決明子乙酸乙酯提取物對(duì)肝纖維化小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響

黃茸茸，盧萬(wàn)鵬，馬鳳余

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

決明子乙酸乙酯提取物對(duì)肝纖維化小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響

黃茸茸，盧萬(wàn)鵬，馬鳳余

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

目的：研究決明子乙酸乙酯提取物對(duì)肝纖維化小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響.方法：采用腹腔注射0.1%的CCl4花生油溶液建立小鼠肝纖維化模型，采用試劑盒測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）的含量；采用分光光度法測(cè)定肝組織中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶(SOD)的活性.結(jié)果：結(jié)果表明，決明子乙酸乙酯提取物低劑量（0.10g/kg）組、中劑量（0.15g/kg）組能減少小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）的含量，并可減少肝臟中丙二醛（MDA）含量，抑制肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)的活性.結(jié)論：決明子乙酸乙酯提取物對(duì)肝纖維化小鼠有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān).

決明子乙酸乙酯提取物；脂質(zhì)過(guò)氧化；丙二醛；超氧化物歧化酶；肝纖維化

隨著生活節(jié)奏的加快，長(zhǎng)期不健康的飲食與作息習(xí)慣、工作壓力、食品安全等因素容易造成對(duì)肝臟的損傷，而長(zhǎng)期的慢性肝病則可能容易導(dǎo)致肝纖維化的產(chǎn)生.肝纖維化是指由各種致病因子所導(dǎo)致的肝臟內(nèi)部結(jié)締組織異常增生，是各種慢性肝病最重要的病理特征，因其可能引發(fā)肝硬化及誘發(fā)原發(fā)性肝癌，肝纖維化的防治目前已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn).目前治療肝臟病變的藥物多以化學(xué)藥物為主，由于毒性和副作用較大等原因，對(duì)中草藥防治肝纖維化的研究開(kāi)發(fā)顯得十分迫切.

決明子為豆科植物決明或小決明干燥成熟的種子，性甘、苦、咸，微寒，歸肝、腎、大腸經(jīng)，具有清熱明目，潤(rùn)腸通便，保肝護(hù)肝等功效，是衛(wèi)生部首批公布的藥食兩用中藥品種之一[1].現(xiàn)代研究主要在決明子有效成分的提取工藝、成分鑒別以及決明子醇提物的肝保護(hù)等方面有相關(guān)探討，但對(duì)決明子的乙酸乙酯提取物對(duì)肝臟的保護(hù)作用卻未見(jiàn)有報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)采用CCl4腹腔注射所致小鼠肝纖維化病理模型，研究決明子乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠肝纖維化的干預(yù)作用，并探討其可能的作用機(jī)理，將為決明子的開(kāi)發(fā)利用與臨床治療提供實(shí)驗(yàn)參考.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

決明子，藥用，亳州寶豐生物科技有限公司提供；乙醇，分析純，天津市百世化工有限公司；乙酸乙酯，分析純，天津市百世化工有限公司；四氯化碳（CCl4），分析純，天津市百世化工有限公司；花生油，山東魯花壓榨花生油；三氯乙酸，天津天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，中國(guó)天津市巴斯夫化工有限公司；磷酸二氫鈉，分析純，無(wú)錫市展望化工試劑有限公司；無(wú)水磷酸氫二鈉，分析純，無(wú)錫市展望化工試劑有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，體重20～22g，由省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(皖)：2016-002.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；FAIO04型電子天平，上海天平儀器廠；HH恒溫水浴鍋，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；1510酶標(biāo)儀，賽墨飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；118B型搖擺式中藥粉粹機(jī)，瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；LG10-2.4A型超速離心機(jī)，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；TGL-16H高速低溫離心機(jī)，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；GKC型可控硅恒溫水浴鍋，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 決明子乙酸乙酯提取物的制備[2]

將決明子種子粉碎后，取240克，以固體：液體=1:6用95%的乙醇浸泡1小時(shí)，60℃加熱回流2小時(shí).然后停止加熱，過(guò)濾，并保存濾液.濾渣再加95%乙醇以固體：液體=1:6 60℃加熱回流1.5小時(shí)，然后合并濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮干燥.提取液真空干燥并溶于水中（加熱溶解）用乙酸乙酯溶劑萃取，分別用乙酸乙酯萃取3-4次合并濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得乙酸乙酯提取物部分.決明子乙酸乙酯提取物用PH梯度萃取法分離總蒽醌得到三種蒽醌衍生物，之后用Borntrhger顯色反應(yīng)和紫外分光光度法鑒定得出三種蒽醌衍生物分別為大黃素，大黃酸，蘆薈大黃素.

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

實(shí)驗(yàn)小鼠，共60只，雌雄各半；隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為空白對(duì)照組、肝纖維化模型組、決明子乙酸乙酯提取物低劑量組（0.10g/kg）、決明子乙酸乙酯提取物中劑量組（0.15g/kg）、決明子乙酸乙酯提取物高劑量組（0.20g/kg）.決明子乙酸乙酯提取物低、中、高三劑量組每天灌胃給藥一次，共14天.空白組與肝纖維化模型組每天用等容量生理鹽水灌胃.

2.3 小鼠肝纖維化模型制備[3-5]

給藥結(jié)束后，除了空白對(duì)照組，肝纖維化模型組、決明子乙酸乙酯提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠分別腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液0.2mL/10g，每周兩次，共6周.空白對(duì)照組不作處理.6周后，隨機(jī)取小鼠解剖HE染色觀察其肝纖維化以判斷造模情況.

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

眼球取血，血液樣本放入高速冷凍離心機(jī)中，4℃，10000rpm，10min，取上清液，得血清備用.

頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟剪碎并稱取肝臟，在每克肝臟中加入0.05mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液10mL，于研缽內(nèi)冰浴研磨成勻漿，再定容至10mL刻度離心管中得到肝臟勻漿備用.

2.4.1 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定[5-8]

取肝臟勻漿2mL加入8mL 10%三氯乙酸（TCA）繼續(xù)研磨均勻.勻漿在高速冷凍離心機(jī)4℃，4000rpm，10min，上清液即為MDA提取液.

取10ml刻度試管2支，一支加入上清液3mL，另一支加水3mL(空白)，各加入0.5%的硫代巴比妥酸（TBA）溶液 3ml，搖勻，在沸水浴中煮沸 10min(從溶液中出現(xiàn)小氣泡時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí))，立即浸入冷水中冷卻.如有存在沉淀，應(yīng)離心處理.以空白作參比，在分光光度計(jì)450nm、532nm、600nm下測(cè)定樣品的吸光度值(用1cm光徑的比色杯).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)下列公式計(jì)算：

式中各因子代表內(nèi)容如下：

OD532、OD600、OD450：450nm、532nm、600nm波長(zhǎng)下的吸光度

C(μmol·L-1)：提取液中 MDA 的濃度(μmol·L-1)

V：提取液的總體積(ml)

W：肝臟鮮重(g)

2.4.2 超氧岐化酶（SOD）活性測(cè)定[9-10]

取肝臟勻漿至5mL的離心管中，放入高速冷凍離心機(jī)中，10000r/min，4℃離心 40min，上清液即為超氧岐化酶（SOD）粗提液.

取8個(gè)洗凈干燥好的燒杯編號(hào)，按表1順序加入試劑及酶液，反應(yīng)系統(tǒng)總體積為3mL.其中4-8號(hào)杯中的酶液量和磷酸鈉緩沖液量可根據(jù)試驗(yàn)材料中酶液濃度和酶的活力進(jìn)行調(diào)整.

表1 超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定（單位：ml）

表中試液：

（1）0.1 mol/L pH7.0 磷 酸 鈉（Na2HPO4-NaH2PO4）緩沖液

（2）0.02 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸鈉緩沖液

（3）6.5×10-4mol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)溶液

（4）含1.0μmol/L EDTA的2×10-5mol/L核黃素溶液

（5）0.05mol/L pH7.5磷酸鈉緩沖液

全部加入各試劑后，混勻充分，取1號(hào)燒杯作為空白對(duì)照置于黑暗處，，比色時(shí)調(diào)零用.其余7個(gè)微燒杯均置于25℃，光強(qiáng)為4500Lux的光照箱內(nèi)照光15min，然后遮光反應(yīng)終止.在560nm波長(zhǎng)下用1號(hào)杯調(diào)零，測(cè)定各杯光密度值.以2、3號(hào)杯液光密度的平均值作為抑制氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光還原率100%，根據(jù)其他光密度計(jì)算出不同酶液量的各反應(yīng)系統(tǒng)中抑制NBT光還原的相對(duì)百分率.以抑制NBT光還原相對(duì)百分率為縱坐標(biāo)，以酶液用量為橫坐標(biāo)，做出二者相關(guān)曲線.

超氧岐化酶（SOD）活力按下式計(jì)算：

式中各因子代表內(nèi)容如下：

A：酶活力值（酶活力單位：U/g（FW）·h）；

V：酶提取液總體積（mL）；

B：一個(gè)酶活力單位的酶液量（μL）；

W：肝臟重（g）；

T：反應(yīng)時(shí)間（min）；

1000：1mL=1000μL；

60：1h=60min.

2.4.3 血清檢測(cè)

用酶聯(lián)免疫試劑盒分別檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的含量.

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 決明子乙酸乙酯提取物對(duì)肝組織丙二醛(MDA)、超氧岐化酶(SOD)的影響

由表2所示，與空白對(duì)照組比較，肝纖維化模型組呈顯著化差異，說(shuō)明肝纖維化模型造模成功.與模型組比較，決明子乙酸乙酯提取物低、中、高三劑量組均能明顯降低小鼠肝臟中丙二醛 (MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，說(shuō)明其可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化水平.

表2 決明子乙酸乙酯提取物對(duì)肝組織丙二醛(MDA)、超氧岐化酶(SOD)的影響（±s,n=12）

表2 決明子乙酸乙酯提取物對(duì)肝組織丙二醛(MDA)、超氧岐化酶(SOD)的影響（±s,n=12）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

丙二醛（M D A）含量μ m o l·g-1 F W組別 劑量（g/k g）超氧岐化酶(S O D)酶活力U/g（F W）·h空白對(duì)照組 - 0.7 3 2 1 7 9.2 7肝纖維化模型組 - 3.4 1△△ 1 5 9.5 8△△低劑量組 0.1 0.8 6 1** 1 8 1.1 1**中劑量組 0.1 5 0.9 8 1** 1 8 5.3 5**高劑量組 0.2 1.2 0 7* 1 7 1.2 1*

3.2 決明子乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）含量的影響

由表3所示，與空白對(duì)照組比較，肝纖維化模型組呈顯著性差異.與肝纖維化模型組比較，決明子乙酸乙酯提取物低劑量組和中劑量組可明顯降低小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）含量，說(shuō)明其對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用.

表3 決明子乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）含量的影響（X±S,n=12）

4 討論

四氯化碳(CCl4)腹腔注射法致肝損傷是一種較為經(jīng)典的肝臟病理模型，其主要作用機(jī)制是四氯化碳(CCl4)進(jìn)入機(jī)體內(nèi)會(huì)在肝細(xì)胞色素P-450酶的作用下產(chǎn)生大量可損傷肝細(xì)胞膜的自由基，自由基與肝細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而導(dǎo)致肝纖維化.本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液造模，結(jié)果顯示模型組與空白組比較有顯著性差異，造模成功且穩(wěn)定性好.

脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物是丙二醛（MDA），其可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜，其含量的高低可反應(yīng)出氧化的損傷程度大小[11]；超氧化物歧化酶（SOD）是存在于細(xì)胞內(nèi)自由基清除的主要抗氧化酶，其可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而起到細(xì)胞膜保護(hù)的作用.本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測(cè)定肝臟中丙二醛含量，采用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，決明子乙酸乙酯提取物高劑量（0.2g/kg）、中劑量（0.15g/kg）和低劑量（0.1g/kg）均能明顯降低肝臟中丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶活力，具有較好的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用.

血清中反映肝細(xì)胞損傷的指標(biāo)主要包括血清酶類及血清鐵等，其中以血清酶檢測(cè)最為常用，如谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ- 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）等.臨床表明，各種酶試驗(yàn)中，以谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）能敏感地提示肝細(xì)胞損傷及其損傷程度.ALT、AST、ALP在血清中含量越高，則肝臟損傷的程度越高.本實(shí)驗(yàn)研究顯示，決明子乙酸乙酯提取物中劑量（0.15g/kg）、低劑量（0.1g/kg）組能夠明顯降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的含量，說(shuō)明其對(duì)肝損傷具有較好的保護(hù)作用.而決明子乙酸乙酯提取物高劑量（0.2g/kg）組的數(shù)據(jù)顯示其可加劇肝臟的損傷，后期實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究分析其原因.

綜上所述，決明子乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠肝臟纖維化具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與決明子

抑制脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān).根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出給藥劑量在0.1g/kg至0.15g/kg能夠安全有效地抑制小鼠肝纖維化，具有較好的肝臟保護(hù)作用.

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R285.5

A

1673-260X（2017）10-0072-04

2017-06-25

2015年安徽新華學(xué)院校級(jí)自然科研項(xiàng)目（2015zr009）