基于NRPSs基因篩選與鑒定海蘆筍內(nèi)生細(xì)菌

李代婧，殷躍，劉夢婕，衛(wèi)婷，郭佳，辛志宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)

基于NRPSs基因篩選與鑒定海蘆筍內(nèi)生細(xì)菌

李代婧，殷躍，劉夢婕，衛(wèi)婷，郭佳，辛志宏*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)

利用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法分離鑒定海蘆筍內(nèi)生細(xì)菌，并篩選含有NRPS基因的菌株(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)，以期獲得能夠產(chǎn)生環(huán)肽化合物的菌株。研究結(jié)果表明，共從海蘆筍中分離到6株內(nèi)生細(xì)菌Srtli-F1～Srtli-F6，分別鑒定為綠針假單胞菌橙黃亞種(Pseudomonaschlororaphissubsp.aurantiaca)、組氨酸節(jié)桿菌(Arthrobacterhistidinolovorans)、慶盛芽孢桿菌(Bacillusqingshengii)、類芽孢桿菌羽扇豆根瘤菌(Paenibacilluslupini)、假蕈狀芽孢桿菌(Bacilluspseudomycoides)、高山麝病原性阿爾伯蒂埃希氏桿菌(Escherichiaalbertii)，其中菌株Srtli-F5檢測到含有NRPS基因，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，預(yù)測該菌株可能產(chǎn)生環(huán)肽類化合物，該株菌經(jīng)過發(fā)酵，有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵產(chǎn)物，并用電噴霧質(zhì)譜ESI-MS (electrospray mass，ESI-MS)分析Srtli-F5能產(chǎn)生環(huán)肽化合物——桿菌肽，證實(shí)了該預(yù)測結(jié)果。該研究為定向篩選能夠產(chǎn)生環(huán)肽類化合物的菌種開拓了新思路。

內(nèi)生細(xì)菌；分離鑒定；系統(tǒng)發(fā)育分析；非核糖體多肽合成酶；質(zhì)譜；環(huán)肽

鹽生海蘆筍(SalicorniabigeloviiTorr)，是通常生長在含鹽率高的湖泊及土壤附近[1]的綠色蔬菜，味道鮮美，質(zhì)脆多汁。海蘆筍有莖無葉，不生蟲子，提示其組織內(nèi)部或表面可能含有能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的內(nèi)生菌或附生菌[2]。目前，有關(guān)海蘆筍的研究大多集中在對其化學(xué)成分的分離鑒定及其生物活性研究方面，有關(guān)海蘆筍內(nèi)生細(xì)菌的研究鮮有報道。

傳統(tǒng)的植物內(nèi)生細(xì)菌的篩選方法多是采用活性篩選、化學(xué)篩選或二者的組合[3]，這些方法過去在篩選可以產(chǎn)生活性次級代謝產(chǎn)物的菌株研究過程中非常有效，但在研究不斷深入的情況下，傳統(tǒng)方法的弊端也日益明顯：重復(fù)地發(fā)現(xiàn)已知的菌株和化合物，使得新菌株、新化合物的發(fā)現(xiàn)受阻，造成了時間和資源的極大浪費(fèi)[4-5]。

近年來，隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，許多微生物的生物合成機(jī)制逐步解密，新的植物內(nèi)生菌篩選方法應(yīng)運(yùn)而生。非核糖體肽類化合物合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)是生物合成次級代謝產(chǎn)物過程中的多功能關(guān)鍵酶，由催化氨基酸之間肽鍵形成的縮合(condensation,C)結(jié)構(gòu)域、負(fù)責(zé)底物識別和活化的腺苷?；?adenylation,A)結(jié)構(gòu)域、硫醇(thiolation,T)結(jié)構(gòu)域以及 C 末端終止延伸反應(yīng)的硫酯酶(thioesterase,TE)結(jié)構(gòu)域組成[6]。其中 A 結(jié)構(gòu)域有很強(qiáng)的保守性，可以通過PCR擴(kuò)增該區(qū)域基因，并通過系統(tǒng)發(fā)育分析預(yù)測化合物的結(jié)構(gòu)類型。因此，以NRPS功能基因?yàn)榘悬c(diǎn)，定向篩選含有環(huán)肽化合物的菌株，成為從“基因-合成酶系-環(huán)肽”的篩選新方法。

本實(shí)驗(yàn)用采自新疆鹽湖的野生海蘆筍，采用平板劃線法分離純化培養(yǎng)得到內(nèi)生細(xì)菌，提取其DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增16S rRNA目標(biāo)序列后，建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。通過觀察菌落形態(tài)，并對菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，明確其種屬地位。在此基礎(chǔ)上，以NRPS(nonribosomal peptide synthetase)功能基因?yàn)橹笜?biāo)，定向篩選含有NRPS基因的內(nèi)生細(xì)菌，篩選到的菌株經(jīng)發(fā)酵，ESI-MS(electrospray mass)分析發(fā)酵產(chǎn)物證實(shí)預(yù)測結(jié)果，以期為定向篩選能夠產(chǎn)生環(huán)肽化合物的菌株提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)器材

鹽生海蘆筍，取自新疆鹽湖。

Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司；TP600型梯度PCR儀，日本TaKaRa公司；DYCP-31DN電泳儀，北京市六一儀器廠；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司。

D3350-01 E.Z.N.A細(xì)菌DNA微量提取試劑盒，美國Omega公司；Cat#DP1502多功能DNA純化回收試劑盒(進(jìn)口離心柱型)，南京華普生物科技有限公司。

本實(shí)驗(yàn)主要采用如下培養(yǎng)基對細(xì)菌進(jìn)行初步的分離培養(yǎng)：

細(xì)菌用培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(1 L)：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、去離子水1 000 mL、瓊脂18 g，pH 7.2～7.4。

放線菌用培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基(1 L)?？扇苄缘矸?0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、去離子水 1 000 mL、瓊脂18 g。

真菌用培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖10.0 g、1/3 000孟加拉紅水溶液 100 mL、蛋白胨5.0 g、KH2PO41.0 g、瓊脂20 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、去離子水900 mL，氯霉素0.1 g。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

無菌條件下，先后將海蘆筍浸在75%酒精、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaClO溶液、75% 酒精中浸泡1 min，然后用無菌水清洗3次，用滅菌后的吸水紙除去表面的水分。用滅菌后的剪刀將其剪成7～9 mm小段，分別放在上述3種培養(yǎng)基上，每板3～5段，其中牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d至莖末端長出菌落，孟加拉紅培養(yǎng)基于30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d直到莖末端長出菌落。用劃線分離的方法純化培養(yǎng)得到單菌落。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察

將長有細(xì)菌菌落的平板，置于37 ℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落的形態(tài)特征。

1.2.3 細(xì)菌DNA的提取

按照生產(chǎn)廠家提供的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 16SrRNA基因片段的PCR擴(kuò)增

16S區(qū)域的擴(kuò)增選擇細(xì)菌16S rRNA的通用擴(kuò)增引物16S(F)(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/16S(R)(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 40 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min[7]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系，包括ddH2O 9.5 μL、2×TaqMaster Mix 12.5 μL、10 μmol/L Primer 16S(F) 1 μL、10 μmol/L Primer 16S(R) 1 μL、模板DNA 1 μL。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 NRPS基因片段的PCR擴(kuò)增

NRPS基因片段的擴(kuò)增選擇的引物為NP1(5’-CCTAATTCAATACGAAAACCACGAADYTTNAYYTG-3’)/NP2(5’-TGTATGTTATTTATACTTCTGGTTCTACTGGTMRNCCANARGG-3’)，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系，包括ddH2O 9.5 μL、2×TaqMaster Mix 12.5 μL、10 μmol/L Primer NP1 1 μL、10 μmol/L Primer NP2 1 μL、模板DNA 1 μL。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 PCR產(chǎn)物的回收和克隆

按照生產(chǎn)廠家提供的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7 序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將含有目的DNA序列的菌液交由上海美吉生物有限公司進(jìn)行測序。獲得序列后，通過Ezbiocloud(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)網(wǎng)站與所有已發(fā)表的典型菌株進(jìn)行序列相似性分析，下載與供試菌株序列同源性相近的菌株序列，利用MEGA 6.0軟件NJ(neighbor joining)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)：1 000。

1.2.8 質(zhì)譜測定方法

將篩選得到的含有NRPS基因的菌株發(fā)酵7 d，丙酮提取發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，過濾，進(jìn)樣分析。質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度500 ℃，氣簾氣25.0 psi，噴霧電壓5 500.0 V，離子源氣1∶55.0 psi，離子源氣2∶50.0 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1菌落形態(tài)特征

挑取平板上長出的菌落，在對應(yīng)的培養(yǎng)基平板上劃線分離純化，得到單個菌落，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果如圖1所示。

高氏一號培養(yǎng)基平板劃線純化后得到3個純的菌株Srtli-F1、Srtli-F2和Srtli-F4。Srtli-F1菌落較小而且扁平，呈淺黃色，在光照下顯現(xiàn)出熒光，邊緣規(guī)則，半透明，菌落濕潤易挑起。菌株Srtli-F2的菌落呈黃色，大而隆起，黏稠，不透明，邊緣不規(guī)則。菌株Srtli-F4為白色大菌落，微凸，邊緣規(guī)則，半透明，濕潤易被挑起。

經(jīng)過孟加拉紅培養(yǎng)基平板劃線純化后僅得到1個純的菌株Srtli-F3。Srtli-F3菌落大且呈圓紅色，微微凸起，黏稠，不透明。

經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板劃線純化后得到2個純的菌株Srtli-F5和Srtli-F6。Srtli-F5菌落微小，呈白色圓點(diǎn)狀，邊緣光滑，微微凸起、干燥、不透明，菌株Srtli-F6的菌落呈白色圓形，小而扁平，表面半透明，邊緣光滑。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌Srtli-F1～Srtli-F6的菌落形態(tài)特征Fig.1 The morphological characters of Srtli-F1-Srtli-F6

2.2系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

經(jīng)過PCR擴(kuò)增、切膠回收測序，獲得了菌株Srtli-F1～Srtli-F6的16S rDNA，序列長度均在1 500 bp左右。將菌株Srtli-F1的16S rDNA序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索，選取并下載同源性較高的模式菌種16S rDNA序列，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。從圖2可見，與外組Aztobacterarmeniacus(AB175655)相比，同一屬的菌株聚為一個大類，不同種的菌株聚在不同的分枝。菌株Srtli-F1與Pseudomonaschlororaphissubsp.aurantiacaT(DQ682655)聚為一枝，自展值為94，親緣關(guān)系極其相近，可鑒定為該種。以相同的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對其他菌種進(jìn)行鑒定。發(fā)現(xiàn)菌株Srtli-F2與ArthrobacterhistidinolovoransT(X83406)聚為一支，自展值為98(圖3)，菌株Srtli-F3與BacillusqingshengiiT(JX293295)聚為一支，自展值99(圖4)，菌株Srtli-F4與PaenibacilluslupiniT(KF769449)聚為一支，自展值100(圖5)，菌株Srtli-F5與BacilluspseudomycoidesT(ACMX01000133)聚為一支，自展值87(圖6)，菌株Srtli-F6與EscherichiaalbertiiT(ABKX01000030)聚為一支，自展值95(圖7)。綜上所述，將菌株Srtli-F1～Srtli-F6分別鑒定為綠針假單胞菌橙黃亞種P.chlororaphissubsp.aurantiaca、組氨酸節(jié)桿菌A.histidinolovorans、慶盛芽孢桿菌B.qingshengii、類芽孢桿菌羽扇豆根瘤菌P.lupini、假蕈狀芽孢桿菌B.pseudomycoides、高山麝病原性阿爾伯蒂埃希氏桿菌E.albertii。

圖2 菌株Srtli-F1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(基于16S rDNA 基因序列)Fig.2 Phylogenetic tree of strain Srtli-F1 based on 16S rDNA gene sequence

圖3 菌株Srtli-F2的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(基于16S rDNA 基因序列)Fig.3 Phylogenetic tree of strain Srtli-F2 based on 16S rDNA gene sequence

圖4 菌株Srtli-F3的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(基于16S rDNA 基因序列)Fig.4 Phylogenetic tree of strain Srtli-F3 based on 16S rDNA gene sequence

圖5 菌株Srtli-F4的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(基于16S rDNA 基因序列)Fig.5 Phylogenetic tree of strain Srtli-F4 based on 16S rDNA gene sequence

圖6 菌株Srtli-F5的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(基于16S rDNA 基因序列)Fig.6 Phylogenetic tree of strain Srtli-F5 based on 16S rDNA gene sequence

圖7 菌株Srtli-F6的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(基于16S rDNA 基因序列)Fig.7 Phylogenetic tree of strain Srtli-F6 based on 16S rDNA gene sequence

2.3NRPS功能基因篩選與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

在確定6株內(nèi)生細(xì)菌分類地位的基礎(chǔ)上，分別PCR擴(kuò)增菌株Srtli-F1～Srtli-F6的NRPS功能基因，并對NRPS基因進(jìn)行克隆測序。結(jié)果表明菌株Srtli-F3和Srtli-F5含有目的基因片段，片段大小均為780bp，利用NCBI Orf finder(Open Reading Frame Finder)將核酸序列轉(zhuǎn)化為蛋白序列，下載同源性較高的蛋白序列，用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分別如圖8和圖9所示。由圖可見，種屬相同的不同菌株聚為一支，提示可能產(chǎn)生相同類型的化合物，如Brevibacillusparabrevis(Q70LM6)和Brevibacillusparabrevis(Q70LM7)都能產(chǎn)生桿菌肽(Bacitracin)，而不同的菌種也可聚為一支，提示也能產(chǎn)生相同的化合物，如Aneurinibacillusmigulanus(P0C063)和Brevibacillusbrevis(P0C064) 都能產(chǎn)生化合物Gramicicin。菌株Srtli-F3和Srtli-F5在2個進(jìn)化樹中均與B.licheniformis(O68008)聚為一枝，自展值分別為40和44，表明菌株Srtli-F5和Srtli-F3可能產(chǎn)生環(huán)肽類抗生素——桿菌肽(Bacitracin)。

圖8 菌株Srtli-F3的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(基于NRPS基因序列)Fig.8 Phylogenetic tree of strain Srtli-F3 based on NRPS gene sequence

圖9 菌株Srtli-F5的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(基于NRPS基因序列)Fig.9 Phylogenetic tree of strain Srtli-F5 based on NRPS gene sequence

2.4菌株發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

將分離得到的菌株發(fā)酵7 d，丙酮提取發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后，過濾，進(jìn)行ESI-MS分析。結(jié)果分別如圖10所示。由圖10(A)可知，菌株Srtli-F5的粗提物在陽離子ESI-MS模式下在m/z1 102.7、m/z1 103.7、m/z1 104.7處產(chǎn)生碎片離子峰，由圖10(B)可知，菌株Srtli-F5的粗提物在陰離子ESI-MS 模式下在m/z1 034.6、m/z1 035.6、m/z1 036.6處產(chǎn)生碎片離子峰，為桿菌肽化合物的特征分子離子質(zhì)量，因此推測Srtli-F5可產(chǎn)生桿菌肽類物質(zhì)。然而，菌株Srtli-F3的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)ESI-MS分析并沒有出現(xiàn)環(huán)肽化合物特征離子峰，這可能是該菌株中含有的NRPS基因是沉默的，在實(shí)驗(yàn)室條件下無法表達(dá)環(huán)肽[8]。

圖10 菌株Srtli-F5發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectrum diagram about the fermentation products of Srtli-F5

3 討論

研究表明，微生物能否產(chǎn)生有價值化合物是由其功能基因決定的[9]。因此，通過靶向擴(kuò)增生物合成次級代謝產(chǎn)物過程中的多功能關(guān)鍵酶——NRPS，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)環(huán)肽菌株的定向篩選，不僅減少了資源的浪費(fèi)，也大大提高了篩選效率。本研究項目從海蘆筍中分離出6株內(nèi)生細(xì)菌Srtli-F1～Srtli-F6，利用PCR擴(kuò)增這6個菌的16S rDNA目標(biāo)序列，接著通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析與形態(tài)學(xué)觀察，將其分別鑒定為綠針假單胞菌橙黃亞種P.chlororaphissubsp.aurantiaca、組氨酸節(jié)桿菌A.histidinolovorans、慶盛芽孢桿菌B.qingshengii、類芽孢桿菌羽扇豆根瘤菌P.lupini、假蕈狀芽孢桿菌B.pseudomycoides、高山麝病原性阿爾伯蒂埃希氏桿菌E.albertii?；贜RPS型功能基因?qū)@6個菌株進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其中編號為Srtli-F3和Srtli-F5的菌株含有NRPS基因，提示可能產(chǎn)生環(huán)肽類化合物，對這2個菌種分別進(jìn)行發(fā)酵，利用ESI-MS分析發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)Srtli-F5能夠產(chǎn)生桿菌肽，而Srtli-F3發(fā)酵產(chǎn)物沒有出現(xiàn)環(huán)肽類化合物分子離子峰，提示在實(shí)驗(yàn)室條件下，產(chǎn)生環(huán)肽類化合物的NRPS基因可能是沉默的而無法表達(dá)。

桿菌肽，是一種環(huán)肽類化合物。因?yàn)檫@種多肽來源于地衣芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物，所以被稱為“桿菌肽”[10]。桿菌肽是一種廣譜抗菌素[11]，能夠抑制動物腸道中的許多有害菌，起到防治動物腸道疾病的效果，保證了飼料的充分利用，有利于動物生長。與傳統(tǒng)抗生素相比，這種抗生素安全性高、殘留少，不產(chǎn)生抗藥性、毒副作用弱[12]，是飼料添加劑中傳統(tǒng)抗生素的有效替代品，已被廣泛應(yīng)用在國內(nèi)外動物養(yǎng)殖和飼料生產(chǎn)中[13-14]，也被作為生物學(xué)的研究工具應(yīng)用于生物表面活性劑、飼料添加劑、食品防腐劑研究中[15]。因此，發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生桿菌肽的微生物，對于拓寬獲得桿菌肽的途徑，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。本研究首次從海蘆筍中分離鑒定到假蕈狀芽孢桿菌，今后將對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行深入研究，研究其除產(chǎn)生環(huán)肽桿菌肽外，是否能夠產(chǎn)生其他環(huán)肽，驗(yàn)證同一微生物產(chǎn)生多種環(huán)肽的能力。

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ScreeningandidentificationofendophyticbacteriafromSalicorniabigelovii.TorrbasedonaNRPSfunctionalgeneassay

LI Dai-jing,YIN Yue,LIU Meng-jie,WEI Ting,GUO Jia,XIN Zhi-hong1*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In the current research, endophytic bacteria were isolated fromSalicorniabigelovii.Torr and characterized by morphological observation and molecular methods, and the NRPS gene was screened to obtain the strains that could produce cyclic peptide compounds. The results showed that six endophytic bacteria were isolated and identified asPseudomonaschlororaphissubsp.Aurantiaca,Arthrobacterhistidinolovorans,Bacillusqingshengii,Paenibacilluslupini,Bacilluspseudomycoides,Escherichiaalbertii， respectively. Among them, the strain Srtli-F5 contained NRPS genes and was predicted to have capability of producing cyclopeptide compounds by phylogenetic tree analysis. It was further confirmed by the detection of fermentation production using ESI-MS (electrospray mass, ESI-MS) that the strain really produced bacitracin. The study provides a new method for directional screening strains with the potential to produce cyclic peptide compounds.

endophytic bacillus; isolation and identification; phylogenetic analysis; nonribosomal peptide synthetase; mass spectrum;cyclopeptide

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014643

本科生(辛志宏教授為通訊作者，E-mail：xzhfood@njau.edu.cn)。

2017年農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目(GJFP201701102)；2016年南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃(SRT)項目(1618C01)

2017-04-27，改回日期：2017-05-17