沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡

楊曉玉 鄒燕 龔思露 卜繼常 周洲 劉良專 李忠玉

421001湖南衡陽，南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室 特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡

楊曉玉 鄒燕 龔思露 卜繼常 周洲 劉良專 李忠玉

421001湖南衡陽，南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室 特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的探討沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白pORF5對腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的影響。方法將含pORF5基因的慢病毒重組表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備慢病毒，慢病毒收集濃縮后再感染HeLa細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選獲得pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株（pORF5-HeLa），同時(shí)建立空載體轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞株（對照HeLa）。將兩種細(xì)胞株分別分為兩組，一組用20 μg/L TNF-α處理（處理組），一組僅用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)（未處理組），作用6 h，Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)PCR檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平，Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果TNF-α處理細(xì)胞6 h后，Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞中均可見不同程度的核固縮、碎裂，高亮藍(lán)色凋亡小體；pORF5-HeLa細(xì)胞的凋亡率為（35.5±4.5）%，對照HeLa細(xì)胞凋亡率為（63.6±5.8）%，均顯著高于相應(yīng)未處理組［（9.5±1.5）%和（7.9±0.9）%，t值分別為13.53、32.36，均P＜0.01］。處理組pORF5-HeLa細(xì)胞中Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)水平較處理組對照HeLa細(xì)胞分別降低72.8%和84.5%（t值分別為35.29，42.25，均P＜0.01），但Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平顯著高于處理組對照HeLa細(xì)胞（t=87.12，P＜0.01）。處理組pORF5-HeLa細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平亦顯著低于處理組對照HeLa細(xì)胞（t=17.58，P＜0.01），而Bcl-2蛋白表達(dá)水平較對照HeLa細(xì)胞增加6.8倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.93，P＜0.01）。結(jié)論pORF5可能通過增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2降低促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表達(dá)，抑制TNF-α誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡。

沙眼衣原體；細(xì)胞凋亡；腫瘤壞死因子α；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白；pORF5質(zhì)粒蛋白

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是性傳播疾病的主要病原體之一。Ct感染病程隱匿，往往不易被發(fā)覺而延誤治療。Ct嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，為從宿主細(xì)胞中獲得營養(yǎng)物質(zhì)并順利完成其在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育周期。已有研究報(bào)道，衣原體感染可通過絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（MAPK/ERK）途徑誘導(dǎo)高遷移率族蛋白1釋放進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，也可通過阻止線粒體細(xì)胞色素C釋放和抑制半胱天冬酶Caspase的活性而抑制細(xì)胞凋亡［1-4］。pORF5是由Ct質(zhì)?；蚓幋a并主要定位于感染宿主細(xì)胞胞質(zhì)的一種分泌性效應(yīng)蛋白［5］，既往研究證實(shí)pORF5質(zhì)粒蛋白與Ct致病密切相關(guān)［6-11］。為研究pORF5質(zhì)粒蛋白是否具有抗凋亡作用，本研究將構(gòu)建成功的慢病毒表達(dá)載體和空載體分別與輔助質(zhì)粒共同包裝重組慢病毒，建立pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和對照細(xì)胞株，測定腫瘤壞死因子α（TNF-α）作用后凋亡相關(guān)蛋白/基因的表達(dá)水平，分析pORF5質(zhì)粒蛋白對HeLa細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步闡明Ct的致病機(jī)制提供依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑和細(xì)胞

慢病毒載體系統(tǒng)（pMDlg-pRRE、pRsv-REV、pMD2G，PLenO-DCE）為上海英為信生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；膜聯(lián)蛋白Ⅴ-APC/7-AAD（AnnexinⅤ-APC/7-AAD）雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為美國eBioscience公司產(chǎn)品；RPMI1640為美國HyClone公司產(chǎn)品；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol總RNA抽提試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；HeLa細(xì)胞、293T細(xì)胞株來自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

二、慢病毒的包裝與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建

將已構(gòu)建成功含pORF5基因的重組慢病毒表達(dá)載體PLenO-DCE/pORF5和空載體PLenO-DCE分別與pMDlg-pRRE、pRsv-REV、pMD2G輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h，收集病毒上清并進(jìn)行濃縮與純化，采用倍比稀釋法檢測病毒滴度。將純化后的慢病毒感染HeLa細(xì)胞48 h，流式分選技術(shù)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，分別命名為pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa細(xì)胞，采用Western印跡對pORF5蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定。

三、細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別分成兩組，第1組為處理組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為20 μg/L的凋亡誘導(dǎo)劑TNF-α培養(yǎng)6 h；第2組為未處理組，直接更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

四、細(xì)胞凋亡檢測

pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa經(jīng)上述方法處理后，分別用4%的甲醛固定10 min，PBS洗滌后再加入Hoechst 33258（終濃度為10 mg/L）染色30 min，最后用PBS洗滌、封片，干燥，熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)收集處理后的pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa細(xì)胞，預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌后，1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/ml，然后將細(xì)胞分成4組，第1組為空白對照組，細(xì)胞不加任何試劑染料；第2組細(xì)胞加入Annexin V-APC；第3組細(xì)胞加入7-AAD，第2組和第3組作為單染對照組；第4組細(xì)胞同時(shí)加入Annexin V-APC和7-AAD。輕輕混勻并避光孵育15 min，2 h內(nèi)流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

五、實(shí)時(shí)PCR檢測Caspase3、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)

收集經(jīng)TNF-α處理的pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa細(xì)胞，參照Trizol總RNA抽提試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA作為模板，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，應(yīng)用SYBR Green I熒光染料嵌合法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，測定凋亡相關(guān)蛋白Caspase3和Bax mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)源性對照，引物序列見表1。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min，進(jìn)入94℃變性20 s，65℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)后，分別測定各種目的基因和內(nèi)參基因GAPDH的PCR產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到一定閾值所需要的循環(huán)數(shù)（Ct值），采用2-△△Ct方法計(jì)算Caspase3、Bcl-2和Bax基因的相對表達(dá)量。

六、Western印跡鑒定Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

收集經(jīng)TNF-α處理的pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞，PBS洗滌后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，離心取上清進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到二氟化樹脂（PVDF）膜上，PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，加入兔抗Bax和兔抗Bcl-2抗體，4℃冰箱孵育過夜，0.05%TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG，最后加入ECL顯色，膠片曝光顯影定影。Image Quant軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，計(jì)算蛋白質(zhì)表達(dá)的相對強(qiáng)度。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、慢病毒包裝及pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株的建立

將慢病毒重組表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞48 h后，由于慢病毒載體攜帶GFP報(bào)告基因，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖1）。以不同稀釋度的慢病毒感染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見隨著病毒濃度的降低，綠色熒光細(xì)胞數(shù)逐漸減少（圖1A～1D）。根據(jù)公式計(jì)算出慢病毒滴度為1.5×109TU/ml。慢病毒感染HeLa細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，流式細(xì)胞儀多次篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，純度達(dá)到95%以上（圖1E）。

表1 基因?qū)崟r(shí)PCR引物序列

二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞中pORF5質(zhì)粒蛋白表達(dá)的鑒定

Western印跡分析發(fā)現(xiàn)，pORF5-HeLa細(xì)胞在相對分子質(zhì)量28 000處出現(xiàn)一條特異性條帶，對照HeLa細(xì)胞無條帶出現(xiàn)（圖2）。

三、pORF5對TNF-α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后，Hoechst染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的核固縮、碎裂，高亮藍(lán)色凋亡小體（圖3）。流式細(xì)胞儀檢測顯示，處理組pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞凋亡率分別為（35.5±4.5）%和（63.6±5.8）%，顯著高于相應(yīng)未處理組［（9.5±1.5）%和（7.9±0.9）%，t值分別為13.53、32.36，均P＜ 0.01］，但TNF-α處理后pORF5-HeLa細(xì)胞凋亡率較對照HeLa細(xì)胞凋亡率降低28.1%（t=7.05，P＜0.01）。見表2。

四、TNF-α處理后Hela細(xì)胞Bax、Caspase3和Bcl-2 mRNA表達(dá)

由表2可以看出，TNF-α處理后兩種細(xì)胞Bax和Caspase3 mRNA水平均顯著高于相應(yīng)未處理組（均P＜0.01）；處理組pORF5-HeLa細(xì)胞中Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)水平較處理組對照HeLa細(xì)胞分別降低72.8%和84.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為35.29、42.25，均P＜0.01），但 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著高于處理組對照HeLa細(xì)胞（t=87.12，P＜ 0.01）。

圖1 慢病毒包裝及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞株的構(gòu)建 采用倍比稀釋法稀釋慢病毒，然后以不同稀釋度的慢病毒感染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察病毒感染情況。1A～1D：分別為慢病毒1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀釋；1E：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞株

圖2 Western印跡鑒定pORF5蛋白的表達(dá) 1：對照HeLa細(xì)胞；2：pORF5-HeLa細(xì)胞

圖3 Hoechst染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài) pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理6h，Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡情況，可見兩組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的核固縮、碎裂和高亮藍(lán)色凋亡小體等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象（箭頭）

五、Hela細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

TNF-α處理后pORF5-HeLa細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平（1.12±0.15）顯著低于對照HeLa細(xì)胞組（7.95± 0.62）（t=17.58，P＜ 0.01），而Bcl-2蛋白表達(dá)水平（7.88±0.99）較對照HeLa細(xì)胞組（1.01±0.23）增加6.8倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.93，P＜0.01）。見圖4。

討 論

pORF5體外能誘導(dǎo)白介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α等多種炎癥因子產(chǎn)生，體內(nèi)能誘導(dǎo)小鼠生殖道免疫病理損傷［7-10］，是Ct重要的毒力蛋白。為探討pORF5質(zhì)粒蛋白對細(xì)胞凋亡的影響，我們用慢病毒系統(tǒng)建立高表達(dá)pORF5蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株。由于慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)，為在細(xì)胞中快速而高效地研究pORF5基因功能或pORF5基因表達(dá)產(chǎn)物功能提供了有利條件。

細(xì)胞凋亡是宿主抗病原體感染的重要防御機(jī)制。除了在正常的生長發(fā)育和維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起重要作用外，細(xì)胞凋亡可激活炎癥反應(yīng)，限制病原體傳播。Ct為一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，為順利完成其在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育周期，Ct通過多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡［1-4］。為研究pORF5質(zhì)粒蛋白是否具有抗凋亡作用，本研究用凋亡誘導(dǎo)劑TNF-α刺激pORF5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa和對照HeLa細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α能誘導(dǎo)pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞凋亡，但pORF5-HeLa細(xì)胞凋亡率顯著低于對照HeLa細(xì)胞，說明pORF5能抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Bcl-2是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子［12］，主要通過改變線粒體膜對一些離子、小分子或蛋白質(zhì)的通透性而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Bax為促凋亡蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激后，Bax可誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase3，而Caspase3是天冬氨酸特異性半胱氨酸酶家族關(guān)鍵的下游成員，Caspase3激活后可引起細(xì)胞凋亡?？沟蛲龅鞍缀痛俚蛲龅鞍椎谋嚷蕸Q定了細(xì)胞對凋亡信號(hào)的敏感性［13］。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α處理細(xì)胞后，pORF5-HeLa細(xì)胞中促凋亡因子Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)水平較對照HeLa細(xì)胞顯著減少，Bax蛋白表達(dá)水平也顯著低于對照組，而抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著增加，說明pORF5質(zhì)粒蛋白能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，通過上調(diào)抗凋亡蛋白和下調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抗細(xì)胞凋亡作用。

我們利用慢病毒載體系統(tǒng)，建立了pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞系和對照HeLa細(xì)胞系，穩(wěn)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后，發(fā)現(xiàn)pORF5可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)升高，同時(shí)降低Bax和Caspase3的mRNA表達(dá)水平，初步證實(shí)Ct質(zhì)粒蛋白pORF5可抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由于細(xì)胞凋亡是多蛋白嚴(yán)格控制的過程，pORF5質(zhì)粒蛋白如何抑制細(xì)胞凋亡，凋亡抑制后又如何參與Ct感染性疾病的的發(fā)生和發(fā)展尚待進(jìn)一步研究。

表2 兩組HeLa細(xì)胞凋亡率以及Bax、Caspase3和Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 兩組HeLa細(xì)胞凋亡率以及Bax、Caspase3和Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：n=3。t1、P1：pORF5-HeLa細(xì)胞與對照HeLa細(xì)胞之間比較；t2、P2：同一種細(xì)胞TNF-α 處理組與未處理組比較。a：pORF5-HeLa細(xì)胞比較結(jié)果；b：對照HeLa細(xì)胞比較結(jié)果。TNF-α：腫瘤壞死因子α

組別pORF5-HeLa細(xì)胞對照HeLa細(xì)胞t1 P1 t2 P2凋亡率（%）TNF-α 處理35.5±4.5 63.6±5.8 12.85＜0.01 13.53a＜0.01a未處理9.5±1.5 7.9±0.9 1.99＞0.05 32.36b＜0.01b Bax mRNA TNF-α 處理1.58±0.25 5.81±0.48 35.29＜0.01 51.13a＜0.01a未處理0.45±0.09 0.49±0.10 2.43＞0.05 87.25b＜0.01b Caspase3 mRNA TNF-α 處理1.27±0.14 8.21±1.80 42.25＜0.01 10.05a＜0.01a未處理0.61±0.12 0.73±0.15 1.58＞0.05 68.34b＜0.01b Bcl-2 mRNA TNF-α處理7.04±0.12 0.95±0.10 87.12＜0.01 75.24a＜0.01a未處理1.21±0.51 0.92±0.91 22.65＞0.05 1.68b＞0.05b

圖4 Western印跡分析Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 1：pORF5-HeLa細(xì)胞；2：對照HeLa細(xì)胞

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［12］Scarfò L,Ghia P.Reprogramming cell death:BCL2 family inhibition in hematological malignancies［J］.Immunol Lett,2013,155（1-2）:36-39.DOI:10.1016/j.imlet.2013.09.015.

［13］Ghiotto F,Fais F,Bruno S.BH3-only proteins:the deathpuppeteer′s wires［J］.Cytometry A,2010,77（1）:11-21.DOI:10.1002/cyto.a.20819.

《中國皮膚性病學(xué)書目提要及著者傳略》征文及研修班招生

為了系統(tǒng)總結(jié)我國皮膚性病學(xué)文獻(xiàn)及介紹做出重要貢獻(xiàn)的著者，廖萬清院士、禤國維國醫(yī)大師領(lǐng)銜編輯《中國皮膚性病學(xué)書目提要及著者傳略》。凡為該書提供書目及著者傳略者、向籌建的中國皮膚科博物館贈(zèng)送文物者，可獲贈(zèng)《中國皮膚科學(xué)史》（600元）1冊。

為推廣我國政策規(guī)定的外用中藥臨方調(diào)劑、中醫(yī)中藥療法，2017年繼續(xù)舉辦全國皮膚美容化妝品制劑研修班，馬振友、李斌傳授實(shí)用處方，示教實(shí)習(xí)，學(xué)會(huì)為止。劉巧、劉紅霞等名中醫(yī)傳授示教火療、火針、臍療、薰蒸、煙薰、熨烙、鮮藥、刺絡(luò)拔罐、太乙神針等實(shí)用療法，學(xué)員互教互學(xué)。報(bào)名注冊者獲贈(zèng)《皮膚美容化妝品制劑手冊》和《皮膚病中醫(yī)方劑制劑手冊》各1冊。贈(zèng)送臨方調(diào)配乳膏基質(zhì)及蒼龍嶺牌等皮膚外用產(chǎn)品試用。對索取征文及招生信息和獲取試用藥品者，來函必復(fù)、必贈(zèng)。

陜西馬振友藥業(yè)有限公司，手機(jī)/微信：13227015533，13379033002；QQ：386966727。

Inhibitory effect of Chlamydia trachomatis plasmid-encoded protein pORF5 on HeLa cell apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha

Yang Xiaoyu,Zou Yan,Gong Silu,Bu Jichang,Zhou Zhou,Liu Liangzhuan,Li Zhongyu
Institute of Pathogenic Biology,Medical College,University of South China,Hunan Provincial Key Laboratory for Special Pathogens Prevention and Control,Hengyang,421001,China

Li Zhongyu,Email:lzhy1023@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate inhibitory effect ofChlamydia trachomatisplasmid-encoded protein pORF5 on HeLa cell apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）.MethodsThe recombinant lentiviral expression vector containing pORF5 gene and helper plasmids were co-transfected into 293T cells to prepare the recombinant lentivirus.Then,the lentivirus particles were collected and concentrated,and used to infect HeLa cells.Flow cytometric screening identified stable pORF5-expressing HeLa（pORF5-HeLa）cells.Meanwhile,the empty plasmid was transfected into HeLa cells to prepare control HeLa cells.The two cell lines were both divided into two subgroups to be treated with 20 μg/L TNF-α and fresh culture medium respectively for 6 hours.Then,Hoechst 33258 staining was performed to observe morphological changes of apoptotic cells,flow cytometry to detect cell apoptosis,real-time PCR to measure the mRNA expression of Caspase3,Bax and Bcl-2,and Western blot analysis to determine the protein expression of Bax and Bcl-2.ResultsAfter 6-hour treatment with TNF-α,Hoechst 33258 staining showed variable degrees of karyopyknosis and karyorrhexis,and highly-refractive blue apoptotic bodies in the pORF5-HeLa cells and control HeLa cells.The pORF5-HeLa cells and control HeLa cells both showed significantly higher apoptosis rate in the treated subgroup than in the untreated subgroup（pORF5-HeLa cells:35.5%±4.5%vs.9.5%±1.5%,t=13.53,P＜0.01;control HeLa cells:63.6%±5.8%vs.7.9%±0.9%,t=32.36,P＜ 0.01）.Compared with treated control HeLa cells,treated pORF5-HeLa cells showed significant decreases in mRNA expression of Bax（72.8%）and Caspase 3（84.5%）（t=35.29,42.25,respectively,bothP＜ 0.01）,as well as in Bax protein expression（t=17.58，P＜ 0.01）,but significant increases in Bcl-2 mRNA and protein（6.8 times）expression（t=87.12,18.93,respectively,bothP＜0.01）.ConclusionpORF5 plasmid protein can inhibit TNF-α-induced HeLa cell apoptosis likely by increasing the expression of anti-apoptotic protein bcl-2 and decreasing the expression of pro-apoptotic proteins Caspase-3 and Bax.

Chlamydia trachomatis;Apoptosis;Tumor necrosis factor-alpha;Caspase3;bcl-2-Associated X Protein;B-cell lymphoma/Leukemia-2;pORF5 plasmid protein

李忠玉，Email：lzhy1023@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.007

國家自然科學(xué)基金（31470277、81102230、31300156）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（31470277,81102230,31300156）

2016-11-25）

（本文編輯：尚淑賢）