尖銳濕疣皮損中Caspase 8與p-Akt的表達(dá)

陳敏聰 王建琴 方銳華 賈淑青 莫友 莫金雪

510642廣州，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院皮膚科（陳敏聰）；廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所 廣州市皮膚病防治所（王建琴）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院皮膚科（方銳華、莫友）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院皮膚科（賈淑青、莫金雪）

尖銳濕疣皮損中Caspase 8與p-Akt的表達(dá)

陳敏聰 王建琴 方銳華 賈淑青 莫友 莫金雪

510642廣州，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院皮膚科（陳敏聰）；廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所 廣州市皮膚病防治所（王建琴）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院皮膚科（方銳華、莫友）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院皮膚科（賈淑青、莫金雪）

目的探討Caspase 8與p-Akt在尖銳濕疣皮損中的表達(dá)及意義。方法 收集尖銳濕疣30例、宮頸癌20例、正常皮膚（包皮）20例，采用免疫組化檢測以上組織中Caspase 8及p-Akt的表達(dá)及分布。結(jié)果Caspase 8在尖銳濕疣皮損、宮頸癌、正常皮膚中陽性率分別為23.33%、80%、90%。Caspase 8在尖銳濕疣中的表達(dá)強(qiáng)度顯著低于正常皮膚（P＜0.01）和宮頸癌組織（P＜0.001）。p-Akt在尖銳濕疣皮損、宮頸癌組織、正常皮膚組織中的陽性率分別為93.33%、95%、90%。p-Akt在尖銳濕疣皮損的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常皮膚組織（P＜0.001），低于宮頸癌組織（P＜0.001）。在尖銳濕疣皮損和正常皮膚組織中，Caspase 8與p-Akt的表達(dá)無相關(guān)性。在宮頸癌中，Caspase 8與p-Akt的表達(dá)存在顯著的正相關(guān)（r=0.369，P＜0.05）。結(jié)論Caspase 8的凋亡啟動受抑制及p-Akt的抗凋亡作用可能參與了尖銳濕疣的發(fā)生發(fā)展。

尖銳濕疣；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8；細(xì)胞凋亡；p-Akt

尖銳濕疣（CA）是人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起的性傳播疾病，存在易復(fù)發(fā)、難治愈的特點(diǎn)。目前認(rèn)為，CA的發(fā)病及復(fù)發(fā)主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的對HPV感染細(xì)胞的免疫抑制為主，但確切機(jī)制尚未明確。宮頸癌是女性常見生殖道腫瘤，其發(fā)病與高危型HPV（HPV16、18）的感染密切相關(guān)。研究證實(shí)，HPV感染能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［1］。當(dāng)細(xì)胞凋亡受到抑制的時(shí)候，細(xì)胞就會因凋亡異常而異常增殖，甚至向惡性發(fā)展。Caspase家族作為凋亡的主要執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡的核心。PI3K/Akt通路與細(xì)胞凋亡、增殖、代謝等密切相關(guān)。p-Akt即磷酸化的Akt，是Akt的活性形式。我們用免疫組化EnVision法檢測Caspase 8與p-Akt在CA及宮頸癌的表達(dá)，旨在探討CA和宮頸癌的發(fā)病中是否存在凋亡機(jī)制異常。

一、對象與方法

1.對象：CA組30例，男17例，女13例，年齡18～76歲（28.6±6.5）歲，病程2周至4個(gè)月（1.3±0.8）個(gè)月，標(biāo)本分別取自肛周、陰囊、尿道口、大小陰唇、宮頸等患CA部位。30例CA患者均在組織病理學(xué)上有典型的空泡細(xì)胞及免疫組化檢查HPV陽性。宮頸癌組20例，年齡19～67歲（34.5±7.0）歲，病程3周至16個(gè)月（5.3±3.3）個(gè)月。20例宮頸癌患者均符合宮頸癌的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，病理分期上，ⅠB期2例，ⅡA期4例，ⅡB期3例，ⅢA期7例，ⅢB期4例。CA組和宮頸癌組患者取材前1個(gè)月內(nèi)均未使用過影響機(jī)體免疫功能的藥物，且不伴有自身免疫性疾病，梅毒及艾滋病血清學(xué)檢查陰性。對照組20例的皮膚取自正常包皮環(huán)切術(shù)，年齡18～35歲（20.3±4.5）歲，均無罹患惡性腫瘤亦無接受過任何免疫治療。本研究經(jīng)廣州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

2.試劑：兔抗人Cleaved Caspase 8單克隆抗體、兔抗人Phospho-Akt單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；免疫組化檢測試劑盒為GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型試劑盒，購于丹麥Dako公司。

3.方法：免疫組化EnVision法：步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。取CA皮損及宮頸癌病灶，固定、脫水、石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片。常規(guī)二甲苯脫蠟，抗原120℃修復(fù)3 min，自然冷卻后，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗（Caspase 8稀釋至1∶200，p-Akt稀釋至1∶100）4℃孵育過夜，再滴加二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，無水乙醇脫水，封片。用結(jié)腸癌組織作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

判定標(biāo)準(zhǔn)：Caspase 8及p-Akt均以胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。以胞質(zhì)或胞膜著棕黃色為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)；將染色深度（I）分為4級：無染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；在高倍鏡下（×400）隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞占同類細(xì)胞的比例（P）：陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＜10%計(jì)0分，11%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。分別計(jì)算CA、正常皮膚組織及宮頸癌細(xì)胞的組織學(xué)評分（H）：H=I×P。0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20．0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CA皮損、宮頸癌組織和正常皮膚組織間Caspase 8及p-Akt分別進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，單因素方差分析比較Caspase 8及p-Akt在各組間的差異性，方差不齊則用秩和檢驗(yàn)。Caspase 8及p-Akt在CA皮損、宮頸癌及正常皮膚組織中表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。

二、結(jié)果

1.Caspase 8及p-Akt在CA皮損、宮頸癌組織及正常皮膚中的表達(dá)：Caspase 8及p-Akt在CA皮損和宮頸癌組織中均有不同程度的陽性表達(dá)（表1）。Caspase 8在CA皮損中陽性細(xì)胞局限于基底層、棘層細(xì)胞，胞質(zhì)著色多為棕黃色至淡黃色，全部為弱陽性表達(dá)（圖1），陽性率為23.33%；宮頸癌組織中，Caspase 8陽性細(xì)胞呈散在或局灶陽性分布，癌組織胞質(zhì)著色較深，多為棕褐色（圖2），陽性率為80%；在正常皮膚組織中，Caspase8陽性細(xì)胞集中在基底層，個(gè)別在棘層也有表達(dá)，著色多為棕黃色，陽性率為90%。Caspase 8在CA皮損中的表達(dá)水平顯著低于正常皮膚組織（P＜0.01）和宮頸癌組織（P＜0.001），而宮頸癌組織表達(dá)Caspase 8的水平則顯著高于正常皮膚（P＜0.05）。

p-Akt在CA皮損中陽性細(xì)胞分布于基底層、棘層細(xì)胞及顆粒層下部，胞質(zhì)被染成棕紅色，多數(shù)為中度至強(qiáng)陽性表達(dá)（圖3），陽性率為93.33%；在宮頸癌組織中，陽性細(xì)胞呈彌漫性強(qiáng)陽性表達(dá)（圖4），胞質(zhì)染成棕紅色，陽性率為95%；正常皮膚組織表達(dá)p-Akt陽性細(xì)胞主要分布于基底層，少數(shù)棘層細(xì)胞也有表達(dá)，著色多為棕黃色，陽性率為90%。p-Akt在CA皮損中的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚（P＜0.001），低于宮頸癌（P＜0.001），宮頸癌組織表達(dá)Caspase 8的水平則顯著高于正常皮膚（P＜0.001）。

2.Caspase 8和p-Akt在CA皮損及宮頸癌組織中表達(dá)的差異性分析：Caspase 8和p-Akt在宮頸癌組織中的表達(dá)均顯著高于CA皮損（P＜0.01）。

3.Caspase 8和p-Akt在CA皮損及宮頸癌組織中表達(dá)的Spearman等級分析：CA皮損和正常皮膚組織中，Caspase 8與p-Akt的表達(dá)無相關(guān)性。在宮頸癌中，Caspase 8與p-Akt存在顯著的正相關(guān)（r=0.369，P＜0.05）。

三、討論

研究發(fā)現(xiàn)，Caspase 8的編碼基因CASP8由于其甲基化、基因突變等原因造成Caspase 8表達(dá)缺失，與肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤密切相關(guān)。很多發(fā)展中的腫瘤會表達(dá)致癌活性，比如表達(dá)超生理量的Caspase抑制劑［2］。c-FLIC，Caspase 8的抑制劑，已被證實(shí)在CA中無論RNA水平還是蛋白水平都存在異常高表達(dá)［3］。本研究結(jié)果顯示，CA組Caspase 8的表達(dá)水平顯著低于正常皮膚組（P＜0.01），提示CA的發(fā)病與作為凋亡啟動者的Caspase 8密切相關(guān)，CA的發(fā)生、發(fā)展可能與Caspase 8缺失引起的凋亡啟動障礙有關(guān)。推測，可能是角質(zhì)形成細(xì)胞被HPV感染后導(dǎo)致其表達(dá)Caspase 8減少，引起細(xì)胞凋亡減少以及過度增殖。Caspase 3是凋亡的重要執(zhí)行者之一，證實(shí)在CA中的表達(dá)也是受抑制的［4］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。

表1 尖銳濕疣組、宮頸癌組、正常皮膚組織組Caspase 8及p-Akt的表達(dá)情況（例數(shù)）

圖1 Caspase 8在尖銳濕疣皮損中大部分呈陰性，少數(shù)呈弱陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞分布于基底層及棘細(xì)胞層，胞質(zhì)染棕色（EnVision×400）

圖2 Caspase 8在宮頸癌組織中呈散在和局灶陽性，癌組織細(xì)胞質(zhì)染棕褐色（EnVision×400）

圖3 p-Akt在尖銳濕疣皮損中呈中度至強(qiáng)陽性表達(dá)，基底層、棘層細(xì)胞胞質(zhì)染棕紅色（EnVision×400）

圖4 p-Akt在正常皮膚組織呈弱陽性表達(dá)，基底層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染粽紅色（EnVision×400）

Caspase 8在很多上皮來源的腫瘤組織中表達(dá)并不常是缺失［5］。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組Caspase 8的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚組（P＜0.05）和CA組（P＜0.001），提示Caspase 8可能參與促宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，而是否參與腫瘤的轉(zhuǎn)移尚待研究。目前已明確，宮頸癌與HPV-16、18、31、33等高危型HPV感染密切相關(guān)［6］。而這些高危型HPV產(chǎn)生致癌作用的原因可以歸結(jié)于它們能產(chǎn)生E6、E7，這兩種癌基因蛋白可以阻止效應(yīng)細(xì)胞與FADD及Caspase 8介導(dǎo)的凋亡［7］。僅有一少部分女性感染了HPV會發(fā)展為宮頸癌，宿主的遺傳特質(zhì)可能在其中起了重要作用。

Akt是PI3K信號通路下游的一個(gè)重要靶點(diǎn)。PI3K/Akt通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、生長及代謝等過程起著重要作用［8］。p-Akt的生物學(xué)作用大致可以歸納為抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖和細(xì)胞生長。本研究結(jié)果顯示，CA組p-Akt的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚組（P＜0.001），與蔓小紅等［9］研究結(jié)果一致，提示p-Akt參與CA的發(fā)生發(fā)展，可能不是單一的機(jī)制。另外，p-Akt還可進(jìn)一步上調(diào)細(xì)胞周期蛋白因子的表達(dá)，通過加快細(xì)胞周期來參與CA的發(fā)病。本研究結(jié)果還顯示，p-Akt在宮頸癌組的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚組和CA組，提示p-Akt參與促成宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明，在CA皮損和正常皮膚組織中，Caspase 8與p-Akt的表達(dá)無相關(guān)性。而在宮頸癌中，Caspase 8與p-Akt的表達(dá)存在顯著的正相關(guān)，提示在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中，Caspase 8與p-Akt的表達(dá)模式可能存在一定的聯(lián)系。

聲明本文于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院皮膚科讀研期間完成

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Expression of Caspase 8 and phospho-Akt in condyloma acuminatum lesions

Chen Mincong,Wang Jianqin,Fang Ruihua,Jia Shuqing,Mo You,Mo Jinxue

Department of Dermatology,Hospital of South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China（Chen MC）;Institute of Dermatology,Guangzhou Medical University,Guangzhou Institute of Dermatology,Guangzhou 510095,China（Wang JQ）;Department of Dermatology,Guangzhou First People′s Hospital,Affiliated to Guangzhou Medical University,Guangzhou 510180,China（Fang RH,Mo Y）;Department of Dermatology,Guangzhou Nansha Central Hospital,Guangzhou First People's Hospital,Affiliated to Guangzhou Medical University,Guangzhou 511457,China（Jia SQ,Mo JX）

Wang Jianqin,Email:jianqinwang@foxmail.com

ObjectiveTo determine the expression of Caspase 8 and phospho-Akt（p-Akt）in condyloma acuminatum（CA）lesions,and to evaluate their significance.MethodsSkin lesion samples were collected from 30 patients with CA,cancer tissue samples from 20 with cervical cancer,and normal skin samples from 20 healthy controls.All the samples were subjected to paraffin embedding.An immunohistochemical study was conducted to determine the expression and distribution of Caspase 8 and p-Akt in the above samples.ResultsThe expression rate of Caspase 8 was significantly lower in CA lesions（23.33%）than in normal skin samples（90%,P＜ 0.01）and cervical cancer lesions（80%,P＜ 0.001）.Moreover,the expression rate of p-Akt in CA lesions（93.33%）was significantly higher than that in the normal skin samples（90%,P＜ 0.001）,but lower than that in the cervical cancer lesions（95%,P＜ 0.001）.No significant correlations were observed between the expression of Caspase 8 and p-Akt in either CA lesions or normal skin samples.However,the expression of Caspase 8 was positively correlated with the expression of p-Akt in cervical cancer lesions（r=0.369,P＜ 0.05）.ConclusionBoth suppressed apoptosis initiation of Caspase 8 and anti-apoptotic effect of p-Akt may be involved in the occurrence and development of CA.

Condylomata acuminata;Caspase 8;Apoptosis;p-Akt

王建琴，Email：jianqinwang@foxmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.013

2016-12-21）

（本文編輯：吳曉初）