鯽魚MBSP的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體制備

李 婷 ， 李 歡 ， 陳海英 ， 杜翠紅 *

（1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省水產(chǎn)品深加工工程研究中心，福建 廈門361021）

鯽魚MBSP的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體制備

李 婷1，2， 李 歡1，2， 陳海英1，2， 杜翠紅*1，2

（1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省水產(chǎn)品深加工工程研究中心，福建 廈門361021）

構(gòu)建鯽魚肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶 （MBSP）的原核表達(dá)菌株Rosetta（pET28a-MBSP），獲得重組MBSP，以制備MBSP多克隆抗體。將鯽魚MBSP全長(zhǎng)基因（MBSP）借助表達(dá)載體pET-28a構(gòu)建重組表達(dá)菌株Rosetta（pET28a-MBSP），并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后獲得重組MBSP。利用Ni-NTA agarose親和層析柱純化重組蛋白并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。以純化后的重組MBSP作為抗原免疫新西蘭兔，獲得MBSP多克隆抗體。分別采用ELISA和Western blot技術(shù)測(cè)定其效價(jià)和特異性。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析、Western blot檢測(cè)及質(zhì)譜鑒定，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)為重組MBSP，其相對(duì)分子質(zhì)量約為28×103，與天然MBSP大小一致，主要以包涵體形式存在。將其免疫兔子后，從血清中獲得了與MBSP發(fā)生特異性反應(yīng)的高效價(jià)多克隆抗體。本研究中成功表達(dá)和純化了重組MBSP蛋白，制備了高效價(jià)的特異性MBSP多克隆抗體，為MBSP的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶；原核表達(dá)；蛋白純化；Western blot；多克隆抗體

肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶（MBSP）是一種堿性蛋白酶，屬于絲氨酸蛋白酶家族中的一員，因其與肌原纖維蛋白緊密結(jié)合而得名。有關(guān)魚類MBSP的報(bào)道已經(jīng)證實(shí)，魚類MBSP可降解肌原纖維蛋白，從而造成魚糜制品凝膠劣化，降低其商業(yè)價(jià)值[1-3]，因此，有必要對(duì)魚類MBSP進(jìn)行深入研究，并開發(fā)其酶抑制劑。關(guān)于魚類MBSP的分離純化目前已有報(bào)道：如Osatomi等[4]在1997年獲得鯉魚肌肉的MBSP；隨后Cao等分別從狗母魚[5-6]、白鰱魚[7]、白姑魚[8]和鯽魚[9]等魚類肌肉中也純化了MBSP。同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道[5-11]，魚類MBSP具有與胰蛋白酶相似的底物特異性，而其熱穩(wěn)定較高，有望開發(fā)為一種蛋白質(zhì)譜鑒定中的新型工具酶。但天然MBSP在有些魚類中含量很低、不易檢測(cè)，從而影響對(duì)其分離純化和深入研究，因此，MBSP基因的克隆和重組表達(dá)受到研發(fā)人員的關(guān)注。目前已通過RACE技術(shù)克隆到了鯽魚[9]、鯉魚[12]和鰱魚的MBSP基因序列，從而為魚類MBSP的重組表達(dá)及其多克隆抗體的制備提供了前提保證。本文中采用基因重組技術(shù)在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得了重組鯽魚MBSP蛋白，并用該蛋白質(zhì)制備了特異性多克隆抗體，為進(jìn)一步研究MBSP的性質(zhì)和功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ，Taq DNA聚合酶，T4連接酶，λ-HindⅢ DNA Marker，2000 DNA marker，Protein Marker：購(gòu)自大連寶生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒，DNA片段回收試劑盒：購(gòu)自上海天根生物有限公司；蛋白胨，酵母提取物，IPTG，丙烯酰胺，氯化鈉及過硫酸銨等：購(gòu)自上海生工生物有限公司；Ni-NTA agarose：購(gòu)自Pharmacia公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔：購(gòu)自泰京生物有限公司；NC膜：購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；完全佐劑和不完全佐劑：購(gòu)自德國(guó)Sigma公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3只新西蘭大白兔，每只體重約2.5 kg，購(gòu)自松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)。

1.1.3 菌株與載體 大腸桿菌菌株DH5α和Rosetta、表達(dá)載體pET-28a均由本實(shí)驗(yàn)室保存，其中菌株DH5α為克隆宿主，菌株Rosetta為表達(dá)宿主；重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-MBSP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)及鯽魚MBSP基因（MBSP）的PCR擴(kuò)增 參照 GenBank（DQ872434）中報(bào)道的鯽魚MBSP的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，其核苷酸序列分別為：

以上引物交由上海Invitrogen公司合成。

以重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-MBSP為模板，利用以上設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得帶有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ的鯽魚MBSP基因（MBSP）片段。PCR條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 45 s，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，利用DNA片段回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-MBSP的構(gòu)建 將質(zhì)粒pET-28a和1.2.1中獲得的PCR產(chǎn)物 （即：MBSP基因片段）同時(shí)進(jìn)行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，DNA片段回收試劑盒進(jìn)行回收，使用T4連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，通過含50 μg/mL卡那霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，于37℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切驗(yàn)證得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送至上海Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步確認(rèn)重組質(zhì)粒pET-28a-MBSP中目的基因序列及其閱讀框架的正確性。

1.2.3 重組表達(dá)菌株Rosetta（pET-28a-MBSP）的構(gòu)建及其誘導(dǎo)表達(dá) 質(zhì)粒提取試劑盒提取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a-MBSP，42℃熱激轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，挑取LB（含50 μg/mL卡那霉素）平板篩選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證（反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min），從而獲得重組表達(dá)菌株Rosetta（pET-28a-MBSP）。

將重組表達(dá)菌株Rosetta（pET-28a-MBSP）接種至10 mL LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，按體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600為1.5，加入乳糖至終質(zhì)量濃度為4 mg/L，誘導(dǎo)表達(dá)8 h，以未加誘導(dǎo)劑的細(xì)菌培養(yǎng)物為陰性對(duì)照，重復(fù)3次。

1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)及Western blot鑒定 收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲波破碎，冷凍離心，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，并用 （His）6標(biāo)簽的多克隆抗體（稀釋倍數(shù) 1∶2 000）進(jìn)行 Western blot鑒定，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（稀釋倍數(shù) 1∶20 000），以確定重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量及其表達(dá)方式，具體步驟參照劉西之等[13]報(bào)道的方法。

1.2.5 重組MBSP的純化和質(zhì)譜鑒定 對(duì)重組表達(dá)菌株Rosetta（pET-28a-MBSP）進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，用破菌緩沖液（0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），0.15 mol/L NaCl）重懸菌體，超聲波破菌，離心收集包涵體沉淀，用溶菌緩沖液（0.01 mol/L Tris-HCl （pH 8.0），0.1 mol/L NaH2PO4，8 mol/L 尿素）攪拌使之充分溶解，離心收集上清液。將上清液與經(jīng)平衡緩沖液 A1（0.05 mol/L Na2HPO4，0.015 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素）處理過的Ni-NTA agarose充分結(jié)合，緩沖液A2（0.05 mol/L Na2HPO4，0.03 mol/L 咪 唑 ，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素）洗去雜蛋白質(zhì)，洗脫液（0.05 mol/L Na2HPO4，0.3 mol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L 尿素） 洗脫目的蛋白質(zhì)，即獲得純化的含（His）6標(biāo)簽的重組蛋白，分別進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。將SDS-PAGE電泳分離的MBSP目的條帶切下，送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行MALDITOF-MS質(zhì)譜鑒定。

1.2.6 MBSP多克隆抗體的制備及其檢測(cè) 將純化后的重組MBSP（質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL）與等體積弗氏完全佐劑混勻并充分乳化后，分散15個(gè)點(diǎn)對(duì)新西蘭兔脊柱兩側(cè)進(jìn)行皮下免疫注射（每次200 μg的重組MBSP）。初次免疫后，每間隔兩周加強(qiáng)免疫，劑量如前，共免疫4次。第1次用弗氏完全佐劑，其余用弗氏不完全佐劑。免疫完成后取血測(cè)效價(jià)，效價(jià)達(dá)到理想值后再進(jìn)行兔頸動(dòng)脈取血，5 000 r/min離心10 min，分離血清，于-80℃保存。采用ELISA法，以純化的重組MBSP作為包被抗原，一抗為免疫兔血清，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，一抗的稀 釋 梯 度 分 別 ：1/50、1/502、1/503、1/504、1/505、1/506，1/507，TMB 顯色后，在 λ=450 nm 處測(cè)定光密度值。確定抗體效價(jià)后，采用Western blot的方法檢測(cè)免疫兔血清的特異性，具體步驟參考1.2.4。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-MBSP的構(gòu)建

以重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-MBSP為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增鯽魚MBSP基因片段，PCR產(chǎn)物為700 bp左右（圖1），與預(yù)期大小相符。將表達(dá)載體pET-28a和MBSP基因片段進(jìn)行雙酶切，采用T4連接酶將二者連接后成功轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α，提取重組質(zhì)粒，雙酶切獲得約700 bp的目的基因片段和5 000 bp左右的載體pET-28a線性片段 （圖 2），DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)目的基因大小為669 bp，其基因序列和閱讀框架均正確，重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-MBSP構(gòu)建成功。

2.2 重組表達(dá)菌株Rosetta（pET-28a-MBSP）的構(gòu)建及其誘導(dǎo)表達(dá)

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-MBSP轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞后，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證 （圖3），結(jié)果顯示表達(dá)菌株 Rosetta（pET-28a-MBSP）構(gòu)建成功。

圖1 MBSP基因的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 AgarosegelelectrophoresisanalysisofPCR product of MBSP

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-MBSP的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pET-28a-MBSP（ EcoRⅠand NotⅠ）

圖3 重組質(zhì)粒pET-28a-MBSP的PCR鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pET-28a-MBSP

表達(dá)菌株Rosetta（pET-28a-MBSP）經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破碎，分別取全菌、上清液及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)及Western bolt鑒定（圖4）。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達(dá)的菌液中出現(xiàn)一條相對(duì)分子質(zhì)量為28×103左右的蛋白質(zhì)條帶，該條帶可以與（His）6標(biāo)簽的多克隆抗體進(jìn)行免疫雜交反應(yīng)，說明該蛋白質(zhì)為重組蛋白。該重組蛋白與天然鯽魚MBSP的相對(duì)分子質(zhì)量一致，且以包涵體形式存在。

圖4 MBSP重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)及Western blot鑒定結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE and Western blotanalysisof recombinant MBSP

2.3 重組MBSP的純化和質(zhì)譜鑒定

將誘導(dǎo)表達(dá)后得到的包涵體用8 mol/L尿素溶解后，采用Ni-NTA agarose親和層析對(duì)其進(jìn)行純化，通過SDS-PAGE檢測(cè)和Western blot鑒定 （圖5），得到電泳級(jí)純度為85% 以上的重組MBSP。將純化后的MBSP進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定（圖6），結(jié)果顯示純化后的產(chǎn)物確定為鯽魚MBSP，可用來(lái)制備多克隆抗體。

圖5 純化的重組MBSP的SDS-PAGE檢測(cè)和Western blot鑒定結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of purified recombinant MBSP

圖6 鯽魚MBSP的氨基酸序列及重組MBSP質(zhì)譜鑒定肽段序列覆蓋圖Fig.6 Amino acid sequence of crucian carp MBSP and fragments of recombinant MBSP mature peptides digested by trypsin

2.4 多克隆抗體的制備及檢測(cè)

用純化的重組MBSP免疫新西蘭兔獲得血清，采用ELISA法檢測(cè)其效價(jià)，結(jié)果顯示其抗體效價(jià)達(dá)到 1∶503倍（圖 7）。

圖7 ELISA檢測(cè)MBSP多克隆抗體效價(jià)Fig.7 ELISA detection of the MBSP polyclonal antibody titer

以MBSP的多克隆抗體為一抗，帶HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western blot驗(yàn)證（圖8），結(jié)果表明，陰性對(duì)照（未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液）沒有特異性條帶（圖 8（b），lane 2B），而大腸桿菌表達(dá)的重組MBSP（圖8（b），lane 1B）和畢赤酵母表達(dá)的重組MBSP（圖 8（b），lane 3B）均出現(xiàn)特異性條帶，表明 MBSP的多克隆抗體制備成功。其中，畢赤酵母表達(dá)的重組MBSP由本研究室提供，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待發(fā)表。

3 討論

魚類的MBSP在魚糜制品生產(chǎn)過程中被認(rèn)為是導(dǎo)致凝膠劣化的主要因素[1]。因此，有必要對(duì)不同魚類MBSP的進(jìn)行分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究，以開發(fā)其酶抑制劑。另一方面，MBSP是一種與胰蛋白酶性質(zhì)相似的絲氨酸蛋白酶，但其熱穩(wěn)定性優(yōu)于哺乳動(dòng)物的胰蛋白酶[5-11]。而在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定中，常用胰蛋白酶或蛋白內(nèi)切酶Lys-C作為工具酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行降解以生成小肽[14-15]。但胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性差，而內(nèi)切酶Lys-C價(jià)格偏高，影響了其實(shí)際使用。因此，將MBSP開發(fā)為蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定中的工具酶，具有很好的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值。然而，天然MBSP在有些魚類體內(nèi)含量極低，常常檢測(cè)不到該酶的存在，從而造成其分離純化困難，因此，有必要通過基因重組技術(shù)獲得大量的重組MBSP。一方面通過制備多克隆抗體以提高檢測(cè)MBSP的靈敏度；另一方面也有利于研究其酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用開發(fā)。

圖8 MBSP多克隆抗體的Western blot鑒定Fig.8 Western blotting analysis of MBSP polyclonal antibody

本文作者利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的鯽魚MBSP的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用RTPCR技術(shù)獲得編碼鯽魚MBSP成熟蛋白的基因序列，將其與表達(dá)載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主Rosetta中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了重組鯽魚MBSP的包涵體蛋白（圖4）。同時(shí)本研究室還利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行重組表達(dá)，獲得了重組MBSP（實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待發(fā)表）。其中，原核系統(tǒng)表達(dá)的重組MBSP的主要為包涵體蛋白，雖然其不具有生物學(xué)活性，但其表達(dá)量較高（圖8）、且?guī)в校℉is）6 標(biāo)簽（圖 4（b））便于采用親和層析技術(shù)進(jìn)行純化，以獲得純度較高的重組 MBSP，更適合用于多克隆抗體的制備；而真核系統(tǒng)表達(dá)的重組MBSP，雖然表達(dá)量較低（圖8），但其具有生物學(xué)活性，可用于研究其酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用開發(fā)。

本研究采用Ni-NTA agarose親和層析技術(shù)純化得到了電泳級(jí)為85% 以上的重組蛋白（圖5），通過質(zhì)譜鑒定技術(shù)確定該蛋白為重組鯽魚MBSP（圖7）。將重組MBSP免疫新西蘭兔，獲得了高效價(jià)的抗MBSP的特異性多克隆抗體。因免疫印跡具有高靈敏性，能與含量極低的抗原發(fā)生特異性結(jié)合。因此本文獲得的MBSP多克隆抗體可用于MBSP的檢測(cè)。

親和層析是利用生物分子間的特異性相互作用，通過將具有親和力的2個(gè)分子中的1個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化的技術(shù)。如本文中采用Ni-NTA agarose親和層析柱純化帶有 （His）6標(biāo)簽的重組蛋白（圖5）；另外重組蛋白也常含有GST標(biāo)簽，可采用谷胱甘肽親和層析樹脂進(jìn)行純化。這兩種親和層析樹脂可成功純化原核表達(dá)的重組蛋白[16-18]，但因天然蛋白不含（His）6標(biāo)簽和GST標(biāo)簽，使該層析柱無(wú)法應(yīng)用到天然蛋白的純化中。而本研究中所獲得的MBSP特異性多克隆抗體可制備特異性免疫親和層析樹脂，用來(lái)純化天然MBSP，以解決生物體內(nèi)MBSP含量低、分離純化步驟繁瑣、回收率低等問題，為MBSP的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 語(yǔ)

利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的鯽魚MBSP的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，獲得編碼鯽魚MBSP成熟蛋白的基因序列，成功構(gòu)建重組MBSP的原核表達(dá)菌株Rosetta/pET-28a-MBSP，并采用乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明，重組蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)以包涵體形式成功表達(dá)。

采用Ni-NTA agarose親和層析技術(shù)對(duì)表達(dá)的包涵體蛋白進(jìn)行純化，得到了電泳級(jí)純度為85%以上的重組蛋白，通過質(zhì)譜鑒定技術(shù)確定該蛋白質(zhì)為重組鯽魚MBSP。

將重組MBSP免疫新西蘭兔，獲得了高效價(jià)的抗MBSP的特異性多克隆抗體，可用于后續(xù)畢赤酵母表達(dá)重組MBSP的檢測(cè)。

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歐盟擬設(shè)定谷氨酸鹽食品添加劑限額

2017年7月12日，歐洲食品安全局發(fā)表聲明說，該機(jī)構(gòu)對(duì)谷氨酸和谷氨酸鹽的安全性進(jìn)行了重新評(píng)估，認(rèn)為消費(fèi)者攝入這類食品添加劑的最大限額為每天每公斤體質(zhì)量30毫克。

在歐盟，谷氨酸和谷氨酸鹽被允許作為食品添加劑使用，以提高食物的鮮味。目前歐盟批準(zhǔn)食品中添加谷氨酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高水平為10 g/kg。

歐洲食品安全局說，為保護(hù)消費(fèi)者安全，該機(jī)構(gòu)對(duì)谷氨酸、谷氨酸鈉、谷氨酸鉀、谷氨酸鈣、谷氨酸銨以及谷氨酸鎂這些食品添加劑的每日允許攝入量進(jìn)行了分析。根據(jù)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行的毒性試驗(yàn)，提出了不會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)的最高劑量標(biāo)準(zhǔn)。谷氨酸鹽可能給人帶來(lái)的不良反應(yīng)包括頭疼、血壓增高以及胰島素水平增加等。

據(jù)介紹，歐洲食品安全局提出的這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)還只是一個(gè)建議，將遞交給歐盟委員會(huì)以及歐盟各成員國(guó)負(fù)責(zé)食品監(jiān)管的機(jī)構(gòu)和人士。

谷氨酸是一種氨基酸，西紅柿、醬油以及某些奶酪等食品中存在天然形式的谷氨酸鹽。在食品工業(yè)上，谷氨酸及谷氨酸鹽常被用作食品添加劑，如味精的主要成分是谷氨酸鈉，谷氨酸鈣可以保證食物鮮味的同時(shí)降低含鹽量。

［信息來(lái)源］廈門WTO工作站.歐盟擬設(shè)定谷氨酸鹽食品添加劑限額 [EB/OL].(2017-7-13).http://www.xmtbt-sps.gov.cn/detail.asp?id=54854

Prokaryotic Expression，Purification of Myofibril-Bound Serine Proteinase from Crucian Carp（Carassius auratus） and Preparation of Its Polyclonal Antibody

LI Ting1，2， LI Huan1，2， CHEN Haiying1，2， DU Cuihong*1，2
(1.College ofFood and BiologicalEngineering，JimeiUniversity，Xiamen 361021，China；2.Engineering Research Center for Aquatic Products Processing of Fujian Province，Xiamen，361021，China）

An E.coli expression strain Rosetta （pET-28a-MBSP） of myofibril-bound serine proteinase（MBSP） from crucian carp（Carassius auratus） was constructed.The recombinant MBSP（rMBSP） was expressed and purified in order to prepare its polyclonal antibody，which would lay a foundation for further studies on the MBSP.The MBSP gene was transformed into Rosetta by sub-cloning it into pET-28a vector to construct the strain Rosetta（pET-28a-MBSP）.The recombinant strain was induced to express MBSP by lactose.The recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose affinity column chromatography，MALDI-TOF-MS identification，and then use as theantigen to immune the rabbits to prepare polyclonal antibody.Antibody titer was assayed by ELISA and specificity was detected by western blot.SDS-PAGE，western blot and MALDI-TOF-MS analysis showed that the recombinant protein was the recombinant MBSP （rMBSP）with molecular weight of approximately 28 ×103，which was similar to native MBSP from the skeletal muscle of crucian carp.And the rMBSP was expressed in prokaryotic expression system in mainly inclusion body.The serum with a high titer and specificity was obtained from immunized rabbit.The recombinant MBSP was expressed and purified successfully.The MBSP's polyclonal antibody with a high titer and specificity was obtained by immunization using the purified MBSP.

myofibril-bound serine proteinase，prokaryotic expression，protein purification，western blot，polyclonal antibody

Q 78

A

1673—1689（2017）08—0877—07

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.014

2015-07-03

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010J01212）；廈門市海洋漁業(yè)局項(xiàng)目（14CZP03HJ04）。

*通信作者：杜翠紅（1967—），女，江西臨汾人，理學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail：cuihongdu@jmu.edu.cn

李婷，李歡，陳海英，等.鯽魚MBSP的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體制備[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（08）：877-883.