N-端置換提高木聚糖酶AoXyn11A的耐熱性

何 瑤， 吳 芹， 殷 欣， 胡 蝶， 鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

N-端置換提高木聚糖酶AoXyn11A的耐熱性

何 瑤1， 吳 芹1， 殷 欣1， 胡 蝶1， 鄔敏辰*2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

為提高米曲霉（Aspergillus oryzae）糖苷水解酶家族（GHF）11木聚糖酶AoXyn11A的耐熱性，將其N-端置換為來源于嗜熱裂孢菌 （Thermobifida fusca）的同一家族耐熱木聚糖酶pXYL11的對應(yīng)區(qū)域?；谀揪厶敲改蜔嵝缘睦硇栽O(shè)計，采用大引物PCR技術(shù)將AoXyn11A基因（Aoxyn11A）的5′-端DNA片段置換為pXYL11人工合成基因（xyn11PM）的對應(yīng)片段，構(gòu)建出雜合木聚糖酶ATX11A基因（ATx11A）。分別將Aoxyn11A和ATx11A在畢赤酵母GS115中進行了表達，并分析了重組表達產(chǎn)物AoXyn11A和ATX11A的溫度特性。結(jié)果表明：ATX11A的最適溫度Topt由AoXyn11A的50℃提升至65℃，在60℃的半衰期t1/260為55 min，較AoXyn11A延長了41.3倍；ATX11A在55℃處理3 h保留60%以上的酶活性，而AoXyn11A處理15 min酶活性完全喪失。本研究通過N-端置換顯著改善了AoXyn11A的溫度特性。

木聚糖酶；N-端置換；耐熱性；分子動力學(xué)模擬；理性設(shè)計

木 聚 糖 酶 （endo-β -1，4-D-xylanases，EC 3.2.1.8）從木聚糖分子主鏈的內(nèi)部水解β-1，4糖苷鍵產(chǎn)生不同聚合度的木寡糖，是木聚糖降解酶系的關(guān)鍵組分?；谝患壗Y(jié)構(gòu)的同源性比對和疏水簇分析，大多數(shù)木聚糖酶歸屬糖苷水解酶家族（GHF）10和11[1]。GHF11木聚糖酶具有底物特異性高、相對分子質(zhì)量低 （＜30×103）和單一催化結(jié)構(gòu)域等特征，其三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)右手半握形狀，主要由1個短的α-螺旋和2個β-折疊片A和B構(gòu)成[2]。木聚糖酶尤其是耐熱酶應(yīng)用廣泛，如在飼料造粒和紙漿漂白等工藝過程中均需要木聚糖酶具備耐高溫的特性[3]。目前，除了從極端環(huán)境中篩選產(chǎn)耐熱木聚糖酶的微生物菌株外，另一種有效的方法是采用基因工程技術(shù)對酶學(xué)特性優(yōu)良的中溫酶實施耐熱性改造[4]。Zhang等[5]用極端耐熱木聚糖酶EvXyn11TS的N-端置換Aspergillus usamii木聚糖酶AuXyn11A的對應(yīng)區(qū)域，構(gòu)建出最適溫度和耐熱性均大幅度提高的雜合木聚糖酶AEXynM。

作者所在實驗室已從A.oryzae CICC40186中克隆出了中溫酶AoXyn11A的基因，并將其在Pichia pastoris GS115中進行了表達，該酶活性高，pH 范圍廣，但熱穩(wěn)定性較差[6]。 pXYL11（GenBank：AAV64879）是一種源自嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）NTU22的GHF11耐熱木聚糖酶[7]。作者所在實驗室根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性對該酶的編碼基因進行優(yōu)化和人工合成，并命名為xyn11PM（GenBank：KP119614）。為改善中溫酶 AoXyn11A 的溫度特性，本文作者基于木聚糖酶一級結(jié)構(gòu)比對、三維結(jié)構(gòu)同源建模和分子動力學(xué)模擬的理性設(shè)計，采用大引物PCR技術(shù)將中溫酶基因Aoxyn11A的5′-端DNA片段置換為耐熱酶基因xyn11PM的對應(yīng)片段，構(gòu)建雜合酶基因ATx11A。將Aoxyn11A和ATx11A分別在畢赤酵母GS115中表達，分析和比較重組表達產(chǎn)物AoXyn11A和ATX11A的溫度特性。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 和 JM109菌株、畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115菌株和表達質(zhì)粒pPIC9K，由作者所在實驗室保藏；克隆質(zhì)粒pUCm-T，購自上海Sangon公司；重組質(zhì)粒pUCm-T-xyn11PM和pPIC9K-Aoxyn11A，由本實驗室構(gòu)建和保藏；LB、YPD、YPD-G418、MD、BMGY 和 BMMY培養(yǎng)基的配制，參照Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、DNA Marker和蛋白質(zhì) Marker，均購自大連TaKaRa公司；Geneticin G418和 EZ-10柱式 DNA膠回收試劑盒，購自上海Sangon公司；樺木木聚糖、D-木糖和考馬斯亮藍R-250，Sigma公司產(chǎn)品；Sephadex G-50，Amersham Pharmacia Biotech 公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 木聚糖酶一級和三維結(jié)構(gòu)的分析

采用DNAMAN 6.0軟件和NetNGlyc 1.0程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/） 對 木 聚糖酶一級結(jié)構(gòu)進行同源性比對和N-糖基化位點分析。在PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb/org/）尋找一種與AoXyn11A序列同源性較高的GHF11木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)，作為木聚糖酶同源建模的模板，運用MODELLER 9.9 程 序 （http：//salilab.org/modeller/）進行三維結(jié)構(gòu)建模[8]。

采 用 GROMACS 4.5 程 序 包 （http：//www.gromacs.org/）對木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)進行分子動力學(xué)（molecular dynamic，MD）模擬，其模擬體系選用GROMOS 96力場，溶質(zhì)分子被1.5 nm的SPC/E水分子層包裹。MD模擬之前，分別對受約束和去約束的溶質(zhì)分子體系進行兩次能量優(yōu)化，即先采用最陡下降法優(yōu)化800步，再采用共軛梯度法優(yōu)化1 200步。將模擬溫度在300 K，模擬時間為5 ns下的模擬結(jié)果導(dǎo)入PDB文件中，利用B-FITTER軟件從PDB文件中提取每個氨基酸的B-factor值；另外，在溫度為500 K，時間為5 ns條件下進行MD模擬，模擬結(jié)束后，用程序包中的g_rms軟件計算出均方根偏差（RMSD）值。比較AoXyn11A和pXYL11的B-factor值，選定N-端置換的區(qū)域；分析AoXyn11A和ATX11A的根均方偏差 （root mean square deviation，RMSD）值，預(yù)測雜合酶ATX11A的耐熱性。

1.4 ATx11A重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

基于GHF11木聚糖酶序列同源性比對和MD模擬，用pXYL11 N端42個氨基酸殘基置換AoXyn11A對應(yīng)的41個殘基。根據(jù)xyn11PM和Aoxyn11A核苷酸序列設(shè)計PCR引物，由上海Sangon公司合成（表1）。以pUCm-T-xyn11PM為模板、Xyn-F和Tf-R為引物，PCR擴增基因片段Tf；以pPIC9K-Aoxyn11A為模板、Tf和Aox-R為引物，采用大引物PCR技術(shù)[9]擴增雜合酶基因ATx11A。將PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，經(jīng)藍白斑篩選、酶切鑒定，陽性轉(zhuǎn)化子送上海Sangon公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pUCm-T-ATx11A經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，回收目的條帶，與經(jīng)同樣雙酶切的表達質(zhì)粒pPIC9K連接，獲重組表達質(zhì)粒pPIC9K-ATx11A，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，DNA測序驗證。

表1 擴增雜合酶基因ATx11A的PCR引物Table 1 PCR primers for the amplification of hybrid enzyme gene ATx11A

1.5 木聚糖酶的表達和純化

將pPIC9K-Aoxyn11A和pPIC9K-ATx11A分別用SalⅠ線性化，電轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115。重組畢赤酵母的鑒定和多拷貝篩選參照Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊。重組子經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1.0%甲醇誘導(dǎo)表達72 h，上清液用75%飽和度的（NH4）2SO4鹽析、離心，沉淀溶于20 mmol/L檸檬酸–Na2HPO4緩沖液（pH 5.5）。粗酶液經(jīng)透析、超濾濃縮（膜截留相對分子質(zhì)量為10×103，Millipore公司）至1 mL，上樣 Sephadex G-50 層析柱（1.6 cm×80 cm）進行純化。采用SDS-PAGE分析重組表達產(chǎn)物；Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。

1.6 木聚糖酶活性的測定

酶活性測定參見文獻[10]并略作改動。2.4 mL質(zhì)量濃度0.5 g/dL樺木木聚糖溶液（用pH 5.5、50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制）中加入0.1mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃反應(yīng)15 min，加入2.5 mL DNS試劑，在沸水浴中顯色7 min，測定OD540。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖（以D-木糖計）所需的酶量定義為1個木聚糖酶活性單位（U）。

1.7 溫度對木聚糖酶活性的影響

在40～75℃下，按1.6的方法測定木聚糖酶活性。最適溫度Topt定義為最高酶活性（100%相對酶活性）所對應(yīng)的溫度。將酶液置于50～65℃處理不同時間，按1.6的方法測定殘余酶活性，未處理酶液的酶活性以100%計。酶的半衰期t1/260定義為經(jīng)60℃處理殘余酶活性為50%時所對應(yīng)的時間。

1.8 木聚糖酶動力學(xué)常數(shù)的測定

以不同質(zhì)量濃度（1.0～10.0 mg/mL）的樺木木聚糖溶液 （用pH 5.5、50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制）為底物，在木聚糖酶各自的最適溫度Topt下按1.6的方法測定酶活性，并采用Origin 8.0軟件進行非線性擬合，計算各自的Km和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶一級和三維結(jié)構(gòu)的分析

中溫酶AoXyn11A與耐熱酶pXYL11一級結(jié)構(gòu)的比對結(jié)果表明，兩者整體的同源性較高（63.5%），但它們在N-端區(qū)域的同源性卻較低，其中AoXyn11A N-端41個氨基酸殘基與pXYL11對應(yīng)的42個殘基的同源性為50.0%；另外，在耐熱酶pXYL11的N-端區(qū)域 （A1～T42）內(nèi)含有2個N-糖基化位點 N5-E-T7和 N34-Y-S36（黃色背景），如圖 1（a）所示。上述分析結(jié)果在一定程度上說明pXYL11的N-端可能對其耐熱性貢獻較大。由如圖1（b）可見，AoXyn11A三維結(jié)構(gòu)的催化活性中心 （Glu84和Glu175）遠離其N-端區(qū)域，由此推測N-端置換對AoXyn11A的催化活性影響不大。

圖1 AoXyn11A和pXYL11 N-端序列的同源性比對及AoXyn11A的三維結(jié)構(gòu)Fig.1 N-Terminal sequence alignment of AoXyn11A and pXYL11 and the three-dimensional structure of AoXyn11A

2.2 同源建模及分子動力學(xué)模擬

選擇與pXYL11序列完全一致、且與AoXyn11A同源性較高的嗜熱裂孢菌 （T.fusca）木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu) （PDB：3ZSE）為模板，對AoXyn11A和ATX11A進行同源建模和MD模擬。有研究表明酶蛋白中氨基酸殘基的靈活度與其B-factor值成正相關(guān)[11]。通過比較 AoXyn11A和pXYL11 的 B-factor值發(fā)現(xiàn)，AoXyn11A N-端 （S1～V41）氨基酸的B-factor值大多數(shù)大于pXYL11對應(yīng)區(qū)域的B-factor值（圖 2），表明 AoXyn11A N-端剛性較弱。因此，擬將AoXyn11A N-端置換為pXYL11的對應(yīng)區(qū)域（A1～T42），獲得雜合酶 ATX11A。

RMSD值是指在模擬高溫下某一時刻的蛋白質(zhì)構(gòu)象與其初始構(gòu)象之間各個原子的根均方偏差值，可作為評價蛋白質(zhì)/酶分子耐熱性的重要指標(biāo)。RMSD值越小，則蛋白質(zhì)/酶分子中各個原子在高溫下的運動幅度越小，即蛋白質(zhì)/酶的耐熱性越高[12]。由圖3可見，ATX11A的RMSD值較AoXyn11A的小，由此推測ATX11A的耐熱性高于AoXyn11A。

圖2 AoXyn11A和pXYL11氨基酸殘基的B-factor值Fig.2 B-factor values of amino acids of AoXyn11A and pXYL11

2.3 重組表達質(zhì)粒pPIC9K-ATx11A的構(gòu)建

將 Aoxyn11A 5′-端的 123 bp置換為 xyn11PM 5′-端的 126 bp。以 pUCm-T-xyn11PM 為模板，第一輪PCR擴增獲得長度約為150 bp的基因片段Tf（圖4泳道1）；再以pPIC9K-Aoxyn11A為模板，第二輪PCR擴增獲得長度約為580 bp的雜合酶基因ATx11A（圖4泳道2）。測序結(jié)果表明，ATx11A全長570 bp， 包含126 bp的xyn11PM 5′-端片段和444 bp Aoxyn11A 3′-端片段，編碼 189個氨基酸，與預(yù)期的完全一致。將ATx11A克隆至pPIC9K，獲重組表達質(zhì)粒pPIC9K-ATx11A。

圖3 AoXyn11A和ATX11ARMSD值的進程曲線Fig.3Curves of RMSD values of AoXyn11A and ATX11A

圖4 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.4 AnalysisofPCR productsby agarose gel electrophoresis

2.4 重組木聚糖酶的表達和純化

選取若干在YPD-G418（4.0 mg/mL）平板上生長良好的單菌落，按照Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊進行誘導(dǎo)表達 （30℃培養(yǎng)72 h，每隔24 h添加終體積分?jǐn)?shù)為1.0%的甲醇），按1.6的方法測定上清液酶活性，篩選到2個分別產(chǎn)重組AoXyn11A和ATX11A活性最高的重組畢赤酵母GS115/Aoxyn11A和GS115/ATx11A，它們的酶活性分別為210.8 U/mL和148.1 U/mL，而在空白對照GS115/pPIC9K的上清液中未檢測到木聚糖酶活性。分別取GS115/Aoxyn11A和GS115/ATx11A的誘導(dǎo)表達上清液，采用 （NH4）2SO4鹽析、超濾濃縮和Sephadex G-50凝膠層析進行純化。SDS-PAGE分析顯示，純化的重組AoXyn11A約在21.2×103（表觀相對分子質(zhì)量）處呈現(xiàn)單一條帶 （圖5泳道1），與其理論相對分子質(zhì)量20.0×103接近。由于在ATX11A序列中含有2個N-糖基化位點 （N5-E-T7和N34-Y-S36），使得理論相對分子質(zhì)量20.2×103的重組ATX11A的表觀相對分子質(zhì)量達到27.4×103（圖 5 泳道 2）。

2.5 重組木聚糖酶的溫度特性

按1.7的方法分析了溫度對重組AoXyn11A和ATX11A的影響 （圖 6和圖 7）。由圖 6可見，ATX11A的最適溫度Topt為65℃，較AoXyn11A的50℃提升了15℃。Sun等[13]用褐色熱單胞菌（Thermomonospora fusca）耐熱木聚糖酶N-端的43個氨基酸殘基置換Aspergillus niger木聚糖酶相應(yīng)的36個殘基，所獲雜合酶Atx的最適溫度提高了10℃，低于本研究的結(jié)果。由圖7可見，ATX11A在60℃的半衰期t1/260為55 min，較AoXyn11A （t1/260=1.3 min）延長了41.3倍；且ATX11A在55℃處理180 min仍保留60%以上的酶活性，而AoXyn11A在同一溫度下處理15 min酶活性完全喪失。上述分析結(jié)果表明，通過N-端置換顯著提高了AoXyn11A的最適溫度和耐熱性。

圖5 純化的重組AoXyn11A和ATX11A的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant AoXyn11A and ATX11A

圖6 純化的重組AoXyn11A和ATX11A的最適溫度Fig.6 Temperature optima of the purified recombinant AoXyn11A and ATX11A

圖7 純化的重組AoXyn11A和ATX11A的耐熱性Fig.7 Thermostabilities of the purified recombinant AoXyn11A and ATX11A

運用Protein Interactions Calculator（PIC）軟件（http：//pic.mbu.iisc.ernet.in/job.html） 分析了ATX11A三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基間的相互作用。結(jié)果顯示，由于N-端置換，引入了2個離子鍵His10-Asp11和Asp11-Lys49以及5個主鏈與支鏈之間的氫鍵，由此推測引入的離子鍵和氫鍵對重組ATX11A溫度特性的改善起到一定的作用[14-15]。此外，重組ATX11A最適溫度和耐熱性的提高也可能與其在P.pastoris GS115表達的過程中發(fā)生了N-糖基化有關(guān)[16]。

2.6 酶動力學(xué)常數(shù)的測定

在重組AoXyn11A和ATX11A各自的最適溫度 （Topt=50℃和65℃）下，按 1.8的方法測得AoXyn11A和ATX11A對樺木木聚糖的Km值分別為 2.55 mg/mL和 4.36 mg/mL，Vmax值分別為 3 917 U/mg和 4 168 U/mg。

3 結(jié) 語

理性設(shè)計是基于數(shù)據(jù)庫和文獻中的相關(guān)信息和數(shù)據(jù)，通過計算機模擬和分析，為目的蛋白質(zhì)/酶分子的定向改造提供可靠的預(yù)測模型和結(jié)果，生物信息學(xué)、數(shù)據(jù)庫和計算機科學(xué)的快速發(fā)展使其優(yōu)勢日趨明顯[4]。本研究以米曲霉AoXyn11A為對象，基于木聚糖酶一級結(jié)構(gòu)比對、三維結(jié)構(gòu)同源建模和分子動力學(xué)模擬的理性設(shè)計，采用大引物PCR技術(shù)將中溫酶基因Aoxyn11A的5′-端DNA片段置換為耐熱酶基因xyn11PM的對應(yīng)片段，構(gòu)建出雜合酶基因ATx11A。分別將Aoxyn11A和ATx11A在畢赤酵母GS115中進行了表達，并分析了重組表達產(chǎn)物AoXyn11A和ATX11A的溫度特性。結(jié)果表明，通過N-端置換顯著提高了AoXyn11A的最適溫度和耐熱性。ATX11A不僅保留了AoXyn11A優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，而且顯著改善了其溫度特性，使其在食品、飼料和造紙等工業(yè)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。

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會議名稱(中文)：第六屆全國“跨學(xué)科蛋白質(zhì)研究”學(xué)術(shù)討論會

所屬學(xué)科：生物物理學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué),細胞生物學(xué),生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)

開始日期：2017-09-22

結(jié)束日期：2017-09-24

所在城市：廣東省 廣州市

具體地點：廣州匯華希爾頓逸林酒店

主辦單位：中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會蛋白質(zhì)專業(yè)委員會

承辦單位：中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院

會議主席：施一公

聯(lián)系人：凌老師

聯(lián)系電話：020-32015232

E-MAIL：ling_yixia@gibh.ac.cn

會議網(wǎng)站：http://cps2017.csp.escience.cn/dct/page/1

會議背景介紹：第六屆全國“跨學(xué)科蛋白質(zhì)研究”學(xué)術(shù)討論會將于2017年9月22日-24日在廣東廣州召開，此次會議由中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會蛋白質(zhì)專業(yè)委員會舉辦，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院承辦。本次會議將邀請眾多在蛋白質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域有重要影響力的科學(xué)家參加，不僅為本領(lǐng)域的中青年科學(xué)工作者提供學(xué)術(shù)交流的平臺，也為近期回國或進入蛋白質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域的同行提供融入國內(nèi)隊伍的機會。此次學(xué)術(shù)會議的召開，將集中展示過去兩年我國在蛋白質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域的輝煌成就，展現(xiàn)國內(nèi)正在開展的令人激動的研究工作，展望未來我國在蛋白質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域的美好前景。此次會議將是我國蛋白質(zhì)科學(xué)乃至學(xué)術(shù)界的又一次盛會。

Enhancement in the Thermotolerance of Xylanase（AoXyn11A）by N-Terminus Replacement

HE Yao1， WU Qin1， YIN Xin1， HU Die1， WU Minchen*2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To enhance the thermotolerance of AoXyn11A，a glycoside hydrolase family （GHF）11 mesophilic xylanase from Aspergillus oryzae，its N-terminal region was substituted with the corresponding one of the same family thermostable xylanase pXYL11 from Thermobifida fusca NTU22.Based on the rational design of xylanase thermotolerance，an ATX11A-encoding gene（ATx11A）was constructed by replacing the 5′-end DNA fragment of AoXyn11A gene（Aoxyn11A）with the corresponding one of the synthesized pXYL11 gene （xyn11PM）using the megaprimer PCR technique.Aoxyn11A and ATx11A were expressed in Pichia pastoris GS115，respectively，and the temperature characteristics of the expressed recombinant products，AoXyn11A and ATX11A，were analyzed.The results indicated that the temperature optimum （Topt） of hybrid xylanase ATX11A was 65 ℃，which was 15 ℃ higher than that of AoXyn11A.Its half-life at 60 ℃（t1/260）was 55 min，whichwas 41.3-fold longer than that of AoXyn11A.When incubated at 55℃，ATX11A retained more than 60%of its original activity for 3 h，while AoXyn11A entirely lost its activity only for 15 min.In this work，the temperature characteristics of AoXyn11A were significantly improved by N-terminus replacement.

xylanase，N-terminus replacement，thermotolerance，molecular dynamic simulation，rational design

Q 936

A

1673—1689（2017）08—0855—07

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.011

2015-05-08

國家自然科學(xué)基金項目（31271811）。

*通信作者：鄔敏辰（1962—），男，江蘇無錫人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶工程與基因工程研究。E-mail：bioch@163.com

何瑤，吳芹，殷欣，等.N-端置換提高木聚糖酶AoXyn11A的耐熱性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（08）：855-861.