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    沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡

    2017-11-01 21:33:56楊曉玉鄒燕龔思露卜繼常周洲劉良專李忠玉
    中華皮膚科雜志 2017年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株質(zhì)粒誘導(dǎo)

    楊曉玉 鄒燕 龔思露 卜繼常 周洲 劉良專 李忠玉

    421001湖南衡陽,南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室 特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

    沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡

    楊曉玉 鄒燕 龔思露 卜繼常 周洲 劉良專 李忠玉

    421001湖南衡陽,南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室 特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

    目的探討沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白pORF5對腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的影響。方法將含pORF5基因的慢病毒重組表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備慢病毒,慢病毒收集濃縮后再感染HeLa細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分選獲得pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(pORF5-HeLa),同時(shí)建立空載體轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞株(對照HeLa)。將兩種細(xì)胞株分別分為兩組,一組用20 μg/L TNF-α處理(處理組),一組僅用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)(未處理組),作用6 h,Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,實(shí)時(shí)PCR檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平,Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果TNF-α處理細(xì)胞6 h后,Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞中均可見不同程度的核固縮、碎裂,高亮藍(lán)色凋亡小體;pORF5-HeLa細(xì)胞的凋亡率為(35.5±4.5)%,對照HeLa細(xì)胞凋亡率為(63.6±5.8)%,均顯著高于相應(yīng)未處理組[(9.5±1.5)%和(7.9±0.9)%,t值分別為13.53、32.36,均P<0.01]。處理組pORF5-HeLa細(xì)胞中Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)水平較處理組對照HeLa細(xì)胞分別降低72.8%和84.5%(t值分別為35.29,42.25,均P<0.01),但Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平顯著高于處理組對照HeLa細(xì)胞(t=87.12,P<0.01)。處理組pORF5-HeLa細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平亦顯著低于處理組對照HeLa細(xì)胞(t=17.58,P<0.01),而Bcl-2蛋白表達(dá)水平較對照HeLa細(xì)胞增加6.8倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.93,P<0.01)。結(jié)論pORF5可能通過增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2降低促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表達(dá),抑制TNF-α誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡。

    沙眼衣原體;細(xì)胞凋亡;腫瘤壞死因子α;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3;bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì);B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白;pORF5質(zhì)粒蛋白

    沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是性傳播疾病的主要病原體之一。Ct感染病程隱匿,往往不易被發(fā)覺而延誤治療。Ct嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生,為從宿主細(xì)胞中獲得營養(yǎng)物質(zhì)并順利完成其在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育周期。已有研究報(bào)道,衣原體感染可通過絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MAPK/ERK)途徑誘導(dǎo)高遷移率族蛋白1釋放進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡,也可通過阻止線粒體細(xì)胞色素C釋放和抑制半胱天冬酶Caspase的活性而抑制細(xì)胞凋亡[1-4]。pORF5是由Ct質(zhì)?;蚓幋a并主要定位于感染宿主細(xì)胞胞質(zhì)的一種分泌性效應(yīng)蛋白[5],既往研究證實(shí)pORF5質(zhì)粒蛋白與Ct致病密切相關(guān)[6-11]。為研究pORF5質(zhì)粒蛋白是否具有抗凋亡作用,本研究將構(gòu)建成功的慢病毒表達(dá)載體和空載體分別與輔助質(zhì)粒共同包裝重組慢病毒,建立pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和對照細(xì)胞株,測定腫瘤壞死因子α(TNF-α)作用后凋亡相關(guān)蛋白/基因的表達(dá)水平,分析pORF5質(zhì)粒蛋白對HeLa細(xì)胞凋亡的影響,為進(jìn)一步闡明Ct的致病機(jī)制提供依據(jù)。

    材料與方法

    一、主要試劑和細(xì)胞

    慢病毒載體系統(tǒng)(pMDlg-pRRE、pRsv-REV、pMD2G,PLenO-DCE)為上海英為信生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-APC/7-AAD(AnnexinⅤ-APC/7-AAD)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為美國eBioscience公司產(chǎn)品;RPMI1640為美國HyClone公司產(chǎn)品;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol總RNA抽提試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;HeLa細(xì)胞、293T細(xì)胞株來自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

    二、慢病毒的包裝與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建

    將已構(gòu)建成功含pORF5基因的重組慢病毒表達(dá)載體PLenO-DCE/pORF5和空載體PLenO-DCE分別與pMDlg-pRRE、pRsv-REV、pMD2G輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h,收集病毒上清并進(jìn)行濃縮與純化,采用倍比稀釋法檢測病毒滴度。將純化后的慢病毒感染HeLa細(xì)胞48 h,流式分選技術(shù)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,分別命名為pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa細(xì)胞,采用Western印跡對pORF5蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定。

    三、細(xì)胞培養(yǎng)及處理

    將pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別分成兩組,第1組為處理組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為20 μg/L的凋亡誘導(dǎo)劑TNF-α培養(yǎng)6 h;第2組為未處理組,直接更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

    四、細(xì)胞凋亡檢測

    pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa經(jīng)上述方法處理后,分別用4%的甲醛固定10 min,PBS洗滌后再加入Hoechst 33258(終濃度為10 mg/L)染色30 min,最后用PBS洗滌、封片,干燥,熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)收集處理后的pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa細(xì)胞,預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌后,1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/ml,然后將細(xì)胞分成4組,第1組為空白對照組,細(xì)胞不加任何試劑染料;第2組細(xì)胞加入Annexin V-APC;第3組細(xì)胞加入7-AAD,第2組和第3組作為單染對照組;第4組細(xì)胞同時(shí)加入Annexin V-APC和7-AAD。輕輕混勻并避光孵育15 min,2 h內(nèi)流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

    五、實(shí)時(shí)PCR檢測Caspase3、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)

    收集經(jīng)TNF-α處理的pORF5-HeLa細(xì)胞和對照HeLa細(xì)胞,參照Trizol總RNA抽提試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA作為模板,M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板,應(yīng)用SYBR Green I熒光染料嵌合法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,測定凋亡相關(guān)蛋白Caspase3和Bax mRNA的表達(dá),實(shí)驗(yàn)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)源性對照,引物序列見表1。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min,進(jìn)入94℃變性20 s,65℃退火30 s,72℃延伸45 s,40個(gè)循環(huán)后,分別測定各種目的基因和內(nèi)參基因GAPDH的PCR產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到一定閾值所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值),采用2-△△Ct方法計(jì)算Caspase3、Bcl-2和Bax基因的相對表達(dá)量。

    六、Western印跡鑒定Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

    收集經(jīng)TNF-α處理的pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞,PBS洗滌后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞,離心取上清進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到二氟化樹脂(PVDF)膜上,PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后,加入兔抗Bax和兔抗Bcl-2抗體,4℃冰箱孵育過夜,0.05%TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG,最后加入ECL顯色,膠片曝光顯影定影。Image Quant軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值,計(jì)算蛋白質(zhì)表達(dá)的相對強(qiáng)度。

    七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均采用±s表示,兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、慢病毒包裝及pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株的建立

    將慢病毒重組表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞48 h后,由于慢病毒載體攜帶GFP報(bào)告基因,熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光(圖1)。以不同稀釋度的慢病毒感染293T細(xì)胞,熒光顯微鏡下可見隨著病毒濃度的降低,綠色熒光細(xì)胞數(shù)逐漸減少(圖1A~1D)。根據(jù)公式計(jì)算出慢病毒滴度為1.5×109TU/ml。慢病毒感染HeLa細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后,流式細(xì)胞儀多次篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,純度達(dá)到95%以上(圖1E)。

    表1 基因?qū)崟r(shí)PCR引物序列

    二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞中pORF5質(zhì)粒蛋白表達(dá)的鑒定

    Western印跡分析發(fā)現(xiàn),pORF5-HeLa細(xì)胞在相對分子質(zhì)量28 000處出現(xiàn)一條特異性條帶,對照HeLa細(xì)胞無條帶出現(xiàn)(圖2)。

    三、pORF5對TNF-α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

    pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后,Hoechst染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的核固縮、碎裂,高亮藍(lán)色凋亡小體(圖3)。流式細(xì)胞儀檢測顯示,處理組pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞凋亡率分別為(35.5±4.5)%和(63.6±5.8)%,顯著高于相應(yīng)未處理組[(9.5±1.5)%和(7.9±0.9)%,t值分別為13.53、32.36,均P< 0.01],但TNF-α處理后pORF5-HeLa細(xì)胞凋亡率較對照HeLa細(xì)胞凋亡率降低28.1%(t=7.05,P<0.01)。見表2。

    四、TNF-α處理后Hela細(xì)胞Bax、Caspase3和Bcl-2 mRNA表達(dá)

    由表2可以看出,TNF-α處理后兩種細(xì)胞Bax和Caspase3 mRNA水平均顯著高于相應(yīng)未處理組(均P<0.01);處理組pORF5-HeLa細(xì)胞中Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)水平較處理組對照HeLa細(xì)胞分別降低72.8%和84.5%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為35.29、42.25,均P<0.01),但 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著高于處理組對照HeLa細(xì)胞(t=87.12,P< 0.01)。

    圖1 慢病毒包裝及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞株的構(gòu)建 采用倍比稀釋法稀釋慢病毒,然后以不同稀釋度的慢病毒感染293T細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察病毒感染情況。1A~1D:分別為慢病毒1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀釋;1E:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞株

    圖2 Western印跡鑒定pORF5蛋白的表達(dá) 1:對照HeLa細(xì)胞;2:pORF5-HeLa細(xì)胞

    圖3 Hoechst染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài) pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理6h,Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡情況,可見兩組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的核固縮、碎裂和高亮藍(lán)色凋亡小體等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(箭頭)

    五、Hela細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

    TNF-α處理后pORF5-HeLa細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平(1.12±0.15)顯著低于對照HeLa細(xì)胞組(7.95± 0.62)(t=17.58,P< 0.01),而Bcl-2蛋白表達(dá)水平(7.88±0.99)較對照HeLa細(xì)胞組(1.01±0.23)增加6.8倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.93,P<0.01)。見圖4。

    討 論

    pORF5體外能誘導(dǎo)白介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種炎癥因子產(chǎn)生,體內(nèi)能誘導(dǎo)小鼠生殖道免疫病理損傷[7-10],是Ct重要的毒力蛋白。為探討pORF5質(zhì)粒蛋白對細(xì)胞凋亡的影響,我們用慢病毒系統(tǒng)建立高表達(dá)pORF5蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株。由于慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞,可實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá),為在細(xì)胞中快速而高效地研究pORF5基因功能或pORF5基因表達(dá)產(chǎn)物功能提供了有利條件。

    細(xì)胞凋亡是宿主抗病原體感染的重要防御機(jī)制。除了在正常的生長發(fā)育和維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起重要作用外,細(xì)胞凋亡可激活炎癥反應(yīng),限制病原體傳播。Ct為一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌,為順利完成其在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育周期,Ct通過多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡[1-4]。為研究pORF5質(zhì)粒蛋白是否具有抗凋亡作用,本研究用凋亡誘導(dǎo)劑TNF-α刺激pORF5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa和對照HeLa細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TNF-α能誘導(dǎo)pORF5-HeLa和對照HeLa細(xì)胞凋亡,但pORF5-HeLa細(xì)胞凋亡率顯著低于對照HeLa細(xì)胞,說明pORF5能抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

    Bcl-2是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子[12],主要通過改變線粒體膜對一些離子、小分子或蛋白質(zhì)的通透性而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Bax為促凋亡蛋白,當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激后,Bax可誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C,激活Caspase3,而Caspase3是天冬氨酸特異性半胱氨酸酶家族關(guān)鍵的下游成員,Caspase3激活后可引起細(xì)胞凋亡??沟蛲龅鞍缀痛俚蛲龅鞍椎谋嚷蕸Q定了細(xì)胞對凋亡信號(hào)的敏感性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α處理細(xì)胞后,pORF5-HeLa細(xì)胞中促凋亡因子Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)水平較對照HeLa細(xì)胞顯著減少,Bax蛋白表達(dá)水平也顯著低于對照組,而抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著增加,說明pORF5質(zhì)粒蛋白能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),通過上調(diào)抗凋亡蛋白和下調(diào)促凋亡蛋白表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)抗細(xì)胞凋亡作用。

    我們利用慢病毒載體系統(tǒng),建立了pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞系和對照HeLa細(xì)胞系,穩(wěn)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后,發(fā)現(xiàn)pORF5可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)升高,同時(shí)降低Bax和Caspase3的mRNA表達(dá)水平,初步證實(shí)Ct質(zhì)粒蛋白pORF5可抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由于細(xì)胞凋亡是多蛋白嚴(yán)格控制的過程,pORF5質(zhì)粒蛋白如何抑制細(xì)胞凋亡,凋亡抑制后又如何參與Ct感染性疾病的的發(fā)生和發(fā)展尚待進(jìn)一步研究。

    表2 兩組HeLa細(xì)胞凋亡率以及Bax、Caspase3和Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平比較(±s)

    表2 兩組HeLa細(xì)胞凋亡率以及Bax、Caspase3和Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平比較(±s)

    注:n=3。t1、P1:pORF5-HeLa細(xì)胞與對照HeLa細(xì)胞之間比較;t2、P2:同一種細(xì)胞TNF-α 處理組與未處理組比較。a:pORF5-HeLa細(xì)胞比較結(jié)果;b:對照HeLa細(xì)胞比較結(jié)果。TNF-α:腫瘤壞死因子α

    組別pORF5-HeLa細(xì)胞對照HeLa細(xì)胞t1 P1 t2 P2凋亡率(%)TNF-α 處理35.5±4.5 63.6±5.8 12.85<0.01 13.53a<0.01a未處理9.5±1.5 7.9±0.9 1.99>0.05 32.36b<0.01b Bax mRNA TNF-α 處理1.58±0.25 5.81±0.48 35.29<0.01 51.13a<0.01a未處理0.45±0.09 0.49±0.10 2.43>0.05 87.25b<0.01b Caspase3 mRNA TNF-α 處理1.27±0.14 8.21±1.80 42.25<0.01 10.05a<0.01a未處理0.61±0.12 0.73±0.15 1.58>0.05 68.34b<0.01b Bcl-2 mRNA TNF-α處理7.04±0.12 0.95±0.10 87.12<0.01 75.24a<0.01a未處理1.21±0.51 0.92±0.91 22.65>0.05 1.68b>0.05b

    圖4 Western印跡分析Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 1:pORF5-HeLa細(xì)胞;2:對照HeLa細(xì)胞

    [1]R?del J,Grosse C,Yu H,et al.PersistentChlamydia trachomatisinfection of HeLa cells mediates apoptosis resistance through aChlamydiaprotease-like activity factor-independent mechanism and induces high mobility group box 1 release[J].Infect Immun,2012,80(1):195-205.DOI:10.1128/IAI.05619-11.

    [2]Fan T,Lu H,Hu H,et al.Inhibition of apoptosis in chlamydiainfected cells:blockade of mitochondrial cytochrome c release and caspase activation[J].J Exp Med,1998,187(4):487-496.DOI:10.1084/jem.187.4.487.

    [3]Kun D,Xiang-Lin C,Ming Z,et al.Chlamydiainhibit host cell apoptosis by inducing Bag-1 via the MAPK/ERK survival pathway[J].Apoptosis,2013,18(9):1083-1092.DOI:10.1007/s10495-013-0865-z.

    [4]Waguia KC,Tzivelekidis T,Gentle IE,et al.Infection of epithelial cells withChlamydia trachomatisinhibits TNF-induced apoptosis at the level of receptor internalization while leaving non-apoptotic TNF-signalling intact[J].Cell Microbiol,2016,18(11):1583-1595.DOI:10.1111/cmi.12598.

    [5]Li Z,Chen D,Zhong Y,et al.The chlamydial plasmid-encoded protein pgp3 is secreted into the cytosol of Chlamydia-infected cells[J].Infect Immun,2008,76(8):3415-3428.DOI:10.1128/IAI.01377-07.

    [6]Song L,Carlson JH,Whitmire WM,et al.Chlamydia trachomatisplasmid-encoded Pgp4 is a transcriptional regulator of virulenceassociated genes[J].Infect Immun,2013,81(3):636-644.DOI:10.1128/IAI.01305-12.

    [7]Liu Y,Huang Y,Yang Z,et al.Plasmid-encoded Pgp3 is a major virulence factor forChlamydia muridarumto induce hydrosalpinx in mice[J].Infect Immun,2014,82(12):5327-5335.DOI:10.1128/IAI.02576-14.

    [8]Ramsey KH,Schripsema JH,Smith BJ,et al.Plasmid CDS5 influences infectivity and virulence in a mouse model ofChlamydia trachomatisurogenital infection[J].Infect Immun,2014,82(8):3341-3349.DOI:10.1128/IAI.01795-14.

    [9]Zhou H,Huang Q,Li Z,et al.PORF5 plasmid protein ofChlamydiatrachomatisinduces MAPK-mediated proinflammatory cytokines via TLR2 activation in THP-1 cells[J].Sci China Life Sci,2013,56(5):460-466.DOI:10.1007/s11427-013-4470-8.

    [10]鄧紅玉,李忠玉,吳移謀,等.沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白誘發(fā)小鼠生殖道免疫損傷初步研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2013,33(2):107-111.DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2013.02.008.

    [11]馬康康,李忠玉,粟盛梅,等.pORF5質(zhì)粒蛋白拮抗LL37抗菌肽增強(qiáng)沙眼衣原體感染的初步研究[J].中華皮膚科雜志,2014,47(10):703-707.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.005.

    [12]Scarfò L,Ghia P.Reprogramming cell death:BCL2 family inhibition in hematological malignancies[J].Immunol Lett,2013,155(1-2):36-39.DOI:10.1016/j.imlet.2013.09.015.

    [13]Ghiotto F,Fais F,Bruno S.BH3-only proteins:the deathpuppeteer′s wires[J].Cytometry A,2010,77(1):11-21.DOI:10.1002/cyto.a.20819.

    《中國皮膚性病學(xué)書目提要及著者傳略》征文及研修班招生

    為了系統(tǒng)總結(jié)我國皮膚性病學(xué)文獻(xiàn)及介紹做出重要貢獻(xiàn)的著者,廖萬清院士、禤國維國醫(yī)大師領(lǐng)銜編輯《中國皮膚性病學(xué)書目提要及著者傳略》。凡為該書提供書目及著者傳略者、向籌建的中國皮膚科博物館贈(zèng)送文物者,可獲贈(zèng)《中國皮膚科學(xué)史》(600元)1冊。

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    陜西馬振友藥業(yè)有限公司,手機(jī)/微信:13227015533,13379033002;QQ:386966727。

    Inhibitory effect of Chlamydia trachomatis plasmid-encoded protein pORF5 on HeLa cell apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha

    Yang Xiaoyu,Zou Yan,Gong Silu,Bu Jichang,Zhou Zhou,Liu Liangzhuan,Li Zhongyu
    Institute of Pathogenic Biology,Medical College,University of South China,Hunan Provincial Key Laboratory for Special Pathogens Prevention and Control,Hengyang,421001,China

    Li Zhongyu,Email:lzhy1023@hotmail.com

    ObjectiveTo evaluate inhibitory effect ofChlamydia trachomatisplasmid-encoded protein pORF5 on HeLa cell apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha(TNF-α).MethodsThe recombinant lentiviral expression vector containing pORF5 gene and helper plasmids were co-transfected into 293T cells to prepare the recombinant lentivirus.Then,the lentivirus particles were collected and concentrated,and used to infect HeLa cells.Flow cytometric screening identified stable pORF5-expressing HeLa(pORF5-HeLa)cells.Meanwhile,the empty plasmid was transfected into HeLa cells to prepare control HeLa cells.The two cell lines were both divided into two subgroups to be treated with 20 μg/L TNF-α and fresh culture medium respectively for 6 hours.Then,Hoechst 33258 staining was performed to observe morphological changes of apoptotic cells,flow cytometry to detect cell apoptosis,real-time PCR to measure the mRNA expression of Caspase3,Bax and Bcl-2,and Western blot analysis to determine the protein expression of Bax and Bcl-2.ResultsAfter 6-hour treatment with TNF-α,Hoechst 33258 staining showed variable degrees of karyopyknosis and karyorrhexis,and highly-refractive blue apoptotic bodies in the pORF5-HeLa cells and control HeLa cells.The pORF5-HeLa cells and control HeLa cells both showed significantly higher apoptosis rate in the treated subgroup than in the untreated subgroup(pORF5-HeLa cells:35.5%±4.5%vs.9.5%±1.5%,t=13.53,P<0.01;control HeLa cells:63.6%±5.8%vs.7.9%±0.9%,t=32.36,P< 0.01).Compared with treated control HeLa cells,treated pORF5-HeLa cells showed significant decreases in mRNA expression of Bax(72.8%)and Caspase 3(84.5%)(t=35.29,42.25,respectively,bothP< 0.01),as well as in Bax protein expression(t=17.58,P< 0.01),but significant increases in Bcl-2 mRNA and protein(6.8 times)expression(t=87.12,18.93,respectively,bothP<0.01).ConclusionpORF5 plasmid protein can inhibit TNF-α-induced HeLa cell apoptosis likely by increasing the expression of anti-apoptotic protein bcl-2 and decreasing the expression of pro-apoptotic proteins Caspase-3 and Bax.

    Chlamydia trachomatis;Apoptosis;Tumor necrosis factor-alpha;Caspase3;bcl-2-Associated X Protein;B-cell lymphoma/Leukemia-2;pORF5 plasmid protein

    李忠玉,Email:lzhy1023@hotmail.com

    10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.007

    國家自然科學(xué)基金(31470277、81102230、31300156)

    Fund program:National Natural Science Foundation of China(31470277,81102230,31300156)

    2016-11-25)

    (本文編輯:尚淑賢)

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