腸道產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌研究情況

徐劍豪，吳 銳，馬曉杰，張 琳，王若朋，趙英偉*

（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 蘇州 215000）

腸道產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌研究情況

徐劍豪，吳 銳，馬曉杰，張 琳，王若朋，趙英偉*

（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 蘇州 215000）

目的對超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的大腸埃希菌（E.coli）攜帶率、耐藥性及基因型分析。方法 采集糞便標(biāo)本涂種于產(chǎn)色培養(yǎng)基篩查陽性菌，并定期追蹤；選取藥物行K-B法藥敏試驗(yàn)；PCR擴(kuò)增常見基因型，并分析耐藥性差異。結(jié)果 篩查陽性率39%；青霉素類、一代頭孢、氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類對耐藥菌株無效，而單環(huán)類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類、四代頭孢對耐藥菌株抗菌效果佳；基因擴(kuò)增示38份陽性菌中OXA型37株（97.37%）、TEM型37株（97.37%）、CTM-M型30株（78.95%）、SHV型15株（39.47%），且不同基因型在耐藥方面存在差異。結(jié)論 ESBLs陽性E.coli定植及耐藥狀況嚴(yán)峻，OXA與TEM混合型為主。

大腸埃希菌，ESBLs，耐藥性，基因型

ESBLs來源甚廣，但大部分由腸桿菌科產(chǎn)生。此類水解酶，能破壞β-內(nèi)酰胺類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而產(chǎn)生耐藥。目前，有很多產(chǎn)ESBLs E.coli的臨床報(bào)道，但是研究ESBLs陽性 E.coli社區(qū)定植和耐藥性則相對少見。本研究對醫(yī)學(xué)生糞便中ESBLs陽性E.coli攜帶率進(jìn)行動態(tài)分析、研究其基因分型及耐藥性、探索易感因素，為臨床提供防治思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源

2014年7月至2015年1月分批隨機(jī)招募蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床專業(yè)志愿者100名，每人采集一份糞便標(biāo)本。并于2015年5月、2015年12月、2016年4月進(jìn)行了三次跟蹤，每次同樣每人采集一份糞便標(biāo)本。

1.1.2 試劑及儀器

ChromID ESBLs產(chǎn)色培養(yǎng)基（法國生物梅里埃公司）；MH瓊脂；手提式滅菌器；恒溫培養(yǎng)箱；生化鑒定試劑盒；藥敏紙片（杭州微生物有限公司）；Loading Buffer（6×）、TaqDNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP Mix（10 mmol/L）、基因擴(kuò)增引物（TEM、SHV、CTX、OXA四型），引物參考有關(guān)文獻(xiàn)[1]；瓊脂糖；PCR擴(kuò)增儀。

1.1.3 質(zhì)量控制

質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2 方法

1.2.1 ESBLs陽性E.coli篩查及跟蹤

將糞便標(biāo)本接種于ChromID ESBLs產(chǎn)色培養(yǎng)基，35 ℃溫箱培養(yǎng)18 h，篩查ESBLs陽性E.coli。

1.2.2 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)

大腸埃希菌分離與鑒定嚴(yán)格按衛(wèi)生部《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行；藥敏試驗(yàn)采用K-B法，結(jié)果評價(jià)按照NCCLS第七版進(jìn)行。

1.2.3 常見β-內(nèi)酰胺類基因PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增引物：TEM（F：CGCCGCA TACACTA TTCTCAGAA TGA，R：ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT；445 bp）

SHV（F：CTTTATCGGCCCTCACTCAA R：ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT，237 bp）

CTX-M（F：CTTTATCGGCCCTCA CTCAA，R：TGGGTGAAGTAAGTGACCAGAATCAGCGG，593 bp）

OXA（F：ACACAATACATATCAACTTCGC，R：AGTGTGT TTAGAATGGTGATC，814 bp）。煮沸法提取細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：總體積50 μL，引物（20 μmol/L）各1 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，PCR Buffer（Mg2+Free）5 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，模板DNA各1 μL。熱循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min→94℃變性30 s→55℃退火30 s→72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后1次延伸時間為10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 定植情況分析

2.1.1 ESBLs表型篩查

共收集100份糞便標(biāo)本，其中檢出39株ESBLs陽性E.coli，陽性率為39% 。

2.1.2 ESBLs跟蹤實(shí)驗(yàn)

2015年5月第一次陽性群體跟蹤，受訪34人，其中檢出29株ESBLs陽性E.coli，占比85.29% ；2015年12月第二次陽性群體跟蹤，受訪29人，其中檢出17株ESBLs陽性E.coli，占比58.62%；2016年4月第三次陽性群體跟蹤，受訪34人，其中檢出7株ESBLs陽性E.coli，占比20.59%。

2.2 耐藥性分析

39株ESBLs陽性E.coli對青霉素類、一代頭孢均耐藥（阿莫西林、氨芐西林、青霉素G100%耐藥，僅二株對哌拉西林敏感；僅一株對頭孢拉定敏感）；對碳青霉烯類藥物美羅培南普遍敏感（僅一株耐藥）。其余耐藥情況見表1。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.1 常見β-內(nèi)酰胺類基因擴(kuò)增

38株ESBLs陽性E.coliβ-內(nèi)酰胺類基因擴(kuò)增結(jié)果：OXA38株，TEM37株，CTX-M30株，SHV15株。37株E.coli同時攜帶兩種或兩種以上ESBLs基因。

2.3.2 38株ESBLs陽性E.coli基因型及其耐藥情況

3 8株E S B L s陽性E.c o l i基因型情況共分5組：A組（T E M+S H V-O X A+C T X M+）1 7例，B組（TEM+SHV+OXA+CTXM+）13例，C組（TEM+SHVOXA+CTXM-）5例，D組（TEM+SHV+OXA+CTXM-）2例，E組（TEM-SHV-OXA+CTXM-）1例。不同基因型耐藥譜差異：青霉素類（阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、青霉素G）及一代頭孢（頭孢拉定）均耐藥，除E組一株對哌拉西林敏感；對碳青霉烯類藥物美羅培南均敏感；其余耐藥性差異見表2。

表1 39株大腸埃希菌對抗菌藥物的藥敏率（n，%）

表2 不同基因組產(chǎn)ESBLs E.coli的耐藥率(%)

3 討 論

在社區(qū)獲得性感染方面，近年來ESBLs菌株檢出率日益增高，并有向健康人群蔓延的趨勢。本實(shí)驗(yàn)篩查ESBLs陽性E.coli檢出率為39%。查閱同類的社區(qū)研究，許江燕等人2013年在杭州研究結(jié)果顯示，正常人ESBLs陽性E.coli攜帶率為36.25%[2]，兩者結(jié)果相近。然而，福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)生ESBLs陽性E.coli的攜帶率為82.61%[3]。同為臨床醫(yī)學(xué)生，兩地差異如此明顯，提示定植情況或與地域因素相關(guān)。根據(jù)對陽性群體的每6個月一次的跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)ESBLs陽性E.coli定植率逐步下降。提示ESBLs陽性E.coli易受外界環(huán)境干擾，為臨床尋找干預(yù)措施提供依據(jù)。

由表1可見，ESBLs陽性E.coli的耐藥現(xiàn)狀已十分嚴(yán)重。其中，以青霉素類和一代頭孢耐藥率最高，均高于95%；此外，耐藥率＞50.0%的抗菌藥物有頭孢噻肟、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明。因此，臨床使用以上抗菌藥物應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果進(jìn)行選擇。美洛培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星耐藥率均小于10%，因此，治療E.coli所致的感染可以選擇此類藥物治療。因耐藥酶由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過水平轉(zhuǎn)移途徑，其他ESBLs陰性細(xì)菌可獲得耐藥性從而造成危害[4]。另外，編碼質(zhì)粒上可以同時存在其他抗生素的耐藥基因，這就使得ESBLs菌株多藥耐藥[5]。據(jù)報(bào)道，國內(nèi)頭孢噻肟濫用而耐藥率高[6]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

目前，ESBLs已研究出十幾種型別，而TEM、OXA、CTX-M、SHV四種分類占據(jù)主要[7]。研究表明，OXA型的編碼基因一般存在于整合子和/或質(zhì)粒中，有較強(qiáng)傳播性[8]。本研究中OXA型高表達(dá)，可能原因?yàn)樵撔虴SBLs陽性的其他菌株通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式，將耐藥基因傳遞給E.coli。關(guān)于TEM型ESBLs，岳欣等[9]研究報(bào)道淄博市產(chǎn)ESBLs埃希菌株TEM基因型檢出率為60.78%，張霞等[10]研究報(bào)道鄭州產(chǎn)ESBLs菌中TEM型基因檢出率為29.6%，陳楓等[11]研究報(bào)道川南地區(qū)產(chǎn)ESBLs埃希菌株以TEM型為主，檢出率為39.29%，本次研究中TEM基因型在產(chǎn)ESBLs菌中檢出率近100%，大幅高出岳欣[9]、張霞[10]、陳楓[11]等人的研究，提示定基因型分布或與地域因素相關(guān)。CTX-M型ESBL是近10年來倍受關(guān)注的一類ESBL，因其對頭孢噻肟的水解能力高而得名。西班牙的多項(xiàng)研究均提示，超過60%社區(qū)來源的ESBL均為CTX-M型酶[13]。在許江燕等[2]的實(shí)驗(yàn)中，所有ESBLs陽性E.coli均為CTX-M型。本次研究CTX-M基因型檢出率高達(dá)79%（30/38）與情勢相符。關(guān)于SHV型基因，張霞等[10]研究報(bào)道鄭州產(chǎn)ESBLs菌中SHV型基因檢出率為11.1%。陳楓等[11]研究報(bào)道川南地區(qū)產(chǎn)ESBLs埃希菌株SHV型檢出率為21.43%。本次研究CTX-M基因型檢出率亦相較其他基因型偏低，為39%（15/38），提示SHV型目前非流行基因型。

值得一提的是，在本次研究38株ESBLs陽性E.coli中有37株細(xì)菌同時攜帶多種ESBLs基因，其中絕大多數(shù)為OXA、TEM、CTX-M三型混合以及OXA、TEM、CTX-M、SHV基因四型混合，分別占比44.74%及34.21%，提示我校大學(xué)生ESBLs陽性E.coli的交叉流行情況，應(yīng)重視ESBLs陽性E.coli攜帶多種基因型的情況，并給以一定的隔離與防護(hù)措施。

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B

ISSN.2095-8242.2017.39.7577.03

趙英偉