山茱萸炮制過(guò)程中美拉德反應(yīng)底物的含量變化

楊光明 ， 張玉玲 ， 李 萌 ， 潘 揚(yáng) *， 蔡寶昌

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)研究室，江蘇 南京210023；3.國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)，藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所，江蘇 南京 210023）

山茱萸炮制過(guò)程中美拉德反應(yīng)底物的含量變化

楊光明1，2，3， 張玉玲4， 李 萌4， 潘 揚(yáng)*4， 蔡寶昌1，2，3

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)研究室，江蘇 南京210023；3.國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)，藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所，江蘇 南京 210023）

采用UPLC-MS/MS法檢測(cè)游離氨基酸含量，色譜柱以鍵合相C18硅膠為基質(zhì)，流動(dòng)相為水-乙腈，梯度洗脫，流速0.8 mL/min；采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)定還原糖含量，研究山茱萸炮制過(guò)程中參與美拉德反應(yīng)的底物游離氨基酸和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化規(guī)律。山茱萸中共檢測(cè)出15種游離氨基酸。各游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低；還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在炮制中趨勢(shì)不同于氨基酸，在炮制0～24 h逐漸降低，24～36 h還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所上升，36 h后其質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨于穩(wěn)定。山茱萸中游離氨基酸和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化與炮制中的美拉德反應(yīng)密切相關(guān)，美拉德反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)間與傳統(tǒng)的炮制時(shí)間基本一致，這為炮制終點(diǎn)的判定提供了科學(xué)依據(jù)。

山茱萸；炮制；美拉德反應(yīng)；游離氨基酸；還原糖

美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）[1-2]是一種非酶褐變反應(yīng)，由法國(guó)化學(xué)家Maillard于1912年發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)指的是含游離氨基的化合物和羰基化合物在常溫或加熱時(shí)，初始階段經(jīng)過(guò)羰氨縮合及分子重排，生成一些香味物質(zhì)的前體成分；中間階段前體成分通過(guò)進(jìn)一步脫水，縮合或分解生成呈色呈香類(lèi)物質(zhì)；最終階段主要是一些復(fù)雜高分子色素的形成過(guò)程，最終生成類(lèi)黑精，此階段反應(yīng)復(fù)雜，機(jī)制尚不清楚。中藥富含氨基酸、還原糖等美拉德反應(yīng)底物，因此美拉德反應(yīng)廣泛存在于中藥炮制和制劑的過(guò)程中[3]。有研究者利用還原糖與氨基酸進(jìn)行了模式美拉德反應(yīng)的研究[4-6]。也有對(duì)中藥紅參中美拉德反應(yīng)進(jìn)行研究的報(bào)道[7]。

衛(wèi)生部公布《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》中，對(duì)藥食同源物品、可用于保健食品的物品和保健食品禁用物品做出具體規(guī)定。山茱萸作為常用中藥就列在 “可用于保健食品的物品名單”中。山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉[8]，臨床上多以酒蒸品入藥，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功能。研究表明，山茱萸炮制過(guò)程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)，炮制后其滋陰補(bǔ)腎的功效有所增強(qiáng)。美拉德反應(yīng)的進(jìn)行需要底物氨基酸、還原糖的參與。反應(yīng)進(jìn)行的程度與底物的含量密切相關(guān)。目前已報(bào)道了竹筍、獼猴桃等食品[9-13]和地黃、番荔枝等中藥中氨基酸的測(cè)定[14-16]，以及山楂片、瓜蔞等食品和中藥中還原糖的測(cè)定[17-21]；對(duì)于山茱萸中的氨基酸[22]、多糖也分別有所研究[23-25]，但對(duì)于氨基酸含測(cè)須經(jīng)過(guò)衍生化處理，過(guò)程繁瑣，損耗較大；而還原糖的測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中采用UPLC-MS/MS方法觀察山茱萸炮制過(guò)程中15種游離氨基酸的含量變化，同時(shí)采用

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

JA1103N型電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；202型電熱恒溫箱：上海索普公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速離心機(jī)：無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2401PC紫外檢測(cè)器：日本島津公司產(chǎn)品；Ultimate3000液相色譜儀：美國(guó)戴安公司產(chǎn)品；API 3200 Q-TRAP質(zhì)譜儀：美國(guó)AB公司產(chǎn)品；純水機(jī)：南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

氨基酸檢測(cè)試劑盒，包含15種氨基酸：天門(mén)冬酰胺 （Asn），絲 胺 酸 （Ser），精 氨 酸 （Arg），甘 氨 酸（Gly），天 門(mén)冬 氨酸 （Asp），谷氨 酸（Glu），蘇氨 酸（Thr），脯氨酸（Pro），賴氨酸（Lys），酪氨酸（Tyr），纈氨酸（Val），亮氨酸（Leu），苯丙氨酸（Phe），丙氨酸（Ala）和異亮氨酸 （Ile）（液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀）：北京質(zhì)譜醫(yī)學(xué)研究有限公司產(chǎn)品；乙腈為質(zhì)譜純，其他試劑均為分析純。

山茱萸（生品）由安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所潘揚(yáng)教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc的干燥成熟果肉。

1.2 酒蒸山茱萸樣品的制備

取凈山萸肉，按2010版《中國(guó)藥典》酒蒸法加20%黃酒拌勻、潤(rùn)透，置于蒸鍋中，常壓蒸制，分別于0、2、4、8、12、18、24、36 h 和 48 h 取出，50 ℃干燥，3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)定還原糖含量，從新的角度理解山茱萸的炮制過(guò)程，研究山茱萸炮制中的美拉德反應(yīng)與炮制前后成分變化的關(guān)系，為判定山茱萸的炮制終點(diǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。也為炮制機(jī)理研究提供了新的思路。作為不同炮制時(shí)間的酒蒸山茱萸樣品。

1.3 游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

1.3.1 供試品溶液的制備 稱(chēng)取各酒蒸山茱萸樣品粉末約50 mg，精密稱(chēng)定，加2 mL水充分溶解，4℃靜置過(guò)夜提取。取0.5 mL靜提液14 000 r/min冷凍離心30min，取上清液作為游離氨基酸檢測(cè)標(biāo)本[13]。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：MS Lab HP-C18（150mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水（A）-乙腈（B）梯度洗脫：0～1 min，5%B；1～9 min，5→70%B；9～9.1 min，70% ～100%B；9.1 ～10 min，100%B；10 ～10.1 min，100%～5%B；10.1～15 min，5%B；柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子源：ESI電噴霧離子源，正離子模式；掃描方式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；CUR：20 psi（氣簾氣）；CAD：Medium（碰撞氣）；IS：+5 500 V（噴霧電壓）；TEM：500 ℃（霧化溫度）；GS1：55 psi（霧化氣）；GS2：60 psi （輔助氣）；EP：10 V （射入電壓）；CXP：2.0 V（碰撞室射出電壓）。

1.4 還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

1.4.1 溶液配制 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：精密稱(chēng)取80℃烘至恒重的葡萄糖100 mg，配制成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：將 6.3 g DNS和 262 mL 2 mol/L NaOH（40 g）溶液，加到 500 mL含有182 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1 000 mL，貯存于棕色瓶中備用[17]。

1.4.2 樣品中還原糖的提取 精密稱(chēng)取各酒蒸山茱萸樣品粉末1.0 g，放入100 mL燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，再加入50 mL蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20 min，使還原糖浸出。將浸出液（含沉淀）轉(zhuǎn)移到離心管中，于4 000 r/min離心10 min，沉淀用50 mL蒸餾水洗一次，離心，將兩次離心的上清液合并，定容至100 mL，混勻，作為樣品還原糖待測(cè)液。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取5 mL具塞刻度試管，編號(hào)，分別加入 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 質(zhì)量濃度為 1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、加蒸餾水補(bǔ)至1 mL，再加入DNS試劑2 mL，配制成不同質(zhì)量濃度的葡萄糖反應(yīng)液，混合均勻，置沸水浴反應(yīng)10 min，取出，流水冷卻，定容至40 mL，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.4.4 樣品測(cè)定 另取5 mL具塞刻度試管，分別加入上述提取得到的樣品還原糖待測(cè)液1 mL，加入顯色劑DNS試劑2 mL，按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。測(cè)定各樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的葡萄糖含量，按下式計(jì)算出樣品中還原糖的質(zhì)量百分含量（以葡萄糖計(jì)）。

式（1）中：m1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得葡萄糖的質(zhì)量，mg；V1為提取液總體積，mL；V0為測(cè)定時(shí)取用的體積，mL；m0為樣品的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果

2.1 游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

山茱萸炮制過(guò)程中各氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化見(jiàn)表1、圖1和圖2。共檢測(cè)出山茱萸中15種游離氨基酸，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，各游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及游離氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低。炮制前期的12 h下降速率較快，12～24 h速率較慢，24 h后趨于平穩(wěn)，與本研究前期檢測(cè)的美拉德反應(yīng)理化參數(shù)（酸堿度，褐變程度，5-羥甲基糠醛含量）的變化趨勢(shì)一致[26]。

表1 山茱萸美拉德反應(yīng)進(jìn)程中游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Table 1 Contents of free amino acids in Maillard reaction of fructus corni μg/g

續(xù)表

圖1 山茱萸美拉德反應(yīng)中含量最高的3種游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.1 Three most high contents of free amino acids in Maillard reaction of fructus corni

圖2 山茱萸美拉德反應(yīng)中游離氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.2 Total contents of free amino acids in Maillard reaction of fructus corni

2.2 還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 結(jié)果顯示，以吸光度（A）對(duì)葡萄糖質(zhì)量X（mg）做線性回歸，得到回歸方程：Y=0.850 5X-0.031 1，相關(guān)系數(shù) R=0.999 9，表明線性良好。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)測(cè)定10次，其吸光度平均值為0.483，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.21%，說(shuō)明儀器精確度良好。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品3份，按照1.4.4項(xiàng)下方法進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果RSD為0.63%，表明該實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性良好。

2.2.4 樣品檢測(cè) 結(jié)果如圖3所示，0～24 h，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低，炮制24h時(shí)還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6.61%降低到5.65%。24 h后隨炮制繼續(xù)進(jìn)行，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所上升，36 h后其質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨于穩(wěn)定。

圖3 山茱萸美拉德反應(yīng)中還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.3 Contents of reducing sugars in Maillard reaction of fructus corni

3 討 論

山茱萸富含氨基酸和糖類(lèi)，是美拉德反應(yīng)必不可少的反應(yīng)底物。本研究中采用UPLC-MS/MS法檢測(cè)了炮制前后山茱萸游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并采用經(jīng)典的DNS比色法測(cè)定了還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著山茱萸炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，美拉德反應(yīng)不斷進(jìn)行，在最初的12 h里，作為反應(yīng)底物的游離氨基酸和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，美拉德反應(yīng)速率較快，隨著反應(yīng)進(jìn)行底物被大量消耗，質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨之迅速降低。炮制中期的12～24 h因前期的快速反應(yīng)導(dǎo)致底物含量降低，美拉德反應(yīng)速率變緩，底物繼續(xù)被消耗，質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)降低。炮制24 h時(shí)，總游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低80%以上，部分氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低90%以上，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6.61%降低到5.65%。炮制后期的24～48 h，游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，美拉德反應(yīng)速度很慢，山茱萸炮制體系基本趨于穩(wěn)定，游離氨基酸變化幅度很小。與之不同的是，在山茱萸炮制的24～36 h，還原糖又逐漸增加，推測(cè)是由于另一反應(yīng)底物游離氨基酸在24 h內(nèi)基本消耗結(jié)束，美拉德反應(yīng)達(dá)到平衡，不再消耗還原糖；24 h后隨著炮制的繼續(xù)進(jìn)行，多糖及糖苷類(lèi)成分水解，生成還原糖，使得還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所上升，這一變化趨勢(shì)在炮制36 h后趨于穩(wěn)定。

綜上所述，在山茱萸炮制過(guò)程中，美拉德反應(yīng)消耗了氨基酸和還原糖，反應(yīng)0～24 h游離氨基酸和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，24 h之后質(zhì)量分?jǐn)?shù)穩(wěn)定，提示山茱萸酒蒸24 h后，美拉德反應(yīng)趨于平衡，其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)均比較穩(wěn)定，對(duì)其炮制終點(diǎn)的判定極具參考價(jià)值。

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歐盟發(fā)布果膠等作為食品添加劑的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告

2017年7月6日，歐盟委員會(huì)發(fā)布果膠（E 440i）和酰胺化果膠（E 440ii）作為食品添加劑的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告，食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源（ANS）評(píng)估小組認(rèn)為：

1.兩種果膠不太可能被完整吸收，而是被腸道微生物群發(fā)酵形成與果膠衍生物酸性寡糖（pAOS）相似的物質(zhì)；

2.對(duì)果膠和酰胺化果膠沒(méi)有遺傳毒性的跡象；

3.在人體內(nèi)6周的劑量為36 g/d（相當(dāng)于515 mg/kgbw/d）沒(méi)有不利影響，對(duì)于95%幼兒來(lái)說(shuō)暴露量每天可達(dá)442 mg/kg bw/d。

小組得出結(jié)論：對(duì)于使用兩種果膠作為一般人群的食品添加劑，無(wú)需指定每日攝入量（ADI），對(duì)于所報(bào)道的果膠的使用水平，不存在安全問(wèn)題。

［信息來(lái)源］廈門(mén)WTO工作站.歐盟發(fā)布果膠等作為食品添加劑的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告[EB/OL].(2017-7-10).http://www.xmtbt-sps.gov.cn/detail.asp?id=54815

Content Changes of Substrates of Maillard Reaction during Processing of Fructus Corni

YANG Guangming1，2，3， ZHANG Yuling4， LI Meng4， PAN Yang*4， CAI Baochang1，2，3
（1.Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China；3.Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing ，Nanjing 210023，China；4.Laboratory of Medical Fungi and Phyto-Biotech，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

To study content changes of free amino acids and reducing sugars of Maillard reaction during processing of fructus corni，UPLC/MS/MS was adopted to detect the contents of free amino acids.Chromatographic column of MS Lab HP-C18was used for analysis，with water-acetonitrile asgradient elution mobile phase，and flow rate at 0.8 mL/min.DNS method was used in determination of reducing sugars.Totally 15 kinds of free amino acids were detected in fructus corni.The content of free amino acids reduced gradually with processing time.While the content of reducing sugars changed differently from those of free amino acids，which reduced gradually in 0～24 h，increased slightly in 24～36 h and then became to be stable.The content changes of free amino acids and reducing sugars have close relationship with Maillard reaction during processing of fructus corni.The time of Maillard reaction for fructus corni to reach its equilibrium is in accordance with that of traditional processing，which provides a scientific base for determining processing end.

fructus corni，processing，maillard reaction，free amino acid，reducing sugar

R 284.1

A

1673—1689（2017）08—0884—06

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.015

2015-09-08

江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（12KJA360001）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD），江蘇高校品牌專(zhuān)業(yè)建設(shè)工程一期項(xiàng)目（PPZY2015A068）。

楊光明（1974—），女，江蘇南京人，藥學(xué)博士，副研究員，主要從事中藥炮制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：ygmm0901@hotmail.com

*通信作者：潘 揚(yáng)（1964—），男，江蘇揚(yáng)州人，藥學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥化學(xué)與生物技術(shù)方向研究。E-mail：y.pan2006@163.com

楊光明，張玉玲，李萌，等.山茱萸炮制過(guò)程中美拉德反應(yīng)底物的含量變化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（08）：884-889.