雙氫青蒿素對UVB誘導的人皮膚HaCaT細胞凋亡的保護作用

惠海英 白靜靜 孫晶瑩 劉 楊 肖生祥

·論著·

陜西省中醫(yī)藥管理局(編號：2015lc039)

陜西省社會發(fā)展科技攻關項目(編號：2016sf-156)

1陜西省人民醫(yī)院，陜西西安，710068

2西安交通大學第二醫(yī)院，陜西西安，710004

惠海英，E-mail: haiyinghui@163.com

雙氫青蒿素對UVB誘導的人皮膚HaCaT細胞凋亡的保護作用

惠海英1白靜靜1孫晶瑩1劉 楊1肖生祥2

目的明確雙氫青蒿素(DHA)對UVB誘導人皮膚HaCaT細胞凋亡的保護作用。方法將體外培養(yǎng)的HaCaT細胞分為空白對照組，UVB 照射組和UVB+DHA(20、40、60、80 μmol/L)組，采用 MTT法檢測細胞系的增殖情況，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，RT-PCR法檢測抗凋亡基因survivin和促凋亡基因caspease-3(激活型)mRNA水平，Western檢測相關蛋白表達水平。結(jié)果30 mJ/cm2UVB照射24 h后，UVB組和UVB+DHA(20、40、60、80 μmol/L)組細胞的增殖率分別為空白對照組的(50.13±2.42)%，(60.23±2.30)%,(69.24±3.19)%,(79.37±2.47)%和(70.41±2.24)%。UVB組和UVB+60 μmol/L DHA組中HaCaT細胞凋亡率分別為(46.7±3.2)%和(23.71±1.2)%。與UVB組比較，UVB+60 μmol/L DHA組中HaCaT細胞caspase-3 mRNA及蛋白表達降低、survivin mRNA及蛋白表達升高。結(jié)論DHA可抑制UVB所致HaCaT細胞的凋亡，其機制可能與survivin和caspase-3有關。

雙氫青蒿素； HaCaT細胞； caspease-3; UVB

近年來，紫外線對人體的損傷已引起人們的廣泛關注，資料表明日光中的紫外線特別是中波紫外線(ultraviolet B, UVB)與皮膚的光老化、光損傷和光致癌的發(fā)生密切相關，嚴重威脅著人類的身體健康[1,2]。因此開發(fā)紫外線防護藥物尤為重要?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)青蒿中含有多種藥用成分具有抗菌、抗寄生蟲、解熱抗炎以及免疫抑制等作用，且毒性極低，無毒副作用。很多學者將青蒿素及其衍生物用于光敏性皮膚病的治療[3-6]，取得了較好的療效，但機制尚不清楚。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)是青蒿素類藥物在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物。本研究通過UVB誘導HaCaT細胞損傷，建立UVB損傷皮膚細胞模型，通過觀察細胞增殖活性及凋亡情況，檢測凋亡抑制蛋白survivin和凋亡蛋白caspase-3的表達水平，探討DHA對UVB導致HaCaT細胞損傷的拮抗作用，為開發(fā)新型抗皮膚損傷產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及藥物、儀器

1.1.1.1 細胞 永生化人角質(zhì)形成細胞株(HaCaT細胞)為第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院皮膚科李承新教授饋贈。

1.1.1.2 藥物 DHA(分子式C15H24O5, 分子量284.35 kd)購于西安昊軒生物技術有限公司，純度98%。

1.1.1.3 試劑 RPMI 1640液、胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)，噻唑蘭(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國sigma公司)。Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。survivin、caspase-3兔多克隆抗體和β-actin以及相應的二級抗體(美國SANTA公司)。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)。PCR引物由北京華大生物工程技術服務有限公司合成。

1.1.1.4 儀器 電泳儀(美國Bio-RAD公司)、 酶標儀(美國Bio-Tek公司)、電轉(zhuǎn)槽(美國Bio-RAD公司)、流式細胞儀(美國BD-FACScalibur)、7500型實時定量PCR檢測儀(美國 ABI公司)、SS-03B型光療儀(上海sigma公司，波長311 nm)

1.2 方法

1.2.1 HaCaT細胞株培養(yǎng) 接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，80%匯合后胰蛋白酶消化法傳代培養(yǎng)，于傳代后第2天換液。取對數(shù)生長期細胞制成4×104個/mL單細胞懸液，接種于6孔板后繼續(xù)培養(yǎng)24 h給藥。

1.2.2 中波紫外線照射 待細胞生長至每孔融合80%～90%時,吸去培養(yǎng)基,加入2 mL Phosphate Buffer Solution(PBS)緩沖液,對照組用錫箔紙蓋住,其余組細胞暴露于UVB燈管下,照射距離約為10 cm，輻射劑量為30 mJ/cm2。紫外線照射后,吸去PBS，并在各孔中重新加入培養(yǎng)液繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。

“哎呀，傻妹子，怎么就沒關系呢。楊連長可是老刀一手帶出來的。老刀在河北路上撿到他，那時他還是個大毛孩，一路南征北戰(zhàn)出生入死，他們是知根知底的難兄難弟?；畹浇裉?，很不容易啊。所以，聽句姐的勸，錯不了。”向陽花站起身，拉一把田志芳，“回去吧，要不老刀和楊連長等著急了。回家，你自個兒琢磨琢磨姐今天說的話，看有幾份道理不？”

1.2.3 藥物處理 雙氫青蒿素以二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為10-1mol/L儲存液(DMSO濃度≤1‰)，-20℃避光保存，用時用DMEM培養(yǎng)液將二氫青蒿素稀釋配成20、40、60、80 μmol/L的工作液，加入藥物工作液后，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進行后續(xù)實驗。

1.2.4 實驗分組 將HaCaT細胞分為3組。A 組:空白對照組,不加DHA，不照射UVB;B組:UVB照射組,不加DHA;C組:DHA組即照射UVB并給予一定濃度(20、40、60、80 μmol/L DHA)。

1.2.5 HaCaT細胞細胞形態(tài)學觀察 將HaCaT細胞消化后調(diào)整細胞密度為4.0×104個/mL，以每孔1 mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，照射UVB后(除空白對照組)，分別加入含雙氫青蒿素0、20、40、60、80 μmol/L的培養(yǎng)液2 mL，培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.6 MTT法檢測HaCaT細胞增殖率 取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞數(shù)為4.0×104個/mL，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后去原培養(yǎng)液進行實驗。對照組及處理組各100 μL，每個濃度設3個復孔，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT(5 ng/mL)20 μL。培養(yǎng)結(jié)束時，棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標儀分別測定培養(yǎng)24 h吸光度(A570值)，細胞活性以細胞增殖率表示，細胞增殖率=(處理組平均A值/空白對照組平均A值)×100%。

1.2.7 流式細胞儀Annexin V/PI檢測HaCaT細胞早期及中晚期總凋亡率 HaCaT細胞經(jīng)UVB照射后，加入濃度60 μmol/L DHA工作液培養(yǎng)48 h后，經(jīng)0.25% Trypsin-EDTA消化，200 g離心6 min，培養(yǎng)液棄去，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，收集的細胞經(jīng)70%的乙醇 4℃固定2 h，14000 g離心2 min，固定液棄去，PBS緩沖液(含5 mmol/L EDTA)500 μL 進行細胞重懸，再經(jīng)RNA酶室溫孵育 30 min，以1×binding buffer制成單細胞懸液，置于流式管，每組設6個樣，加Annexin V-FITC 10 μL與PI 5 μL，混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入1×binding buffer充分混合后于流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.2.8 實時定量PCR檢測HaCaT細胞caspase-3、survivin mRNA表達 HaCaT細胞經(jīng)UVB照射后，加入濃度60 μmol/L DHA工作液培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)液，經(jīng)0.25%胰蛋白酶液分別制成細胞懸液，分別裝入離心管，1500 rpm離心，收集細胞，利用TaKaRa細胞總RNA抽提試劑盒提取各組細胞總RNA，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為CDNA，采用熒光定量PCR試劑盒按照說明書以CDNA為模板進行PCR反應，然后使用ABI7500 PCR儀進行熒光PCR。引物由上海華大生物公司合成(表1)。實時定量PCR反應條件：94℃預變性3 min，擴增40個循環(huán)，每循環(huán)中，94℃變性30 s，57℃退火30 s ，72℃延伸45 s，采集熒光信號；40循環(huán)結(jié)束后，經(jīng)94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 45 s，采集熔解曲線。使用7500型Real-time PCR儀分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。以β-actin為內(nèi)參基因，計算同一樣本中目的基因與內(nèi)參基因的含量比值，評價目的基因的表達水平。每個樣本取3個復孔，PCR重復3次。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.9 Western-blot檢測細胞caspase-3、survivin蛋白表達 HaCaT細胞經(jīng)UVB照射后，加入濃度60 μmol/L DHA工作液培養(yǎng)48 h后進行試驗，以含0.1% DMSO的培養(yǎng)基為陰性對照組。Western blot檢測caspase-3、survivin蛋白表達水平，β-actin作為內(nèi)參蛋白，按照如下步驟進行操作：進行處理后細胞收集，4℃預冷PBS液洗3次，加入細胞勻漿液(50 mmol/L This-HCl pH=7.4，1% TritonX-100，0.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L EDTA)，4℃、12000 g條件下離心10 min，吸取上清，收集蛋白，收集細胞后用SDS上樣緩沖液處理，檢測總蛋白濃度，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，上樣量(30 μg)，濕轉(zhuǎn)NC膜，用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉30 min，不同濃度稀釋一抗caspase-3(1∶1 000)或survivin(1∶500)孵育 ，4℃過夜，HRP標記抗鼠/兔IgG二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜，化學發(fā)光試劑顯色、掃描并進行吸光度分析、計算蛋白相對表達水平。

2 實驗結(jié)果

2.1 DHA對UVB照射HaCaT細胞形態(tài)學影響 倒置顯微鏡下可見對照組HaCaT細胞生長旺盛，折光率較高，胞體大，形態(tài)成梭形或多邊形，胞質(zhì)均勻透明，隨培養(yǎng)時間的延長形態(tài)無明顯變化。UVB照射后的HaCaT細胞增殖減慢，細胞逐漸變小、變圓，折光率減弱，DHA干預后細胞逐漸變大，折光性增高(圖1)。

2.2 DHA對UVB照射HaCaT細胞增殖的影響 與對照組相比，30 mJ/cm2UVB照射可使細胞24 h后的增殖率顯著下降至對照組的50.13%±2.42%(P<0.05) ;但加入不同濃度的DHA可明顯減弱UVB組的作用，其中20 μmol/L DHA可使細胞增殖率恢復至60.23%±2.30%，40 μmol/L時可使細胞增殖率恢復至69.24%±3.19%，60 μmol/L時可使細胞增殖率恢復至79.37%±2.47%，80 μmol/L可使細胞增殖率恢復至70.41%±2.24%，與UVB組相比，有顯著差異(P<0.05) 。DHA在4個藥物濃度下均表現(xiàn)出一定的防護作用，但未表現(xiàn)出隨著質(zhì)量濃度增加效果增強的效應關系(表2)，可能是由于處于效果平臺期所致。在上述藥物濃度范圍內(nèi)，藥物本身對細胞無損傷作用。DHA具有防護UVB致人HaCaT細胞的作用，即提高了HaCaT細胞在UVB輻射作用下的存活率。

a 對照組;b UVB組;c DHA組

2.3 DHA對UVB照射HaCaT細胞凋亡的影響 根據(jù)MTT檢測結(jié)果我們選定60 μmol/L作為DHA處理藥物濃度。HaCaT細胞預處理后用60 μmol/L DHA刺激24 h。結(jié)果顯示，與對照組比較，UVB組顯著增加了HaCaT細胞凋亡，凋亡率增加了(46.7±3.2)%(t=3.78,P<0.05)，而DHA組則降低了UVB組的凋亡率，凋亡率為(23.71±1.2)%(與UVB組比較，t=4.38,P<0.05)。結(jié)果表明，DHA可抑制UVB照射所引起的HaCaT細胞凋亡。

2.4 DHA對UVB照射HaCaT細胞caspase-3、survivin mRNA表達的影響 細胞處理24 h后，進行檢測，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，UVB組及DHA組HaCaT細胞caspase-3 mRNA表達增加、survivin mRNA表達降低，但UVB組變化更明顯(*P<0.05)。同時與UVB組比較，DHA組HaCaT細胞caspase-3 mRNA表達降低，survivin mRNA表達增加(#P<0.05)(圖2)。

圖2 不同處理組caspase-3、survivin mRNA表達

2.5 DHA對UVB照射HaCaT細胞caspase-3、survivin蛋白表達的影響 細胞處理48 h后，進行檢測，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，UVB組survivin蛋白表達降低，caspase-3蛋白表達增強(*P<0.05)。而DHA組明顯減弱了UVB對HaCaT細胞的這一作用(#P<0.05)(圖3)。

圖3 caspase-3、survivin 蛋白表達

3 討論

自然光中的紫外線輻射是誘發(fā)人類皮膚癌的重要環(huán)境因素。美國每年約有一百萬人被確診為皮膚癌，皮膚癌也是美國最常見的癌癥之一[7]。動物模型試驗證明了UV輻射不僅是腫瘤誘發(fā)劑而且還是腫瘤促進劑，關于紫外線誘導腫瘤的確切機制仍不清楚，大量研究表明UVB對角質(zhì)形成細胞的DNA損傷是誘發(fā)皮膚腫瘤的基礎。由于細胞凋亡與皮膚腫瘤發(fā)生的相關性，長期或大量UVB輻射可誘導凋亡相關蛋白的表達。近年來紫外線誘導細胞凋亡尤其是角質(zhì)形成細胞凋亡引起了人們的關注[8]。

Caspase是執(zhí)行凋亡的主要酶類，被稱為死亡蛋白酶,是細胞凋亡的中樞效應器，細胞凋亡后期的共同途徑由caspase激活[9]。Caspase蛋白酶家族在細胞凋亡中的一個重要作用是使保護細胞遠離凋亡的各種蛋白失活。Caspase-3處于caspase蛋白酶系的核心地位，在caspase酶系級聯(lián)反應中發(fā)揮重要作用。是細胞凋亡中重要的促凋亡因子。UVB輻射后產(chǎn)生的ROS可促進細胞凋亡，增加細胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)，降低線粒體膜電位，激活caspase-3蛋白[10]，最終引起細胞凋亡。

survivin蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中新的一員，于1997年被 Ambrosinin在人類基因組庫的雜交篩選分離出來，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子[11]。survivin蛋白具有調(diào)控細胞周期和細胞凋亡的雙重功能。survivin蛋白廣泛表達于人的胚胎組織和各種腫瘤組織，也表達于少數(shù)正常成人組織，包括人體皮膚組織。在人體皮膚KSCs及黑素細胞、成纖維細胞均有表達。survivin蛋白在維持人類角質(zhì)形成細胞周期變化及細胞增殖中起很重要的作用[12]，通過抑制其caspase-3、caspase-7活性而抑制細胞凋亡[13]。

近年來臭氧層破壞嚴重，照射到地面的紫外線逐年增強,伴隨著人口老齡化加速,抵抗皮膚光損傷已成為人們關注的重點，預防和延遲皮膚光老化已成為一個重大的醫(yī)學問題。中藥是拮抗皮膚光損傷的一種有效手段,在改善和防治皮膚光損傷方面具有巨大的潛力。大量天然植物防光研究的結(jié)果肯定了中藥及提取物對皮膚光損傷的治療作用。枸杞、綠茶等干預UVB輻射的HaCaT細胞，明顯抑制細胞內(nèi)SOD、GSH-Px下降、降低MDA產(chǎn)生量[14]。黃芪可以減少UVB射線誘發(fā)的皮膚上皮細胞IL-6、TNF-α含量，從而減輕UVB對HaCaT細胞的損傷[15]。

近年來,在臨床上以青蒿為主的復方用來治療風濕或類風濕疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤形紅斑狼瘡、皮膚病(濕疹、多形紅斑、多形日光疹、夏令水皰病)等,均取得了較好的療效。有學者認為青蒿素有抑制變態(tài)反應性皮炎，抗光感作用[3-6]，這為其光保護作用提供了一定的臨床依據(jù)。青蒿素及其衍生物有抗瘧、抗孕、抗血吸蟲、抗纖維化、抗弓形蟲、抗心律失常和腫瘤細胞毒性等作用,并具有復雜的免疫調(diào)節(jié)機制[16]，這為其光保護作用提供了一定的理論依據(jù)。

目前研究防治皮膚光損傷的機制主要集中在增強清除自由基能力方面，從細胞凋亡角度進行研究的相關報道較少。DHA是青蒿素類藥物在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物，我們以DHA作為干預藥物，以人角質(zhì)形成細胞HaCaT細胞作為研究對象，研究了DHA對UVB誘導HaCaT細胞凋亡的抑制作用。我們發(fā)現(xiàn)，UVB可以抑制HaCaT細胞增殖和活力，誘導細胞凋亡。DHA卻減弱了UVB引起的HaCaT細胞增殖抑制作用，但未表現(xiàn)出隨著DHA濃度增加效果增強的效應關系，可能是由于處于效果平臺期所致。同時我們選取了抑癌基因survivin及促癌基因caspase-3，通過RT-PCR及western-blot檢測也觀察到30 mJ/cm2的UVB可以降低HaCaT細胞survivin蛋白表達降低,增加caspase-3的表達。而DHA明顯減弱了UVB對HaCaT細胞的這一作用。以上結(jié)果提示DHA可抑制UVB所致的HaCaT細胞凋亡，具有一定的光保護作用，且該作用可能是通過凋亡相關因子survivin及促癌基因caspase-3來實現(xiàn)。

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ProtectiveeffectofdihydroartemisininonHaCaTcellapoptosisinducedbyUVB

HUIHaiying1,BAIJingjing1,SUNJingying1,LIUYang1,XIAOShengxiang2.

1.ShaanxiProvincialPeople'sHospital,Xi'an710068,China; 2.TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710004,China

HUIHaiying,E-mail:haiyinghui@163.com

Objective: To determine the protective effect of dihydroartemisinin (DHA) on HaCaT cells apoptosis induced by UVB.MethodsHaCaT cells cultured in vitro were divided into blank control group, UVB group and UVB+DHA (20, 40, 60, 80 μmol/L) group. The proliferation of HaCaT cells, cell apoptosis, mRNA levels of anti-apoptotic gene survivin and pro-apoptotic gene caspease-3 and corresponding protein levels were detected by MTT, flow cytometric analysis, qRT-PCR and Western blotting.ResultsAfter the HaCaT cells was irradiated for 24 hs, the proliferation of the cells in the UVB group and UVB+DHA (20, 40, 60, 80 μmol/L) groups was (50.13±2.42)%, (60.23±2.30)%, (69.24±3.19)%, (79.37±2.47)% and (70.41±2.24)% of the blank control group. The apoptosis rate in the UVB group and UVB+60 μmol/L DHA group was (46.7±3.2)% and (23.71±1.2)%. Compared with the UVB group, the mRNA and protein levels of pro-apoptotic gene caspease-3 in the UVB+60 μmol/L DHA group was decreased and the levels of anti-apoptotic gene survivin was increased.ConclusionDHA inhibits the apoptosis of HaCaT cells induced by UVB, which may be related with caspase-3 and survivin.

dihydroartemisinin; HaCaT cells; caspase-3; UVB

(收稿：2017-05-10 修回：2017-06-22)