液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿液中7種有機(jī)磷酸酯代謝物

李 佩 曾祥英 崔君濤 趙靈娟 于志強(qiáng)*

1(中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所， 有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省環(huán)境資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510640)2(中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿液中7種有機(jī)磷酸酯代謝物

李 佩1,2曾祥英1崔君濤1,2趙靈娟1于志強(qiáng)*1

1(中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所， 有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省環(huán)境資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510640)2(中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

利用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)，建立了人尿液中7種有機(jī)磷酸酯代謝產(chǎn)物-有機(jī)磷酸二酯的檢測方法。針對不同理化性質(zhì)的有機(jī)磷酸二酯，采用固相萃取技術(shù)進(jìn)行富集凈化，篩選出高效的固相萃取柱，并對其洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化; 同時(shí)，對流動(dòng)相和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲取用于各代謝產(chǎn)物定性與定量分析的特征離子對。研究結(jié)果表明，前處理采用Oasis WAX固相萃取柱富集、2 mL含5%氨水的甲醇和2 mL甲醇洗脫目標(biāo)物，除磷酸二乙酯(DEP，17.8%～36.2%)外，其余目標(biāo)化合物回收率均在60.5%～104.0%之間。在優(yōu)化的液相色譜條件下，7種化合物可達(dá)到完全基線分離。7種有機(jī)磷酸二酯的檢測限和定量限分別在0.005～0.2 μg/L和0.02～0.5 μg/L之間，日內(nèi)和日間精密度結(jié)果(RSD≤15.4%)表明，本方法具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。本方法用于普通人群尿液中有機(jī)磷酸二酯的檢測，7種化合物在尿液中均有檢出，總濃度在0.5～6.7 μg/L之間。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜; 有機(jī)磷酸酯; 尿液; 代謝產(chǎn)物

2017-06-21收稿；2017-07-19接收

本文系國家杰出青年科學(xué)基金(No. 41225013)和中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(B類) (No. XDB14010202)資助

* E-mail: zhiqiang@gig.ac.cn

1 引 言

隨著溴代阻燃劑的逐步禁用，有機(jī)磷酸酯(Organophosphate esters, OPs)作為替代品，近年來其生產(chǎn)和使用量逐步增大[1]。有機(jī)磷酸酯作為阻燃劑、增塑劑以及抗發(fā)泡劑廣泛應(yīng)用于各行業(yè)，如建材、紡織、化工、電子以及石油等行業(yè)[2]。研究顯示，OPs已成為全球性的環(huán)境污染物，在空氣、水、灰塵、土壤、沉積物以及生物體中廣泛分布[3]。毒理研究證實(shí)，OPs具有神經(jīng)毒性、致癌、致畸、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等[4,5]，對人體健康具有潛在的嚴(yán)重危害，因此，亟需開展人體OPs的內(nèi)暴露水平研究，為OPs的健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均表明，OPs脫側(cè)鏈形成磷酸二酯化合物是其在生物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物[6,7]，OPs通過人體代謝之后，主要通過尿液排出體外。因此，測定人體尿液中OPs的二酯代謝物水平，是目前評價(jià)OPs人體內(nèi)暴露水平的主要方法?？傮w來看，OPs的人體內(nèi)暴露研究相對較少，目前主要集中在分析方法的建立和完善上。文獻(xiàn)報(bào)道的OPs二酯代謝物檢測方法主要有兩類，一類是目標(biāo)物衍生化后通過氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(GC-MS/MS)進(jìn)行測定，如Schindler等[8,9]利用固相萃取(SPE)對尿液進(jìn)行初步富集凈化后，通過與五氟芐基溴的反應(yīng)進(jìn)行衍生化，衍生化產(chǎn)物再次進(jìn)行SPE凈化，之后通過GC-MS/MS檢測，該方法前處理較為復(fù)雜，不適合于大批量樣品的檢測。另一類方法是通過液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)進(jìn)行測定。Su等[10]建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測方法，使用電噴霧負(fù)離子源模式進(jìn)行非鹵代磷酸二酯的測定，然后通過重氮甲烷進(jìn)行衍生化，用電噴霧正離子源模式進(jìn)行鹵代磷酸二酯的測定，顯著提高了OPs代謝物的靈敏度。但由于尿液基質(zhì)復(fù)雜，衍生化反應(yīng)需要較高的技術(shù)水平才能確保其穩(wěn)定性。Cequier等[11]建立了超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的直接進(jìn)樣技術(shù)，尿液無需處理，3 min內(nèi)即可完成分析，但基質(zhì)干擾嚴(yán)重，檢測限較高。文獻(xiàn)[12,13]建立了SPE-LC-MS/MS檢測的方法，同時(shí)分析尿液中6種磷酸二酯，尿樣經(jīng)過混合陰離子交換固相萃取柱富集后，可直接進(jìn)儀器分析，減少了樣品前處理步驟。上述方法基本能滿足檢測需求，但仍存在不足，如基質(zhì)干擾大，造成樣品中檢出率低、檢測的代謝產(chǎn)物種類有限等。本研究基于對中國環(huán)境介質(zhì)中OPs污染特征的研究結(jié)果[14,15]，以尿液中7種OPs化合物的二酯代謝物為目標(biāo)物，擬通過SPE小柱的篩選和優(yōu)化，確定前處理富集凈化方法; 同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，建立快速簡捷的分離富集和定量分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

1100型液相色譜儀(LC，美國Agilent公司)； API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(MS/MS，美國AB SCIEX公司); HeraeusTMLabofugeTM200臺式離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司); 12孔固相萃取裝置(美國Supeclo公司); Milli-Q Unique-R10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司); SPE小柱Oasis WAX Extraction Cartridges (60 mg, 3 mL， 美國Waters公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：磷酸二乙酯(DEP)和DBP(美國ChemSevices公司); 磷酸二苯酯(DPhP)、磷酸二(2-氯乙基)酯(BCEP)、磷酸二(2-氯丙基)酯(BCPP)、回收率指示物D10-DPhP、D8-BCEP和D12-酯BCPP(加拿大Toronto Research Chemicals公司); 磷酸二(1,3-二氯異丙基)(BDCPP, 加拿大Wellington公司); 磷酸二芐基酯(DTP，日本Tokyo Chemical Industry公司)。

甲醇(LC級，德國Merck公司); 乙酸(LC級，美國Tedia公司); 氨水(28%～30%)和無水乙酸鈉均購自上海安譜科技公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2尿液樣品采集

尿液樣品委托南方醫(yī)院于2014年10月至2015年7月間收集，所有志愿者均自愿參加并簽署知情同意書，本研究隨機(jī)挑選10例樣本進(jìn)行檢測，對方法進(jìn)行驗(yàn)證。尿液樣本用預(yù)先處理過的聚乙烯塑料瓶收集并置于80℃保存。

隨機(jī)采取實(shí)驗(yàn)室志愿者尿液50例，每例取10 mL進(jìn)行混合，形成混合尿液基質(zhì)。采用混合尿液基質(zhì)加標(biāo)樣品對方法進(jìn)行優(yōu)化。

2.3樣品處理

樣品置于室溫下解凍后，3000 r/min離心10 min后取上清液; 準(zhǔn)確量取2 mL，加入10 ng回收率指示物(D10-DPhP、D8-BCEP和D12-BCPP)，加200 μL 0.1 mol/L醋酸鈉-醋酸(NaAc-HAc)緩沖溶液(pH 4.5)調(diào)節(jié)樣品至pH 5.0，充分混勻并平衡6～8 h后，過固相萃取柱凈化。固相萃取柱依次用2 mL甲醇、2 mL含5%氨水的甲醇和3 mL 0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液(pH=4.5)進(jìn)行活化，上樣后，用2 mL 30%甲醇溶液(pH 5.0)淋洗，之后固相萃取柱用氮?dú)獯蹈?，最后? mL含5%氨水的甲醇和2 mL甲醇洗脫目標(biāo)化合物。收集的組分氮吹近干，用50%甲醇溶液溶解并定容至200 μL，進(jìn)儀器分析。

2.4儀器分析

采用Zorbax SB-C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm，美國Agilent公司)為色譜分析柱，甲醇、乙腈和10 mmol 甲酸銨-氨水緩沖溶液(pH 9.2)為流動(dòng)相，流速0.4 mL/min，柱溫32℃，梯度淋洗程序見表1。質(zhì)譜檢測采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式，電壓4500 V，離子源溫度450℃，霧化氣壓力50 psi，輔助氣壓力60 psi，窗簾氣壓力30 psi; 采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。各化合物的保留時(shí)間和定性定量離子對見表2。

表1 梯度淋洗程序

Table 1 Gradient elution program of mobile phase

時(shí)間Time(min)緩沖液Buffer(pH9．2，%)甲醇Methanol(%)乙腈Acetonitrile(%)0653505653508504551520755180955時(shí)間Time(min)緩沖液Buffer(pH9．2，%)甲醇Methanol(%)乙腈Acetonitrile(%)200955260955305050035653504265350

表2 有機(jī)磷酸酯代謝物的色譜及質(zhì)譜參數(shù)

Table 2 Instrumental parameters for seven metabolites of OPs and internal standards

化合物Compound保留時(shí)間Retentiontime(min)定量離子對Quantitativetransition(m/z)定性離子對Qualitativetransition(m/z)去簇電勢Declusteringpotential(V)碰撞能Collisionenergy(eV)Diethylphosphate，DEP5．4152．9>78．7152．9>125．0-25-25Bis(2?chloroethyl)phosphate，BCEP6．7221．1>35．0221．1>37．0-30-21Bis(2?chloropropyl)phosphate，BCPP10．2/11．2/12．5249．0>35．0249．0>37．0-23-25Diphenylphosphate，DPhP15．7249．1>93．1249．1>155．0-38-32Di?n?butylphosphate，DBP16．5209．0>78．7209．0>152．9-25-24Dibenzylphosphate，DTP17．1276．9>78．7276．9>107．0-45-33Bis(1，3?dichloro?2?propyl)phosphate，BDCPP17．3316．9>35．0319．0>35．0-25-30D8?BCEP6．7229．2>35．0229．2>37．0-30-21D12?BCPP9．7/10．8/12．1261．1>35．0261．1>37．0-25-22D10?DPhP15．5259．0>98．1259．0>160．0-38-33

3 結(jié)果與討論

3.1SPE條件優(yōu)化

固相萃取柱是決定樣品富集凈化效果的重要因素。本研究選取Oasis WAX、Oasis HLB和Bond Elut C183種小柱進(jìn)行對照。研究表明，Bond Elut C18柱對磷酸二酯的富集效果不佳，所有考察的目標(biāo)污染物回收率均小于50%，這可能與磷酸二酯的極性較大、pKa值小相關(guān)。通常情況下，磷酸二酯在尿液中以負(fù)離子形式存在[11]，因此在反相非極性C18柱上的富集效果相對較差; 而Oasis HLB對水溶性較大的DEP和BCEP的回收率分別為19.4%和32.2%，因此選擇Oasis WAX弱陰離子柱為固相萃取柱。盡管Oasis WAX有較高的DBP背景污染，但其富集效率和凈化效果相對其它小柱更好，可通過扣除背景值的方法進(jìn)行校正。此結(jié)果與van den Eede等研究結(jié)果一致，他們也發(fā)現(xiàn)Oasis WAX含有一定的DBP背景[12]。Cooper等[13]使用Strata-X-AW柱富集尿液中的磷酸二酯，回收率相對比較穩(wěn)定; van den Eede等[12]在研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Strata-X-AW小柱易引發(fā)嚴(yán)重的基質(zhì)干擾; 而Bond Elut NH3柱無法有效富集有機(jī)磷酸二酯，在SPE的上樣階段即有80%的目標(biāo)物流出損失。因此，最終確定使用Oasis WAX柱作為固相萃取柱。

圖1 尿液pH值對回收率的影響Fig.1 Effect of urine pH value on recovery

進(jìn)一步考察了pH值、淋洗溶劑和洗脫溶劑對回收率的影響。由于磷酸二酯的極性較大，且pKa值低(<3.0)[13]，正常尿液基質(zhì)中(pH=5～8)，它們均以負(fù)離子形式存在，為確保富集效果，固相萃取前需要對尿液pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)。Oasis WAX是弱陰離子交換柱，被富集的樣品溶液比較理想的pH值是比目標(biāo)物的pKa值大2個(gè)pH單位，與比柱吸附劑的pKa(Oasis WAX柱的pKa≈ 6.5)值小2個(gè)pH單位之間; 另一方面，使用緩沖溶液稀釋樣品，降低樣品的離子強(qiáng)度，上樣后目標(biāo)物與Oasis WAX柱吸附劑的弱陰離子進(jìn)行交換而被富集。鑒于此，本研究利用0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液(pH=4.5)進(jìn)行稀釋，并對尿液pH值進(jìn)行優(yōu)化。如圖1所示，當(dāng)pH=5.0時(shí)各目標(biāo)化合物均有較理想的回收率，因此最終選擇用200 μL NaAc-HAc緩沖溶液(pH=4.5)對尿液進(jìn)行稀釋。

圖2 淋洗溶劑對回收率的影響Fig.2 Effect of washing solvent on recovery

在洗脫目標(biāo)化合物之前的有效淋洗非常重要，可以有效去除雜質(zhì)，降低生物基質(zhì)的干擾。圖2顯示了不同淋洗液對磷酸二酯回收率的影響，各淋洗液均用0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液調(diào)節(jié)pH=5。當(dāng)洗脫溶劑中甲醇含量在5%～15%時(shí)，尿液樣品中的雜質(zhì)無法較好地去除，基質(zhì)干擾效應(yīng)相對較強(qiáng)，影響目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確測定。當(dāng)增加淋洗溶液中甲醇的比例增至40%時(shí)，目標(biāo)物在淋洗時(shí)流失，造成富集效果顯著下降。綜合考慮，30% MeOH(pH=5)溶液淋洗，在保證各化合物回收率的條件下，能最大限度洗脫樣品中的基質(zhì)。

弱陰離子交換柱在洗脫時(shí)，主要通過中和小柱吸附劑上的電荷對目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，因此常用高離子強(qiáng)度的緩沖液或帶有少量酸或者堿的有機(jī)溶劑洗脫，本研究使用甲醇溶液洗脫目標(biāo)物，且在甲醇中加5% NH3·H2O(pKa= 9.26)，用于中和柱內(nèi)吸附劑上的電荷，削弱目標(biāo)物與柱吸附劑的離子交換。因此使用2 mL 含5% NH3·H2O的MeOH溶液作為洗脫劑，這與文獻(xiàn)[12]中使用的洗脫溶劑一致。本研究表明，在2 mL含5% NH3·H2O的MeOH溶液洗脫之后，再增加2 mL MeOH洗脫，可有效提高DTP的回收率，這可能與DTP的親脂性較強(qiáng)有關(guān)。因此本研究采用2 mL 含5% NH3·H2O的MeOH和2 mL MeOH作為洗脫液。

3.2色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

研究表明[11,12]，在流動(dòng)相水中加入10 mmol/L甲酸銨-氨水緩沖溶液，并調(diào)節(jié)至pH=9.2，可提高有機(jī)磷酸二酯化合物的靈敏度。由于乙腈的洗脫能力較甲醇強(qiáng)，因此在梯度淋洗中加入適量的乙腈可縮短化合物在色譜柱的保留時(shí)間，利于污染物實(shí)現(xiàn)基線分離，從而避免共溢出造成化合物在離子源處的競爭離子化。

對于各磷酸二酯化合物的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，依據(jù)下面的原則：首先，在全掃描模式下(Full scan，m/z=50～500)，確定每個(gè)目標(biāo)化合物的特征離子峰; 然后，選擇質(zhì)荷比大(一般為分子離子峰)且靈敏度高的特征碎片離子作為母離子，進(jìn)行子離子掃描，確定每個(gè)目標(biāo)化合物的定性和定量離子對; 最后，通過多級反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，對各化合物定性定量離子對及碰撞能等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終優(yōu)化的結(jié)果見表2。標(biāo)準(zhǔn)溶液及尿液加標(biāo)樣品中各化合物的總離子流圖見圖3。從圖3可見，本研究所有的目標(biāo)化合物均達(dá)到基線分離。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和尿液基質(zhì)加標(biāo)樣品中OPs代謝物的總離子流圖(TIC)，其中A為標(biāo)準(zhǔn)溶液中7種OPs代謝物(實(shí)線)和3個(gè)內(nèi)標(biāo)(虛線)的TIC圖; B為A圖中6～14 min的放大圖; C為尿液基質(zhì)加標(biāo)樣品中OPs化合物的TIC圖; D為C圖中6～14 min的放大圖。Fig.3 Total ion chromatograms for metabolites of OPs. (A) All analytes in standard solution, (B) BCEP and BCPP and their corresponding internal compounds in standard solution, (C) All analytes in spiked urine sample and (D) BCEP and BCPP and their corresponding internal compounds in spiked urine sample

3.3方法評價(jià)

從回收率、重復(fù)性、線性范圍、檢出限及基質(zhì)效應(yīng)幾個(gè)方面對建立的方法進(jìn)行評價(jià)。在人體尿液混合基質(zhì)中分別添加最終濃度為10、 50和100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果見表3。除DEP外，其它化合物的回收率均在60.5%～104.0%之間，這可能由于DEP的極性和水溶性較大，在淋洗基質(zhì)時(shí)，很容易隨著基質(zhì)流出，且在色譜分離時(shí)，保留時(shí)間靠前，受非保留基質(zhì)的影響較大造成的。DEP的回收率與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的研究結(jié)果相近。文獻(xiàn)[17]使用乙腈液液萃取尿液中OPs代謝物，其中DEP的平均回收率可達(dá)114%，因此液液萃取可能是提高DEP回收率的有效方法。

表3 7種有機(jī)磷酸酯代謝物的加標(biāo)回收率、檢測限、定量限及重現(xiàn)性

Table 3 Recovery, limit of detection, limit of quantification and repeatability for seven metabolites of OPs (n=6)

化合物Compound回收率Recovery(%)加標(biāo)水平Spikinglevel10μg/L50μg/L100μg/L日內(nèi)精密度Intra?dayprecision(%)日間精密度Inter?dayprecision(%)檢出限LOD(μg/L)定量限LOQ(μg/L)DEP36．2±2．027．8±0．717．8±1．55．711．60．0300．100BCEP63．0±10．460．5±13．574．7±6．59．415．40．1000．300BCPP72．7±14．683．7±12．089．5±9．010．710．70．2000．500DPhP96．3±11．392．3±4．397．1±3．92．010．50．0050．020DBP104．0±1．799．8±8．997．6±2．71．99．50．0060．020DTP91．7±10．898．2±6．193．8±7．91．911．60．0070．020BDCPP91．7±12．283．3±3．279．7±8．34．812．70．0500．200

各化合物在0.5～100 μg/L的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.996～0.999之間; 取3倍信噪比(S/N)為檢出限，10倍S/N為定量限，各目標(biāo)物的檢出限在0.005～0.200 μg/L之間，定量限在0.020～0.500 μg/L之間。

研究還發(fā)現(xiàn)，即使在優(yōu)化后的分離富集條件以及儀器分析條件下，目標(biāo)化合物也存在顯著的基質(zhì)效應(yīng)。通過混合尿液基質(zhì)加標(biāo)與溶劑標(biāo)樣同時(shí)檢測，基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式如下：

其中， ME為基質(zhì)效應(yīng); Area0為混合基質(zhì)中目標(biāo)物檢測的響應(yīng)峰面積; Area1為混合基質(zhì)加標(biāo)后目標(biāo)物檢測的響應(yīng)峰面積; Area2為溶劑標(biāo)樣中目標(biāo)物檢測的響應(yīng)峰面積。

ME<0, 表示有基質(zhì)抑制效應(yīng); ME>0, 表示有基質(zhì)促進(jìn)效應(yīng); ME=0， 表示無基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明， 各化合物的基質(zhì)效應(yīng)在56%～26%之間，大部分化合均呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中DEP(56%)和BCEP(23%)受基質(zhì)抑制效應(yīng)干擾最大。本研究報(bào)道的基質(zhì)效應(yīng)顯著低于文獻(xiàn)[12]的報(bào)道值(40%～166%)，這可能與本研究所建立的SPE富集凈化方法和液相分離相關(guān)，高效的前處理方法以及液相分離均可有效去除基質(zhì)，使得目標(biāo)污染物得到有效分析。

本研究與文獻(xiàn)報(bào)道的其它方法比較(表4)，不需要進(jìn)行衍生化，操作簡單且具有較低的檢出限。本研究首次報(bào)道了尿液中DTP的檢測。在優(yōu)化條件下，本研究中各化合物的回收率除DEP較低外(17.8%～36.2%)，其它化合物的回收率在60.5%～104.0%之間，日間重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(RSD ≤15.4%)表明本方法穩(wěn)定可靠。

3.4實(shí)際樣品分析

將方法應(yīng)用于10例人體尿液樣品中7種OPs代謝物的分析。尿液中7種OPs代謝物的濃度如表5所示。各化合物在樣品中均有檢出，除BCPP僅在1例樣品中有檢出外，其它化合物的檢出率均大

表4 本研究方法與文獻(xiàn)已報(bào)道的方法比較

Table 4 Comparison of method parameters between this method and literature methods for OPs analysis

預(yù)處理Samplepreparationa儀器分析Instrumentalanalysis目標(biāo)物Analyte檢測限LOD(μg/L)參考文獻(xiàn)Ref．SPE(IsoluteENV+andBondElutPSA+Florisil)GC?MS/MSDBP，BCPP，BCEP，DPhP，DmCP，DpCP0．1～1[8，9]SPE(StrataX?AW)LC?MS/MSBDCPP，DPhP0．008～0．2[13]LLELC?MS/MSDEP，DiBP，DnBP，DPhP，DBEP，DEHP0．3～11[17]SPE(OasisWAX)LC?MS/MSBCEP，BCPP，BDCPP，DBP，DPhP，BBOEP1．3～25[12]DirectinjectionLC?TOFMSBCEP，BCPP，DBP，DPhP，BDCPP，BBOEP0．1～25[11]SPE(ISOLUTEaminopropyl)UPLC?MS/MSDBP，DPhP，BBOEP，DEHP，BCEP，BCPP，BDCPP0．02～0．2[10]SPE(OasisWAX)UPLC?MS/MSBDCPP，DPhP，BBOEP，BCPP，BCEP，DpCP0．08～0．25[18]SPE(OasisWAX)LC?MS/MSDEP，BCEP，BCPP，DBP，DPhP，BDCPP，DTP0．005～0．2本研究Thisworka括號內(nèi)為固相萃取柱類型。DmCP：di?m?cresylphosphate；DpCP：di?p?cresylphosphate；BBOEP：bis(2?butoxyethyl)phosphate；DEHP：di(2?ethylhexyl)phosphate

表5 10例普通人群尿樣中OPs代謝物的體積濃度值(μg/L)

Table 5 Concentrations of metabolites of OPs in 10 samples(μg/L)

SampleNo．DEPBCEPBCPPDPhPDBPDTPBDCPPTotalDAPsaS10．290．35NDb0．060．670．05ND1．41S20．413．880．910．110．810．030．516．66S30．12NDND0．062．530．06ND2．77S40．13NDND0．080．930．040．081．26S50．59NDND0．63ND0．010．071．31S60．45NDND0．03ND0．020．070．58S70．32NDND0．08ND0．020．080．50S80．100．35ND0．020．890．040．131．52S90．070．37ND0．03ND0．030．070．57S100．130．84ND0．050．190．020．201．44aTotalDAPs：7種OPs代謝物的總濃度；bND：檢測濃度低于檢出限。a．TotalDAPS：totalconcentrationof7ops．bND：lowerthanLOD．

于等于50%，7種OPs代謝物的總和濃度范圍為0.5～6.7 μg/L，其中DEP、BCEP和DBP是檢出的主要化合物。OPs的人體內(nèi)暴露研究可為OPs的健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供重要的科學(xué)數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究建立了液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測人體尿液中7種OPs代謝物的分析方法，前處理采用固相萃取富集凈化，2 mL尿液加200 μL 0.1 mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖溶液稀釋，稀釋后的樣品通過固相萃取柱富集，目標(biāo)物用2 mL含5%氨水的甲醇和2 mL甲醇洗脫。本方法具有較高的回收率和重現(xiàn)性，可用于大樣本量尿液中的OPs代謝物的檢測。本研究使用柱容量較大的分析柱對目標(biāo)物進(jìn)行色譜分離，減少了基質(zhì)干擾，提高了鹵代OPs代謝物的檢測靈敏度。但是相比較非鹵代OPs代謝物，鹵代OPs代謝物的檢測靈敏度偏低，未來需要尋求提高鹵代OPs代謝物檢測靈敏度的簡便方法。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 41225013).

DeterminationofSevenUrinaryMetabolitesofOrganophosphateEstersUsingLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry

LI Pei1,2, ZENG Xiang-Ying1, CUI Jun-Tao1,2, ZHAO Ling-Juan1, YU Zhi-Qiang*1
1(StateKeyLaboratoryofOrganicGeochemistry,GuangdongKeyLaboratoryofEnvironmentandResources,GuangzhouInstituteofGeochemistry,ChineseAcademyofSciences,Guangzhou510640,China)2(UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

A simple method was developed for simultaneous determination of seven urinary metabolites of organophosphate esters by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Based on different physical and chemical properties of these OPs metabolites, the solid phase extraction cartridges and the washing and eluting solvents were optimized in details. Furthermore, the mobile phase and mass spectrometric parameters were also investigated. The results showed that Oasis WAX cartridge was the best SPE column in this study, and 2 mL of NH3·H2O (5%) in methanol and 2 mL of methanol were chosen as the eluting solvents. The recoveries of six analytes were ranged from 60.5% to 104.0%, whereas DEP ranged from 17.8% to 36.2%. Seven analytes could be baseline separated from each other under the optimized chromatographic conditions. The limits of detection and quantification of seven analytes ranged from 0.005 to 0.2 μg/L and 0.02 to 0.5 μg/L, respectively. The standard deviations of response repeatability for intra-day and inter-day period were lower than 15.4%. This method was finally applied to determination of metabolites of OPs from 10 urines from general population in Guangzhou city. The concentrations of total OPs metabolites in urine samples ranged from 0.5 to 6.7 μg/L.

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Organophosphate esters; Urine; Metabolites

21 June 2017; accepted 19 July 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.171027