當(dāng)歸芍藥散對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的干預(yù)作用及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和PPAR-γ表達(dá)的影響

任攀 康群甫 周明學(xué) 張蕾 李思耐 劉衛(wèi)紅

當(dāng)歸芍藥散對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的干預(yù)作用及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和PPAR-γ表達(dá)的影響

任攀 康群甫 周明學(xué) 張蕾 李思耐 劉衛(wèi)紅

目的研究當(dāng)歸芍藥散對(duì)載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, As)斑塊的干預(yù)作用及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)和PPAR-γ表達(dá)的影響。方法將30只8周齡雄性ApoE-/-小鼠西方類型膳食喂養(yǎng)9周，隨機(jī)分為模型組、立普妥組(陽性對(duì)照組)和當(dāng)歸芍藥散組(n=10)，藥物干預(yù)9周后，檢測血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血清DNA甲基化水平及DNMTs水平。行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin staining, HE)，采用IPP圖像分析軟件測量小鼠主動(dòng)脈As斑塊面積。免疫組化法檢測各組小鼠主動(dòng)脈As斑塊內(nèi)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)和過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPAR γ)的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，當(dāng)歸芍藥散組和立普妥組小鼠血清TC、TG水平明顯降低(P<0.05)，當(dāng)歸芍藥散組小鼠血清HDL-C水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，當(dāng)歸芍藥散組小鼠主動(dòng)脈As斑塊面積顯著降低(P<0.01)，當(dāng)歸芍藥散組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)DNMT1表達(dá)顯著降低(P<0.05)，PPAR γ表達(dá)顯著升高(P<0.05)。結(jié)論當(dāng)歸芍藥散可改善As小鼠的血脂水平，減少As斑塊面積，具有明確的抗As作用，其機(jī)制可能與抑制As小鼠血清甲基化水平和DNMTs 水平，促進(jìn)As小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPARγ表達(dá)和抑制斑塊內(nèi)DNMT1表達(dá)有關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化； 當(dāng)歸芍藥散； DNA甲基化； DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶； DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ

炎癥能夠?qū)е聞?dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生，是AS發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)[1]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種重要的調(diào)控方式。新近研究表明，DNA甲基化的異常能夠促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[2]。DNA甲基化受炎癥信號(hào)通路的影響，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)能夠促進(jìn)AS有關(guān)的巨噬細(xì)胞的炎性激活，并通過抑制PPARγ介導(dǎo)的抗炎作用來促進(jìn)小鼠AS的發(fā)展[3-4]。當(dāng)歸芍藥散出自漢代張仲景的《金匱要略》，對(duì)AS和高脂血癥等疾病有較好的治療作用[5-8]。既往研究表明，當(dāng)歸芍藥散具有明確的抗炎、調(diào)脂作用[8-9]，而DNA甲基化與炎癥和AS均關(guān)系密切，從DNA甲基化調(diào)控角度研究當(dāng)歸芍藥散抗AS的機(jī)制，具有較好的創(chuàng)新性和研究價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠為AS模型，研究當(dāng)歸芍藥散對(duì)AS小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)作用及對(duì)DNA甲基化水平、DNMT1和PPARγ表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

血清總膽固醇(total cholesterol，TC)檢測試劑盒(批號(hào)： 010503040-100301)、血清甘油三酯(triglyceride, TG)檢測試劑盒(批號(hào)： 010503041-100301)、血清低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)檢測試劑盒(批號(hào)：010503291-091201)、血清高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)檢測試劑盒(批號(hào)： 010503290-091201)，購自英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司。小鼠血清DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒(批號(hào)： CKE433652M)，購自美國R&D公司。血生化指標(biāo)檢測采用日本奧林巴斯株式會(huì)社全自動(dòng)生化儀(AU400)。美國Image-ProPlus Version 6.0(IPP)圖像分析軟件。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

阿托伐他汀鈣，商品名立普妥，上海輝瑞制藥公司，批號(hào)： H20051408。當(dāng)歸芍藥散(當(dāng)歸30 g、赤藥160 g、茯苓40 g、白術(shù)40 g、澤瀉80 g、川芎30 g)，中藥飲片由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。

1.3動(dòng)物及分組

8周齡ApoE-/-小鼠(品系C57BL/6J)，體重18～20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，30只，高脂飼養(yǎng)9周后，所有小鼠隨機(jī)分為模型組、立普妥組(陽性對(duì)照組)和當(dāng)歸芍藥散組，每組10只。當(dāng)歸芍藥散選取臨床等效劑量，并按成人與小鼠的給藥劑量換算系數(shù)折算成小鼠用量(2.2 g/kg)灌胃給藥[8]，每日1次，灌胃給藥9周。模型組給予等量的生理鹽水。高脂飼料配方為脂肪21%(wt/wt)、膽固醇0.15%的西方類型膳食飼料[10]。各組動(dòng)物在喂養(yǎng)18周后，頸椎脫臼法處死，眶下靜脈叢取血，血清-80℃保存，無菌條件下取心臟，心臟用4%多聚甲醛固定。

1.4血脂檢測

采用氧化酶法和直接法檢測當(dāng)歸芍藥散對(duì)高脂喂養(yǎng)18周ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響。

1.5血清DNA甲基化水平及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶檢測

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測血清DNA 甲基化水平。在100 μL(含DNA約25 μg)的DNA溶液中加入70% 的高氯酸50 μL，在95℃下水解50分鐘，然后用濃度為1 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH 3～5，12000 r/min離心5分鐘，取上清濾過，注入HPLC中進(jìn)行檢測。采用ELISA法檢測血清DNMTs水平。

1.6組織病理

小鼠心底部橫斷面連續(xù)切片，每隔50 μm 連續(xù)取6張切片，切片厚5 μm。采用HE病理染色和IPP圖像軟件分析測量小鼠主動(dòng)脈As斑塊面積：測量管腔面積(LA，mm2)、內(nèi)彈力膜圍繞面積(IELa，mm2)，并計(jì)算斑塊面積、校正后斑塊面積。斑塊面積(PA，mm2)= IELa-LA。校正后斑塊面積= PA/IELa。

1.7免疫組化檢測

免疫組化染色選取小鼠主動(dòng)脈同一水平位置的斑塊，采用兩步法測定斑塊內(nèi)DNMT1和PPARγ的表達(dá)。(DNMT1抗體稀釋度為1∶100，PPARγ抗體稀釋為1∶50)，每組均以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，在200倍鏡下每張切片選取5個(gè)不同的視野，對(duì)陽性區(qū)域累積面積進(jìn)行定量測定，最后求取斑塊內(nèi)陽性區(qū)域面積占斑塊面積的百分比。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1當(dāng)歸芍藥散對(duì)高脂喂養(yǎng)18周ApoE-/-小鼠血脂的影響

小鼠灌胃9周后，與模型組相比，當(dāng)歸芍藥散組和立普妥組小鼠血清TC、TG水平明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，當(dāng)歸芍藥散組小鼠血清HDL-C水平明顯升高(P<0.05)，見表1。

2.2當(dāng)歸芍藥散對(duì)高脂喂養(yǎng)18周ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的影響

藥物干預(yù)9周后， 經(jīng)HE染色和IPP圖像軟件分析結(jié)果顯示：與模型組相比，當(dāng)歸芍藥散組小鼠校正后主動(dòng)脈As斑塊面積顯著降低(P<0.05)，與陽性對(duì)照立普妥組之間無顯著差異(P>0.05)。見圖1、表2。

表1 當(dāng)歸芍藥散對(duì)高脂喂養(yǎng)18周ApoE-/-小鼠血脂的影響

注： 與模型組相比，aP<0.05。

注：A模型組；B立普妥組；C當(dāng)歸芍藥散組

圖1 當(dāng)歸芍藥散對(duì)As小鼠主動(dòng)脈斑塊的影響HE染色圖(×100)

注： 與模型組相比，aP<0.05。

2.3當(dāng)歸芍藥散對(duì)高脂喂養(yǎng)18周ApoE-/-小鼠血清DNA甲基化水平及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響

藥物干預(yù)9周后，結(jié)果顯示：藥物干預(yù)9周后，與模型組相比，當(dāng)歸芍藥散組小鼠血清DNA甲基化水平及DNMTs水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 當(dāng)歸芍藥散對(duì)As小鼠血清DNA甲基化水平及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響

注： 與模型組相比，aP<0.05。

2.4當(dāng)歸芍藥散對(duì)高脂喂養(yǎng)18周ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPARγ和DNMT1表達(dá)的影響

藥物干預(yù)9周后，免疫組化結(jié)果顯示：與模型組相比，當(dāng)歸芍藥散組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPARγ表達(dá)面積百分比明顯增多(P<0.05)，DNMT1表達(dá)面積的百分比顯著降低(P<0.05)。見圖2、表4。

3 討論

當(dāng)歸芍藥散出自漢代張仲景的《金匱要略》，方中當(dāng)歸、川芎、芍藥活血化瘀，茯苓、白術(shù)、澤瀉化痰利水、健脾益氣。諸藥合用，共奏活血化瘀、化痰祛濁和補(bǔ)虛滲濕之功。AS的中醫(yī)病機(jī)多屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛即氣虛，標(biāo)實(shí)即“痰證”“瘀證”等病癥。由痰致瘀，痰瘀互結(jié)，是AS的主要病機(jī)。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)AS的主要病機(jī)，采用了祛濕化痰活血的當(dāng)歸芍藥散來治療AS。有研究表明，當(dāng)歸芍藥散通過提高PPARγ的表達(dá)，調(diào)節(jié)血脂，抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)早期AS具有較好的治療作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦提示當(dāng)歸芍藥散可改善AS小鼠的血脂水平，其中對(duì)TG的作用尤為顯著，同時(shí)還可以降低小鼠主動(dòng)脈斑塊面積，具有較好的調(diào)節(jié)血脂和抗AS作用，與董培良等人的研究相一致[5,8-9]。

注：A. 模型組 B.立普妥組 C.當(dāng)歸芍藥散組，三組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPARγ 表達(dá)。D.模型組 E.立普妥組 F.當(dāng)歸芍藥散組，三組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)DNMT1 表達(dá)。圖片中箭頭所指棕色顆粒為陽性表達(dá)。

圖2 當(dāng)歸芍藥散對(duì)As小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPARγ和DNMT1表達(dá)的影響(×200)

注：與模型組相比，aP<0.05。

DNA甲基化可通過調(diào)控與AS有關(guān)的炎癥免疫細(xì)胞和炎癥因子來影響AS的發(fā)生與發(fā)展[11-13]。基因組甲基化水平與冠心病及冠心病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，例如，氧化低密度脂蛋白可通過上調(diào)DNMTs活性使DNA甲基化高表達(dá)，從而增加AS的風(fēng)險(xiǎn)[4,14]。DNMTs在DNA甲基化的過程中是必不可少的，主要包括DNMT1、 DNMT2、 DNMT3三種。其中，DNMT1在細(xì)胞分裂過程中起最主要的、穩(wěn)定的維持甲基化狀態(tài)作用[15-16]。在DNMT1特異性表達(dá)的小鼠巨噬細(xì)胞中，DNMT1能夠增加促炎因子的產(chǎn)生，促進(jìn)AS的進(jìn)展[4]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠血清DNA甲基化和DNMTs處于較高的水平，而當(dāng)歸芍藥散組小鼠血清DNA甲基化水平和DNMTs水平顯著降低，提示當(dāng)歸芍藥散抗AS的機(jī)制可能與降低血清DNMTs水平和DNA甲基化水平有關(guān)。

PPARγ可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和生存?；罨腜PARγ可通過多種信號(hào)通路抑制AS斑塊中促炎因子的表達(dá)，減輕免疫和炎癥反應(yīng)，減少泡沫細(xì)胞形成，從而穩(wěn)定斑塊，延緩AS的發(fā)展[17]。課題組前期的研究[8]也表明，當(dāng)歸芍藥散可能通過調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和PPARγ受體，抑制小鼠體內(nèi)代謝性炎性反應(yīng)，從而對(duì)早期AS起到干預(yù)作用。

新近研究提示PPAR信號(hào)通路的表達(dá)受到DNMT1的顯著影響。趙靜[18]研究表明，PPARγ基因DNA甲基化水平與DNMTs活性呈正相關(guān)，DNA甲基化可能通過調(diào)控相關(guān)炎癥基因的表達(dá)，提高炎癥因子的水平，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致AS的發(fā)生與發(fā)展[19]。Yu等[4]的研究指出，DNMT1能夠調(diào)控PPARγ的顯性表達(dá)，促進(jìn)AS有關(guān)的巨噬細(xì)胞的炎性激活，并通過抑制PPARγ介導(dǎo)的抗炎作用來促進(jìn)小鼠AS的發(fā)展。DNMT1的下游因子PPARγ能有效調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制小鼠AS的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組小鼠相比，當(dāng)歸芍藥散組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)DNMT1的表達(dá)顯著降低，而斑塊內(nèi)PPARγ的表達(dá)顯著上升，提示當(dāng)歸芍藥散可能通過調(diào)節(jié)DNMT1-PPARγ信號(hào)通路來發(fā)揮抗AS的作用，而DNMT1和PPARγ可能是當(dāng)歸芍藥散抗AS甲基化機(jī)制的兩個(gè)重要靶點(diǎn)。

綜上所述，當(dāng)歸芍藥散在降低AS小鼠血脂，減少AS斑塊面積方面療效顯著，具有明確的抗AS作用，其甲基化機(jī)制可能與降低AS小鼠血清DNMTs和DNA甲基化水平以及調(diào)節(jié)AS小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPARγ和DNMT1表達(dá)有關(guān)。

[1] 劉俊田.As發(fā)病的炎癥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2015，36(2)：141-152.

[2] 譚劍凱，譚小進(jìn)，王佐.DNA甲基化與As[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2014，30(2)：132-136.

[3] Khyzha N，Alizada A，Wilson MD，et al. Epigenetics of Atherosclerosis：Emerging Mechanisms and Methods[J]. Trends Mol Med，2017，23(4)：332-347.

[4] Yu J，Qiu Y，Yang J，et al. DNMT1-PPARγ pathway in macrophages regulates chronic inflammation and atherosclerosis development in mice[J]. Sci Rep，2016，(17)：30053.

[5] 宋曉宇，張?zhí)煺妫燹?，?當(dāng)歸芍藥散治療血脂異常痰瘀互結(jié)證的臨床觀察[J].河北中醫(yī)報(bào)，2009，24(1)：12-13.

[6] 陳靜，葉平，閻艷麗，等.當(dāng)歸芍藥散防治高脂血癥的實(shí)驗(yàn)研究[J].天津中醫(yī)藥，2005，22(6)：493-494.

[7] 閻艷麗，吉梅，宋曉宇，等.當(dāng)歸芍藥散對(duì)血脂異常大鼠抗氧化能力及動(dòng)脈壁血管細(xì)胞黏附分子-1基因表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，13(2)：25-28.

[8] 賈麗超，周明學(xué)，張蕾，等. 當(dāng)歸芍藥散對(duì)代謝性炎性反應(yīng)小鼠血脂和血清炎性反應(yīng)因子IL-6、MCP-1及NF-κB、PPARγ、mRNA表達(dá)的影響[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(6)：813-817.

[9] 董培良，殷鑫，張?zhí)煊?，?當(dāng)歸芍藥散對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥模型大鼠的影響(1)[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，41(6)：81-83.

[10] XR Yang，E Wat，YP Wang，et al. Effect of Dietary Cocoa Tea (Camellia ptilophylla) Supplementation on High-fat Diet-Induced Obesity，Hepatic Steatosis and Hyperlipidemia in Mice[J].Evidence-BASed Complementary and Alternative Medicine，2013,(3)，783-860.

[11] Hiltunen MO，Turunen MP，H?kkinen TP，et al. DNA hypomethylation and methyltransferAse expression in atherosclerotic lesions[J]. VAsc Med，2002，7(1)：5-11.

[12] Revankar C M，Cimino D F，Sklar L A，et al. A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling[J].Science，2005，307(5715)：1625-1630.

[13] Post W S，Goldschmidt-Clermont P J，Wilhide C C，et al. Methylation of the estrogen receptor gene is Associated with aging and atherosclerosis in the cardiovAscular system[J].CardiovAsc Res，1999，43(4)：985-991.

[14] Kim M，Long TI，Arakawa K，et al. DNA methylationAsa biomarker for cardiovAscular diseAse risk[J].PLoS One，2010，5(3)：e9692.

[15] Valinluek V，Sowers LC. Endogenous cytosine damage products alter the site selectivity of human DNA maintenance methyltransferAse DNMT1[J].Caneer Res，2007，67(3)：946-950.

[16] 陳曉娟，閆少春，邵國. 人DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的分類及其功能[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30(4)：136-138.

[17] 吳圣賢，聶波，潘美香，等. 解毒活血法對(duì)ApoE-/-小鼠As斑塊PPAR-γ和炎性因子的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41(5)：1046-1048.

[18] 趙靜. 青錢柳多糖對(duì)大鼠脂代謝相關(guān)基因DNA甲基化及表達(dá)影響的研究[D].南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[19] 范銳心.甜菜堿對(duì)apoE基因缺陷小鼠AS發(fā)生及TNF-α甲基化的影響[D].廣州：中山大學(xué)，2007.

EffectsofDangguiShaoyaopowderontheDNMT1andtheexpressionofPPARγinatheroscleroticmice

RENPan，KANGQunfu，ZHOUMingxue，etal.BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100010，China

Correspondinganthor：LIUWeihong，E-mail：wh.l-007@163.com

ObjectiveTo study the effects ofDangguiShaoyaopowder on the expression of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) and PPARγ in apolipoprotein E knockout (ApoE-/-) mice with atherosclerosis.MethodsThirty 8 week-old male ApoE-/-mice were fed with high fat diet for 9 weeks, and the mice were randomly divided into the control group, the Lipitor (positive control group), theDangguiShaoyaopowder group (n=10). The levels of total cholesterol (TC), triglycerides (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in serum were detected. The level of DNA Methylation and the DNMTs in serum were detected. HE staining was used to measure the area of atherosclerosis plaque of mice. Immuno-histochemical staining and image analysis were used to measure the expressions of DNMT1 and PPARγ in the atherosclerosis plaques of mice.ResultsCompared with the model group, the TC and TG levels ofDangguiShaoyaopowder group and Lipitor group were significantly decreased (P<0.05), the HDL-C levels ofDangguiShaoyaopowder group were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the aorta As plaque area was significantly decreased inDangguiShaoyaopowder group (P<0.05). The expressions of DNMT1 of theDangguiShaoyaopowder group were significantly reduced(P<0.05) while the expressions of PPARγ were significantly increased (P<0.05).ConclusionDangguiShaoyaopowder can improve the blood lipid level and the plaque area of As mice. The mechanism may be related to the reduction of DNA methylation level and the DNMTs level in serum, and also related to the inhibition of DNMT1 expression, and the promotion of PPARγ expression in mice with As.

Atherosclerosis；DangguiShaoyaopowder； DNA methylation； DNA methyltransferase； DNA methyltransferase 1； Peroxisome proliferator activated receptor gamma

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.009

2017-06-15)

(本文編輯： 董歷華)

國家自然科學(xué)基金(81573735)；北京市自然科學(xué)基金(7142037)

100010 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所[任攀(碩士研究生)、康群甫(碩士研究生)、周明學(xué)、張蕾、李思耐、劉衛(wèi)紅]

任攀(1990- )，2015級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心血管病研究。E-mail：renpanzy@163.com

劉衛(wèi)紅(1968- )，女，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥防治心血管病的療效評(píng)價(jià)及作用機(jī)制研究。 E-mail：wh.l-007@163.com