淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療對封閉抗體陰性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)后患者外周血Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子表達(dá)水平變化

史曉艷，陳 銘，石玉玲

1.陜西省榆林市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科(榆林 719000)，2.陜西省榆林市中心血站(榆林 719000)

△通訊作者

淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療對封閉抗體陰性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)后患者外周血Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子表達(dá)水平變化

史曉艷1，陳 銘2△，石玉玲1

1.陜西省榆林市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科(榆林 719000)，2.陜西省榆林市中心血站(榆林 719000)

目的：研究封閉抗體陰性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者發(fā)病機(jī)制及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子水平變化，探討其在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制中的作用及淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者分子機(jī)制。 方法：選取封閉抗體陰性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者50例作為治療組，既往無不良妊娠史，至少一胎正常分娩史的健康育齡女性44例作為對照組。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的封閉抗體，比較封閉抗體陰性與陽性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者妊娠結(jié)局差異性；采用ELISA檢測對照組、治療組治療前及治療后外周血中Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10含量，并比較對照組與治療組，治療組治療前后外周血中Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10含量的差異性。結(jié)論：主動(dòng)免疫療法可下調(diào)RSA患者Th1/Th17細(xì)胞因子IL-2、IL-17表達(dá)水平，上調(diào)Th2細(xì)胞因子IL-4表達(dá)水平，使Th1/Th2/Th17處于平衡模式；同時(shí)刺激免疫應(yīng)答，產(chǎn)生封閉抗體，二者協(xié)同調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17細(xì)胞平衡，增強(qiáng)RSA患者免疫耐受作用，為正常妊娠提供適宜的內(nèi)環(huán)境，從而提高妊娠成功率。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是指與同一配偶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，其中40%～60%的RSA患者病因與免疫有關(guān)，免疫因素中缺乏封閉抗體的RSA患者約占66.67%[1]。目前，臨床上針對缺乏封閉抗體的RSA患者，主要采用淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫(Lymphocyte immunization therapy，LIT)療法提高 RSA患者妊娠成功率。既往研究RSA發(fā)病機(jī)制著重點(diǎn)置于Th1/Th2細(xì)胞平衡上，認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞平衡為正常妊娠提供適宜的免疫環(huán)境，然而近年發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞亞群解釋了許多Th1/Th2細(xì)胞失衡并不能完全解釋的免疫耐受機(jī)制，Th1/Th2/Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子之間相互調(diào)節(jié)，形成精湛而復(fù)雜的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中具有一定的作用。本研究分析健康育齡婦女與封閉抗體陰性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17表達(dá)水平差異性；以及主動(dòng)免疫療法治療RSA患者治療前后外周血中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17細(xì)胞因子表達(dá)水平差異，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

1 一般資料 選自2014年5月至2016年5月就診于我院的RSA患者50例作為治療組，以及同期體檢、既往無不良妊娠史，至少一胎正常分娩史的健康育齡女性44例作為對照組。研究對象均已簽署知情同意書。治療組與對照組平均年齡分別為(30.06±3.41)歲、(29.73±3.07)歲，平均BMI分別為(21.06±2.60)kg/m2，(21.28±2.11)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：治療組自然流產(chǎn)2次及以上，封閉抗體陰性，無子宮畸形、多囊卵巢綜合征等解剖結(jié)構(gòu)異常因素，內(nèi)分泌功能無異常，無HPV、衣原體、支原體、巨細(xì)胞病毒、弓形蟲、梅毒等病原體感染生殖道，抗心磷脂抗體、抗核抗體等自身抗體均陰性，凝血功能無異常等，丈夫精液活動(dòng)度、數(shù)量、活性等質(zhì)量正常、無畸形，無性功能障礙、感染性疾病，夫妻雙方染色體無異常；對照組身體健康，既往無不良妊娠史的育齡女性。

2 主動(dòng)免疫治療 碘伏消毒后，采集患者丈夫或者第三者肘靜脈血至肝素抗凝管，每管5 ml，共30 ml；然后放置37 ℃溫箱3 h使血細(xì)胞自然沉降，形成分層；將血液標(biāo)本放置無菌操作臺(tái)，在無菌環(huán)境下，吸取血漿至含5ml的磷酸氫二鈉緩沖液的15 ml離心管；將稀釋的血漿緩慢加至2個(gè)分別含5 ml淋巴分離液的15ml離心管中，4000 r/min，15 min；使用3 ml的無菌吸管吸取分層液界面處淋巴細(xì)胞層至一個(gè)15 ml離心管內(nèi)，3000 r/min，5 min；棄上清，5 ml磷酸氫二鈉緩沖液洗滌管底淋巴細(xì)胞兩次；利用0.9% NaCl 溶液將其制成淋巴細(xì)胞懸液，并將其稀釋為(20～40)×106/ml，吸取1ml淋巴細(xì)胞懸液，分6個(gè)點(diǎn)注射于患者前臂內(nèi)側(cè)皮下，然后觀察患者30 min方可。

3 標(biāo)本收集 采集主動(dòng)免疫治療前、治療后RSA患者及對照組外周血各4 ml至促凝管，3000 r/min，離心10 min，取上清，并將其分裝至5個(gè)1.5 ml EP管中，凍存在-20 ℃，待檢測樣本時(shí)取出，避免反復(fù)凍融；避免使用溶血、高血脂或污染標(biāo)本。

4 主要試劑與儀器 HLA特異性IgG抗體檢測試劑盒(美國One Lambda公司)、人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物)、IL-2 ELISA試劑盒(達(dá)科為生物)、IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒(廈門慧嘉)、IL-10、IL-17 ELISA試劑盒(北京博凌科為生物)、離心機(jī)(KUBOTA，日本)、恒溫培養(yǎng)箱(上海智城)、酶標(biāo)儀(Bio-Tek ELx800NB，美國伯騰)、酶標(biāo)洗板機(jī)(上海永創(chuàng))、超凈工作臺(tái)(B)等。

5 檢測方法 封閉抗體、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17細(xì)胞因子檢測均采用ELISA法檢測，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行并保證在試劑有效期內(nèi)使用，且保證質(zhì)控符合國家規(guī)定。

6 妊娠結(jié)局判定 妊娠成功：妊娠12周后，B超結(jié)果提示宮內(nèi)活胎，否則為妊娠失敗。

結(jié) 果

1 RSA患者經(jīng)主動(dòng)免疫治療后封閉抗體轉(zhuǎn)陽情況與妊娠結(jié)局 對照組50例封閉抗體均為陰性，經(jīng)過3次主動(dòng)免疫療法治療結(jié)束后，35例患者封閉抗體陽性，陽性率70%。44例復(fù)發(fā)性流程患者妊娠，35例妊娠成功，妊娠成功率79.55%。在44例妊娠對象中，30例封閉抗體陽性患者中妊娠成功27例，妊娠成功率90.0%；14例封閉抗體陰性患者中成功妊娠8例，妊娠成功率為57.14%。封閉抗體陽性與陰性患者之間的妊娠成功率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為封閉抗體陽性的RSA患者妊娠成功率高于封閉抗體陰性患者，見表1。

表1 封閉抗體陽性與陰性RSA患者之間妊娠成功率比較(例)

2 對照組與治療組主動(dòng)免疫療法治療前外周血中Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 對照組中IL-4、IL-10表達(dá)水平顯著高于治療組治療前(P<0.01)；而IFN-γ、IL-2、IL-17表達(dá)水平顯著低于治療組治療前(P<0.01)，見表2。

3 治療組中治療前與治療后外周血中Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 治療組治療后IL-4表達(dá)水平顯著高于治療前(P<0.01)，IL-2、IL-4、IL-17表達(dá)水平顯著低于治療前(P<0.05)；而治療組治療前、后IFN-γ、IL-10表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

表2 對照組與治療組主動(dòng)免疫療法治療前外周血中Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子水平比較(pg/ml)

表3 治療組中主動(dòng)免疫療法治療前與治療后外周Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子水平的比較(pg/ml)

討 論

1 主動(dòng)免疫療法對妊娠結(jié)局的影響 截止目前，文獻(xiàn)報(bào)道，主動(dòng)免疫療法治療封閉抗體陰性的RSA療效為70%～90%[2-3]。本次研究通過主動(dòng)免疫療法療法對封閉抗體陰性RSA患者進(jìn)行治療，封閉抗體陽性率明顯增加，治療組中妊娠成功率明顯提高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相一致，提示通過主動(dòng)免疫療法治療，刺激機(jī)體產(chǎn)生封閉抗體，以致母體形成免疫耐受，降低母體對胎兒的識(shí)別與反應(yīng)能力，使胎兒免受母體免疫系統(tǒng)的攻擊，從而提高妊娠成功率。

2 RSA患者Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子水平變化情況 有報(bào)道顯示，原因不明RSA患者中Th1/Th2免疫平衡紊亂，當(dāng)Th1/Th2失調(diào)后，可稱為“Th1或Th2偏移”，由Th1/Th2細(xì)胞平衡向Th2型漂移狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橄騎h1型漂移，Th1比例增高；此時(shí)，Th1/Th2免疫平衡紊亂就會(huì)影響胚胎生長發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起流產(chǎn)[4]。Th17是CD4+T細(xì)胞近年發(fā)現(xiàn)的新亞群，Th17通過活化細(xì)胞、刺激細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。生理水平的IL-17有利于胚胎著床、胎盤形成，可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡；IL-17比例增高被認(rèn)為對妊娠不利，當(dāng)其表達(dá)過度時(shí)，可引起母體免疫排斥、炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胚胎流產(chǎn)[5]。文獻(xiàn)報(bào)道，Th17細(xì)胞在RSA患者外周血及蛻膜中明顯高于正常妊娠婦女[6-8]。本次研究顯示，封閉抗體陰性的RSA患者外周血中IL-4、IL-10表達(dá)水平降低，而IFN-γ、IL-2、IL-17表達(dá)水平升高。提示封閉抗體患者外周血中Th1/Th2/Th17細(xì)胞平衡模式破壞，Th1、Th17細(xì)胞因子升高、Th2細(xì)胞因子降低時(shí)，可使胎盤受損，引發(fā)流產(chǎn)[9]。

3 淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法對Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子水平變化的影響 研究顯示，主動(dòng)免疫療法可提高Th2細(xì)胞因子比例，降低Th1、Th17細(xì)胞因子比例，并可提高原因不明的RSA患者妊娠成功率[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)主動(dòng)免疫療法治療后，RSA患者外周血中Th1、Th17細(xì)胞因子IL-2、IL-17顯著降低，IFN-γ無明顯變化；Th2型細(xì)胞因子IL-4顯著升高，IL-10無明顯變化。提示IL-2、IL-17、IL-4細(xì)胞因子可能參與RSA的發(fā)病機(jī)制，主動(dòng)免疫療法療法可影響IL-2、IL-17 、IL-4 Th細(xì)胞型細(xì)胞因子的表達(dá)水平；推測主動(dòng)免疫療法對RSA患者中Th2細(xì)胞因子IL-4有上調(diào)作用，Th1、Th17細(xì)胞因子IL-2、IL-17有下調(diào)作用，使Th1/Th2/Th17處于平衡模式；同時(shí)刺激CD4+T細(xì)胞因子進(jìn)行免疫應(yīng)答，同時(shí)產(chǎn)生封閉抗體封閉抗體與主動(dòng)免疫療法協(xié)同調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17細(xì)胞平衡，增強(qiáng)免疫耐受作用，為正常妊娠提供適宜的內(nèi)環(huán)境。

總之，通過本次研究發(fā)現(xiàn)RSA患者外周血中Th1、Th17細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17濃度增高，Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10濃度減低；通過主動(dòng)免疫治療封閉抗體陰性的RSA患者，可刺激RSA患者產(chǎn)生封閉抗體，降低IL-2、IL-17水平，升高IL-4水平；提高患者妊娠成功率；推測對封閉抗體陰性RSA患者采用主動(dòng)免疫療法，可增加RSA患者中Th2細(xì)胞因子，降低Th1、Th17細(xì)胞因子，對Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)平衡模式有促進(jìn)作用；同時(shí)刺激CD4+T細(xì)胞因子進(jìn)行免疫應(yīng)答，產(chǎn)生封閉抗體，其與主動(dòng)免疫療法協(xié)同調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17細(xì)胞平衡，可保護(hù)正常妊娠的順利進(jìn)行。 據(jù)此，檢測外周血中Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子含量，操作方便，可行性強(qiáng)，可提示RSA患者機(jī)體免疫平衡狀態(tài)，考慮作為評估主動(dòng)免疫療法療效的指針，與檢測封閉抗體聯(lián)合起來，共同為RSA患者再次妊娠時(shí)機(jī)提供依據(jù)。

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(收稿：2017-05-23)

淋巴細(xì)胞 免疫，主動(dòng) 抗體，封閉 流產(chǎn)，自然 細(xì)胞因子類

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.036