利用RT-PCR技術在大西洋鱈魚的皮膚、鰓、脾臟和頭腎中檢測到陽性信號，而在肌肉、胃、腸道和肝臟中未檢測到LAAO的表達；此外，研究人員同樣采用RT-PCR技術檢測到遲緩愛德華氏菌Edwardsiellatarda感染大西洋鱈魚后，皮膚LAAO基因的表達量提高2倍；鰻弧菌Vibrioanguillarum感染魚體后，鰓、脾臟和頭腎中LAAO基因的表達量提高8倍[18,22]。

海洋動物的黏液在抵抗包括細菌在內(nèi)的病原入侵過程中發(fā)揮了重要作用[22,30-31]，因此，從具有大量黏液的皮膚及鰓組織中分離并最終鑒定為LAAO的報道較多。Kitani等[32]利用LAAO特異性RNA探針進行原位雜交表明，LAAO分布于許氏平鮋表皮的基膜和鰓的上皮組織中；Kasai等[28]通過免疫組織化學在星斑川鰈Platichthysstellatus的鰓組織中檢測到LAAO的特異性表達。

脾臟及腎臟是硬骨魚類的重要免疫器官[33-34]，在二者中均檢測到海洋動物LAAO，這表明海洋動物LAAO與固有免疫應答相關[18,23,26]。

魚類的血清同樣含有抵抗病原入侵的抗菌物質(zhì)[25,35-36],也被證明存在著LAAO，Wang等[23]在黃斑藍子魚血清中分離到一種具有抑菌能力的天然蛋白并鑒定為LAAO。此外，在海洋生物的卵巢及其他分泌物中也鑒定到LAAO的存在。2013年，Kitani等[32]試驗表明，LAAO在許氏平鮋的卵巢中也有微量表達；研究人員從海兔的墨汁、蛋白腺分泌液和卵勻漿液的上清中也可分離到具有生物學活性的LAAO[15,17,28-29]。

3 海洋動物LAAO的生物學功能

3.1抑菌作用及機理

海洋動物LAAO對多種水產(chǎn)病原中常見的革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌均具有抑制作用。許氏平鮋黏液中的LAAO對殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種Photobacteriumdamselaesubsp. piscicida、副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus、嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila具有較強的抑菌作用，最小抑菌濃度(MIC)分別為0.078、0.16、0.63、0.31 μg/mL[16,24]。棘頭床杜父魚Myoxocephaluspolyacanthocephalus黏液中的LAAO具有較寬的抑菌譜，對殺鮭氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)可達到0.02 μg/mL[37-39]。

海洋動物LAAO的抑菌作用依賴于同細菌表面的結(jié)合，這可直接導致細菌表面出現(xiàn)褶皺及孔洞，形態(tài)發(fā)生顯著變化。Kitani等[24]研究表明，許氏平鮋黏液中的LAAO可與美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種結(jié)合，而不與大腸桿菌Escherichiacoli結(jié)合，即大腸桿菌對LAAO表現(xiàn)出不敏感性。Wang等[23]報道，黃斑藍子魚血清中的LAAO可導致金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus表面出現(xiàn)褶皺，大腸桿菌表面出現(xiàn)明顯的孔洞； Kitani等[24]研究表明，許氏平鮋黏液中的LAAO可導致殺鮭氣單胞菌表面出現(xiàn)褶皺，副溶血性弧菌表面產(chǎn)生孔洞，美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種菌體顯著伸長。

海洋動物源LAAO的抑菌作用與H2O2的產(chǎn)生有關。許氏平鮋黏液中的LAAO與H2O2展現(xiàn)出相同的抑菌譜[24]，研究表明，過氧化氫酶可完全抑制許氏平鮋和棘頭床杜父魚黏液中LAAO的抑菌活性[1,6,21]。某些細菌可通過提高抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄水平以抵抗H2O2造成的傷害。Kasai等[40]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌對星斑川鰈LAAO不敏感，進一步研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌編碼谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的基因表達量顯著增高，從而減少了活性氧對細菌的傷害。然而，也有研究指出海洋動物LAAO的抑菌作用不完全依賴于H2O2。Ko等[41]研究表明，加州海兔LAAO的抑菌活性需依賴于H2O2、α-酮酸及其他催化產(chǎn)物，因各組分同等濃度下單獨作用時沒有抑菌能力。

3.2對寄生蟲的殺滅作用

目前，關于海洋動物LAAO殺滅寄生蟲的相關報道較少，其殺滅寄生蟲的作用機制有待進一步研究，截至目前，僅報道過黃斑藍子魚LAAO具有殺滅寄生蟲的生物學功能。研究表明，黃斑藍子魚血清中分離的LAAO可導致刺激隱核蟲幼蟲纖毛脫落、大核膨脹崩解、外膜破裂、內(nèi)容物溢出[14,42-43]。此外，黃斑藍子魚的血清對布氏錐蟲Trypanosomabrucei、多子小瓜蟲Ichthyophthiriusmultifiliis也具有強烈的殺滅作用，其中，對布氏錐蟲的最小殺蟲血清濃度為1.5%[23]。與此相似，研究較為深入的蛇毒源LAAO同樣具有殺滅寄生蟲的功能，如從蝮蛇Bothropsjararaca毒液中分離到的LAAO對同屬錐蟲科Trypanosomatid 的利什曼原蟲Leishmaniaamazonensis具有殺滅作用[8]。

3.3抗腫瘤作用及機理

海洋動物源LAAO具有潛在的抗腫瘤生物學功能，它在體外可直接殺死腫瘤細胞及參與誘導腫瘤細胞的凋亡，甚至可以延長腹水中攜帶大量腫瘤細胞小鼠的生命。Butzke等[19]從斑點海兔墨汁中分離到的LAAO可在6～8 h內(nèi)殺死腫瘤細胞Jurkat T；從黑斑海兔卵勻漿液上清中純化得到的LAAO可在2～114 ng/mL的濃度下裂解殺死多種鼠源、人源腫瘤細胞，研究表明，對腹水中含有1×106cells MM46腫瘤細胞的C3H/He小鼠腹腔注射LAAO后，小鼠生命得到顯著延長，其中注射0.4、2單位LAAO的小鼠存活時間超過200 d[17,29]。Iijima等[15]研究顯示，截尾海兔蛋白腺分泌物中的LAAO可誘導鼠T淋巴細胞瘤細胞EL-4的凋亡。研究人員發(fā)現(xiàn)，當異尖線蟲Anisakissimplex幼蟲感染鮐魚Chubmackerel后，在感染部位形成的囊腔中純化出的LAAO，以20 ng/mL的濃度與人早幼粒白血病細胞HL-60共孵育24 h可完全殺死腫瘤細胞，通過細胞核染色、流式細胞術等方法檢測到了細胞凋亡的顯著特征[27]。

海洋動物LAAO抗腫瘤的生物學活性與其催化產(chǎn)物H2O2有著較大的關系，高濃度的H2O2突破了腫瘤細胞抗氧化能力的極限，如斑點海兔墨汁中的LAAO通過特異性催化L-賴氨酸和L-精氨酸氧化脫氨產(chǎn)生H2O2，從而導致了 Jurkat T細胞的死亡[19]。進一步地研究表明，海洋動物LAAO具有不依賴于H2O2而誘導細胞凋亡的途徑。當添加高劑量的H2O2酶時，截尾海兔墨汁中的LAAO對腫瘤細胞EL-4的毒性僅部分受到抑制，腫瘤細胞依然存在著凋亡的顯著特征，如DNA的碎裂和Caspase 3活性的提高[15,44-45]。

4 海洋動物LAAO異源表達

LAAO具有多種生物學功能，具有廣闊的應用前景，因此，針對該酶的異源表達研究一直是該領域的熱點與難點。目前，已報道的海洋動物LAAO的異源表達可通過大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)，表達產(chǎn)物具有與野生型相近的生物學功能。Yang等[20]實現(xiàn)了加州海兔墨汁LAAO在大腸桿菌工程菌株的異源表達，重組蛋白對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，但其抑菌活性僅為野生型的1/3；Li等[46]選取畢赤酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)了黃斑藍子魚血清LAAO的異源表達，重組蛋白對多種革蘭氏陰性細菌及革蘭氏陽性細菌具有抑制作用，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，細菌經(jīng)重組蛋白處理后表面變得粗糙并有顆粒附著，細胞壁皺縮，細胞膜出現(xiàn)破裂。此外，重組蛋白的抑菌活性可受到H2O2酶的抑制，其廣譜抗菌活性與過氧化氫有關；近期Kasai等[40]同樣利用畢赤酵母表達系統(tǒng)重組表達了星斑川鰈黏液中的LAAO，重組蛋白可顯著抑制葡萄球菌屬Staphylococci和耶爾森氏菌屬Yersinia細菌的生長，其中表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis對重組蛋白最為敏感，其最小抑菌濃度(MIC)為0.078 μg/mL。此外，Li等[47]研究表明，經(jīng)大腸桿菌重組表達的黃斑藍子魚血清中的LAAO，體外復性后可誘導刺激隱核蟲幼蟲裂解死亡，具有與野生型相近的殺滅寄生蟲活性，但重組蛋白的活性較低。目前，關于海洋動物LAAO表達產(chǎn)物抗腫瘤的生物學活性還未見報道。

5 問題與展望

LAAO在自然界中分布廣泛，作為蛇毒源的重要組成部分，研究多集中在蛇毒源LAAO的生物學活性尤其是抗腫瘤方面[48-50]。國內(nèi)外對海洋動物LAAO的研究相對較少，為此仍需開展大量基礎研究工作，比如更多的海洋動物LAAO分離及鑒定、晶體結(jié)構的掌握、更為具體的熱穩(wěn)定性研究，以及深入的氨基酸催化活性探究等。不同來源的海洋動物LAAO具有不同的生物學活性。研究表明，多數(shù)海洋動物黏液中的LAAO具有抑菌作用[18,28]，海兔墨汁中的LAAO具有抗腫瘤作用[19,20]，某些硬骨魚類血清中的LAAO具有殺寄生蟲的生物學功能[14]，為此，關于海洋動物LAAO組織分布與其生物學活性的關系需深入總結(jié)和探討，推測LAAO在海洋動物的非特異性免疫中發(fā)揮了重要作用。海洋動物源LAAO具有廣泛的生物學功能，這些功能目前多數(shù)被認為同蛇毒源LAAO類似，均在較大程度上依賴于氧化催化產(chǎn)物H2O2[2,12]，本研究中所提到的其他特殊作用機制仍有待揭示。

作為潛在的新型抗菌、殺寄生蟲和抗腫瘤藥物的研發(fā)對象，海洋動物LAAO的成功異源表達是其必須攻克的難關。目前，常用的表達系統(tǒng)主要包括原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)和昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)[51]，其中原核表達系統(tǒng)雖然表達效率高、周期短，但表達產(chǎn)物經(jīng)常發(fā)生錯誤的折疊并聚集成包涵體[52-53]；酵母表達系統(tǒng)能夠進行特定的翻譯后修飾但表達量較低[54]；截至目前，利用哺乳動物及昆蟲細胞表達系統(tǒng)對海洋動物LAAO體外重組表達未見報道。因此，選用合適的表達系統(tǒng)開展海洋動物LAAO的異源表達并對表達產(chǎn)物的功能進行探究，必將是未來該領域研究的熱點之一。

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L-aminoacidoxidaseasanenzymerelatedtoinnateimmunedefenseinmarineanimals:researchprogress

HOU Yu-lin1, GAO Yan-qi1, JIN Shi-bo1, LI An-xing2,LI Rui-jun1

(1.Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Valuable Sea Food Disease Prevention and Control in Dalian, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2.Key Laboratory for Aquatic Products Safety, Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol of Harmful Organisms and Resourse Utilization,Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

L-amino acid oxidase (LAAO) as a family of flavoproteins protease containing coenzymes FAD or FMN has been reported to have significant biological functions including antiviral, antibacterial, antifungal, anti-parasitic and anti-tumor activities. So far, LAAO is widely found in nature and has been investigated intensively, especially snake venom LAAO. However, the LAAO isolated from marine animals was few reported. In this paper, structural features, molecular weight, pI value, catalytic specificity, storage stability, distribution, biological functions and heterologous expression of LAAO in marine animals are summarized to provide basic references for further study on LAAO in marine animals.

L-amino acid oxidase (LAAO); marine animal; physico-chemical property; biological function; tissue distribution; heterologous expression

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.05.019

2095-1388(2017)05-0625-06

S917.4

A

2017-02-22

遼寧省教育廳一般項目(L2015077)；遼寧省博士科研啟動基金資助項目(201601287)；大連海洋大學博士科研啟動基金資助項目(HDYJ201617)

侯玉林(1994—)，男，碩士研究生。E-mail:houyulin22@163.com

黎睿君(1986—)，男，博士，講師。E-mail:liruijun@dlou.edu.cn