吲哚胺2，3-雙加氧酶在尖銳濕疣皮損中表達的研究

謝震 陳源漢 王思宇 萬慧穎 雷華 楊戈 林昭春

610031成都，四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所（謝震、王思宇、萬慧穎、雷華、楊戈、林昭春）；廣東省醫(yī)學科學院 廣東省人民醫(yī)院腎內(nèi)科（陳源漢）

吲哚胺2，3-雙加氧酶在尖銳濕疣皮損中表達的研究

謝震 陳源漢 王思宇 萬慧穎 雷華 楊戈 林昭春

610031成都，四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所（謝震、王思宇、萬慧穎、雷華、楊戈、林昭春）；廣東省醫(yī)學科學院 廣東省人民醫(yī)院腎內(nèi)科（陳源漢）

目的分析尖銳濕疣組織中吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）水平，研究其局部代謝色氨酸的能力。方法免疫組化法觀察尖銳濕疣患者皮膚IDO蛋白表達情況，計數(shù)IDO陽性細胞的比例。免疫熒光觀察IDO（+）細胞與樹突細胞的關系。分離對照皮膚角質(zhì)形成細胞和疣體上皮細胞，色氨酸體外孵育后檢測上清液中色氨酸代謝產(chǎn)物犬尿氨酸的濃度以反映細胞代謝色氨酸的能力。結(jié)果IDO（+）細胞在正常皮膚中非常少，但在疣體表皮中卻大量聚集。疣體內(nèi)IDO（+）細胞/總體細胞48.3%±15.4%顯著高于正常皮膚5.2%±2.4%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IDO（+）細胞的熒光信號和皮膚朗格漢斯細胞并不重合，提示來源于疣體表皮細胞。從疣體組織分離的上皮細胞在體外代謝色氨酸的能力強于健康對照皮膚中分離的表皮細胞。結(jié)論尖銳濕疣疣體中存在大量的IDO（+）細胞，這些細胞可能參與尖銳濕疣的發(fā)病。

尖銳濕疣；吲哚胺-吡咯2，3-雙加氧酶；郎格爾漢斯細胞；免疫組織化學；熒光免疫測定

尖銳濕疣是人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起的一種性傳播疾病，免疫逃逸是引起HPV持續(xù)復制的關鍵原因［1］，但機制尚不清楚。吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）是沿犬尿氨酸途徑代謝色氨酸的限速酶，在調(diào)控機體的免疫耐受中發(fā)揮著作用。正常皮膚只有極少量的IDO存在于朗格漢斯細胞和角質(zhì)形成細胞中，但是在某些免疫障礙的皮膚疾病中，IDO卻大量表達，例如，扁平苔蘚、銀屑病、皮膚肉芽腫和白癜風［2-4］。IDO是否參與了尖銳濕疣的發(fā)病，目前尚無研究。本研究通過免疫組化分析尖銳濕疣組織中IDO水平，并對其局部代謝色氨酸的能力進行了研究，以探討該分子在尖銳濕疣發(fā)病中的作用。

對象與方法

一、對象

納入30例疣體超過5 mm的尖銳濕疣患者，其中男17例，女13例，年齡（28±8）歲，平均有（4.5±2.8）個疣體。男性皮損取材部位包括包皮、陰阜、陰莖根部和肛周，女性患者皮損取材部位包括大、小陰唇、肛周、會陰。疣體感染HPV分型包括6、11、42和43型，患者最少感染1個型別，最多同時感染3個型別。30例患者中11例復發(fā)，其中7例為原位復發(fā)，4例為新部位復發(fā)，復發(fā)時間為2.4～5.9個月。12例行包皮環(huán)切的健康人包皮作為對照皮膚，年齡（30±9）歲，與尖銳濕疣患者年齡比較無差異（P＞0.05）。尖銳濕疣患者排除標準：①納入前6周接受過疣體治療；②接受過免疫抑制藥物或糖皮質(zhì)激素治療；③患有先天或后天免疫缺陷疾??；④經(jīng)病史詢問、體檢及實驗室指標符合自身免疫性疾??；⑤近1周內(nèi)有發(fā)熱、咳嗽、腹瀉及尿頻、尿急尿痛等感染性疾病表現(xiàn)。本研究通過四川省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，入選者均簽署知情同意書。所有納入治療的患者均根據(jù)《尖銳濕疣診療指南》的方案進行治療［5］，在盡可能切除疣體后，用CO2激光去除疣體聯(lián)合局部外用咪喹莫特軟膏治療。患者治療后均隨訪半年觀察復發(fā)情況。

二、主要試劑及儀器

鼠抗人抗IDO（ab55305）、鼠抗人抗CD1a抗體（ab201337）、兔抗人抗IDO1抗體（ab76157）均購于美國Abcam公司。alexa488標記的驢抗鼠IgG（A-21202）、alexa555標記的驢抗兔IgG抗體（A-31572）均購于美國Invitrogen公司。色氨酸、1-甲基-色氨酸均購于美國Sigma-Aldrich公司。

三、方法

1.免疫組化方法定量IDO（+）細胞：取最大的疣體進行免疫組化檢測。皮膚取樣經(jīng)福爾馬林液處理后石蠟包埋。用鼠抗人抗IDO（1∶100）作為一抗，根據(jù)Immuno CruzTM鼠ABC染色系統(tǒng)進行免疫組化檢查。生物素標記的二抗作用后孵育抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶，鄰苯二胺法顯色。IDO（+）細胞由兩位病理醫(yī)生獨立雙盲閱片計數(shù)。隨機選取3個表皮高倍視野（×400）分別計數(shù)IDO（+）細胞和細胞總數(shù)，取平均數(shù)作為該例患者的結(jié)果。

2.免疫熒光檢查朗格漢斯細胞和IDO（+）細胞：石蠟包埋組織切片脫蠟后經(jīng)熱處理修復抗原。用流動的冷Tris緩沖液（pH7.4）沖洗后，分別用鼠抗人的抗CD1a抗體（1∶50）和兔抗人抗IDO1抗體（1∶100）作為染色朗格漢斯細胞和IDO（+）細胞的一抗進行孵育，然后分別加入alexa488標記的驢抗鼠IgG（1∶1 000）和alexa555標記的驢抗兔IgG抗體（1∶1 000）作為二抗。同型鼠抗體作為一抗的陰性對照。用熒光顯微鏡（Zeiss Axio Imager Z1）觀察熒光強度。

3.皮膚提取細胞的IDO活性：除用于免疫組化的疣體外，其余疣體用于提取上皮細胞。由于4例復發(fā)者只有單個疣體，最終只有26例用于IDO活性檢測。正常皮膚對照取自健康包皮環(huán)切術的包皮皮膚。用此前文獻報道的方法提取對照皮膚角質(zhì)形成細胞（KC）和疣體上皮細胞（epidermal cell from warts，EC-W），并制備細胞懸液［6］。操作均在無菌條件下進行，簡要描述：去掉脂肪和結(jié)締組織后，皮膚組織被切為0.5 cm×0.5 cm小片。待用0.25%胰酶溶液4℃過夜消化使真皮和表皮分離后，用無菌鑷分離表皮。搗碎表皮組織后加入含10%人血清的角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基中和胰酶，然后將組織碎塊混合物通過70 μm的細胞過濾器。梯度離心法去除死細胞后收獲分離的KC或EC-W。

用細胞體外將色氨酸代謝為犬尿氨酸的能力來反映IDO活性。將分離的KC或EC-W洗滌2遍后按1×105/L重懸于含100 μmol/L色氨酸的Hanks液中孵育4 h［7］。收集上清，用高效液相色譜檢測上清液犬尿氨酸濃度，其濃度作為IDO酶學活性［7］。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和IDO基因質(zhì)粒的HEK293細胞分別作為陰性和陽性對照。為了說明色氨酸向犬尿氨酸轉(zhuǎn)換是否依賴IDO，部分實驗在Hanks液中加入了200 μmol/L的IDO特異性抑制劑1-甲基-色氨酸。

4.統(tǒng)計方法：結(jié)果用x±s表示，兩組間和多組間比較采用方差分析，多組間比較在總體差異有統(tǒng)計學意義后行Post Hoc分析。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、疣體組織高表達IDO

正常對照皮膚僅在基底層可見少量IDO（+）細胞，在鱗狀上皮細胞層中幾乎見不到IDO（+）細胞（圖1A），但是尖銳濕疣患者的疣體內(nèi)高表達IDO（圖1B）。疣體內(nèi)IDO（+）細胞/總細胞百分率48.3%±15.4%顯著高于正常皮膚5.2%±2.4%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IDO分布于胞質(zhì)（圖1C方框中放大圖）。疣體的這些IDO（+）細胞廣泛分布于表皮中，真皮僅見個別散在分布。特別是，復發(fā)患者在初診（圖1C）和復發(fā)時（圖1D）的IDO（+）細胞在疣體組織中顯色都非常明顯，復發(fā)者IDO（+）細胞/總細胞百分率65.5%±22.5%顯著高于未復發(fā)者22.4%±10.3%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

免疫熒光證實，IDO在對照皮膚中幾乎為陰性，而大量IDO（+）細胞分布在疣體中。IDO的熒光和朗格漢斯細胞標記物CD1a的熒光并不重合（圖2）。結(jié)合免疫組化顯示IDO（+）細胞為異常的角質(zhì)形成細胞或空泡細胞，上述結(jié)果表明，疣體局部增多的IDO主要來源于異常的角質(zhì)形成細胞，而不是來源于皮膚朗格漢斯細胞。

二、尖銳濕疣局部色氨酸代謝

圖1 免疫組化顯示對照皮膚和尖銳濕疣疣體組織中IDO（+）細胞（鄰苯二胺法×100）1A：來源于包皮環(huán)切術的對照皮膚，幾乎無IDO表達，僅在表皮基底層可見表達；1B：未復發(fā)的尖銳濕疣疣體組織，表皮中聚集較多IDO（+）細胞；1C：尖銳濕疣疣體組織表現(xiàn)為典型的棘層細胞肥厚和棘層細胞肥厚伴乳頭瘤樣增生。表皮部分幾乎完全被IDO（+）細胞占據(jù)。紅框為典型IDO（+）細胞的放大圖（×200）；1D：尖銳濕疣復發(fā)后疣體組織仍有大量IDO（+）細胞浸潤

圖2 免疫熒光顯示IDO和朗格漢斯細胞位置關系 2A：免疫熒光顯示正常皮膚散在少量分枝狀CD1a（+）朗格漢斯細胞，IDO（+）細胞幾乎為陰性；2B：尖銳濕疣聚集大量IDO（+）細胞，IDO的紅色熒光極少與綠色的CD1a熒光重合。綠色、紅色和藍色熒光分別顯示CD1a、IDO和細胞核（DAPI染色）。白色箭頭表示朗格漢斯細胞

KC幾乎不具有代謝色氨酸為犬尿氨酸的能力，但EC-W卻具有這種能力。加入1-甲基-色氨酸可以顯著抑制EC-W代謝色氨酸的能力（表1），表明EC-W代謝色氨酸依賴IDO的酶學活性。表明疣體組織IDO（+）細胞增強了局部色氨酸代謝能力。

討 論

IDO是一種介導免疫耐受的關鍵分子，通過多種途徑調(diào)節(jié)機體免疫。色氨酸是T淋巴細胞增殖的必需氨基酸，IDO代謝色氨酸的效應可抑制T細胞的增殖；色氨酸被IDO代謝生成的犬尿氨酸也能促進免疫耐受［8］。另外，IDO的分子結(jié)構包含一段免疫受體酪氨酸抑制基序，該結(jié)構進一步正反饋放大IDO介導的免疫耐受作用［9］。IDO介導的色氨酸缺失和犬尿氨酸升高還會誘導調(diào)節(jié)性T細胞［10-11］。這些多途徑免疫抑制效應使該分子近年來受到廣泛關注。

表1 對照皮膚和疣體組織提取細胞的吲哚胺2，3-雙加氧酶活性

既往報道在扁平苔蘚、單純皰疹、特應性皮炎、銀屑病和慢性盤狀紅斑狼瘡的皮損中，IDO主要分布于真皮組織，表皮IDO幾乎沒有變化［2］，這與我們在尖銳濕疣局部發(fā)現(xiàn)IDO的分布規(guī)律不同。尖銳濕疣主要累及表皮，而上述皮膚病同時累及表皮和真皮，這可能是不同病種IDO分布部位不同。尖銳濕疣中IDO高表達的機制尚不清楚。在一些病毒感染性皮膚病中，感染會誘導IDO高表達，例如，皮膚單純皰疹病毒感染［2］。轉(zhuǎn)染了HPV癌蛋白e7基因的小鼠皮膚高表達IDO［12］，提示HPV的某些蛋白可能會誘導皮膚IDO表達。

我們進一步發(fā)現(xiàn)這些疣體局部的IDO（+）細胞具有代謝色氨酸的能力。此前的體外實驗表明，皮膚組織IDO增加可以抑制T淋巴細胞增生［13］。轉(zhuǎn)染了HPV蛋白的小鼠高表達IDO，這類小鼠的皮膚作為移植供體的排斥反應弱，給予IDO抑制劑可重建皮膚的排斥反應［12］。本研究提示，尖銳濕疣局部增加的IDO（+）細胞通過形成色氨酸缺失微環(huán)境介導免疫耐受，可能是尖銳濕疣發(fā)病的一種新機制。另外值得一提的是，IDO（+）細胞在復發(fā)個體的疣體內(nèi)大量聚集，提示IDO可能參與了尖銳濕疣復發(fā)。由于缺乏這些患者復發(fā)前的IDO資料，我們無法分析IDO水平和復發(fā)之間的關系。由于樣本量的限制，我們沒有分析IDO表達是否和HPV分型有關，也沒有研究其他臨床指標和IDO水平的關系，例如，性別和年齡。因此，疣體中IDO大量增加的機制和臨床意義尚待更多的研究。

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Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in condyloma acuminatum lesions

Xie Zhen,Chen Yuanhan,Wang Siyu,Wan Huiying,Lei Hua,Yang Ge,Lin Zhaochun
Institute of Dermatology and Venereology,Sichuan Academy of Medical Sciences and Sichuan Provincial People′s Hospital,Chengdu 610031,China（Xie Z,Wang SY,Wan HY,Lei H,Yang G,Lin ZC）;Department of Nephrology,Guangdong Academy of Medical Sciences,Guangdong General Hospital,Guangzhou 510080,China（Chen YH）

Xie Zhen,Email:xiezhen6289@126.com

ObjectiveTo measure the expression of indoleamine 2,3-dioxygenase（IDO）in condyloma acuminatum（CA）lesions,and to evaluate its ability to locally metabolize tryptophan.MethodsImmunohistochemical study was performed to observe the protein expression of IDO in skin lesions of patients with CA,and count the number of IDO-positive cells.Immunofluorescence assay was conducted to estimate the relationship between IDO-positive cells and dendritic cells.Epidermal cells and keratinocytes were isolated from warts of 30 patients with CA and prepuces of 11 healthy controls respectively,and bothin vitroincubated with tryptophan solution for 4 hours.Then,high-performance liquid chromatography（HPLC）was performed to detect the level of tryptophan metabolite,kynurenine,in the culture supernatant of the above cells,which could reflect the ability of epidermal cells to metabolize tryptophan.ResultsRare IDO-positive cells were found in the normal skin,but a lot of IDO-positive cells gathered in the epidermis of the wart tissues.The IDO-positive cell/total cell ratio was significantly higher in the wart tissues than in the normal skin（48.3%±15.4%vs.5.2%±2.4%,P＜0.05）.The fluorescence signals of IDO-positive cells and CD1a-positive Langerhans cells were not overlapped with each other,suggesting that IDO-positive cells were derived from epidermal cells of the wart tissues.Compared with the keratinocytes from the healthy skin,the epidermal cells from warts had a stronger ability to metabolize tryptophanin vitro.ConclusionA large number of IDO-positive cells exist in CA warts,and may be involved in occurrence of CA.

Condylomata acuminata;Indoleamine-pyrrole 2,3,-dioxygenase;Langerhans cells;Immunohistochemistry;Fluoroimmunoassay

謝震，Email：xiezhen6289@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.006

四川省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題（16PJ440）

Fund program:Research Program of Health and Family Planning Commission of Sichuan Province of China（16PJ440）

2016-03-02）

（本文編輯：吳曉初）