絞股藍總皂苷調(diào)控CLIC1抑制巨噬細胞脂質(zhì)累積的作用研究

宗磊 任廣巖 胡瀟 郝正亮 王萃 祝驥 楊貞 盧德趙

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

絞股藍總皂苷調(diào)控CLIC1抑制巨噬細胞脂質(zhì)累積的作用研究

宗磊 任廣巖 胡瀟 郝正亮 王萃 祝驥 楊貞 盧德趙

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

[目的]研究絞股藍總皂苷（gypenosides，GPs）對RAW264.7細胞脂質(zhì)累積及細胞內(nèi)氯離子通道蛋白1（chloride intracellular channel 1，CLIC1）表達的影響，探討GPs抗動脈粥樣硬化的分子機制。[方法]將RAW264.7細胞接種于六孔板中，分為NC組、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）組、GPs 10組、GPs 50組、GPs 100組及CLIC1 siRNA組。各組細胞處理24h后，油紅O染色檢測各組細胞內(nèi)脂質(zhì)的累積，化學(xué)法檢測細胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）及游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）的含量，熒光定量PCR和免疫印跡法檢測CLIC1、CD36 mRNA和蛋白質(zhì)的表達，免疫熒光技術(shù)觀察CLIC1的細胞定位，并用MQAE法檢測細胞內(nèi)氯離子濃度的變化。[結(jié)果]與NC組相比，ox-LDL組CLIC1、CD36 mRNA（P＜0.01，P＜0.001）及蛋白（P＜0.01，P＜0.001）表達水平顯著升高，細胞內(nèi)TC（P＜0.001）、FC（P＜0.01）顯著升高，細胞膜上CLIC1表達顯著升高，細胞內(nèi)氯離子濃度顯著增加（P＜0.01）；經(jīng)CLIC1 siRNA或GPs處理后，細胞內(nèi)TC（P＜0.001，P＜0.001）、FC（P＜0.01，P＜0.01）含量降低，脂質(zhì)累積減少，CLIC1、CD36 mRNA及蛋白表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01，P＜0.001）。[結(jié)論]CLIC1在巨噬細胞脂質(zhì)累積中發(fā)揮著重要的作用，GPs可以通過調(diào)控CLIC1的表達抑制巨噬細胞脂質(zhì)累積。

GPs；CLIC1；巨噬細胞；總膽固醇；游離膽固醇；CD36 mRNA；脂質(zhì)累積；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，巨噬細胞攝取過多的脂質(zhì)而形成泡沫細胞是AS發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)和典型病理特征。凋亡的泡沫細胞不斷堆積可以形成動脈壁脂肪條紋[1-2]。因而，抑制巨噬細胞脂質(zhì)累積是抗AS研究的重要方向[3]。絞股藍總皂苷（gypenosides，GPs）是絞股藍最主要的生物活性成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化的作用，能夠有效地保護心腦血管和肝臟[4-6]?，F(xiàn)有研究證實，GPs能夠明顯降低AS動物血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol， TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平，提高高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平[7-8]。在THP-1巨噬細胞中，GPs能降低細胞內(nèi)脂質(zhì)的累積，抑制泡沫細胞的形成[9]，但其機制尚未明確。

細胞內(nèi)氯離子通道蛋白1（chloride intracellular channel 1，CLIC1）是一種含241個氨基酸的蛋白質(zhì)[10]，廣泛分布于哺乳動物的組織和亞細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)，參與了許多重要的生理過程，如細胞容量的調(diào)節(jié)、細胞器的酸化、細胞容積的穩(wěn)定、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的物質(zhì)運輸、細胞的增殖及分化[11]。CLIC1通常以可溶的形式存在于細胞質(zhì)及核漿內(nèi)，在細胞氧化作用下其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，插入脂膜充當(dāng)氯離子選擇性通道[12-13]。已有研究表明，CLIC1在巨噬細胞細胞膜上的轉(zhuǎn)移能夠提高巨噬細胞的吞噬功能[14]。

因此，本研究以RAW264.7巨噬細胞為研究對象，以氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）誘導(dǎo)巨噬細胞脂質(zhì)累積，觀察CLIC1在巨噬細胞脂質(zhì)累積中的作用及GPs的調(diào)控機制。

1 材料

1.1 細胞及主要試劑 RAW264.7細胞株購于中國科學(xué)院上海細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)液購于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號：2017022705；胎牛血清購于杭州四季青生物制品公司，批號：150208；油紅O粉劑購于美國Sigma公司，批號：SLBH0251V；GPs購自大連美侖生物技術(shù)有限公司（UV≥98%），批號：J0423AS；總膽固醇檢測試劑盒及游離膽固醇試劑盒購自北京普利萊生物科技有限公司，批號分別為：SJ-E1015、SJE1016；健康人血清購于浙江省血液中心；CLIC1鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，批號：L0815；CD36兔單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：I8836-1-AP；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG購自北京康為世紀(jì)生物有限公司，批號分別為：30147、10146、10146；氯離子熒光探針N-乙氧羰基甲基-6-甲氧基溴化喹啉（MQAE）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：0803171509；丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號：20151223。

1.2 主要儀器 CP80MX超速離心機，日本HITACHI公司；SpectraMax190酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；3111 CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；PowerPacTMHCBIO-RAD電泳儀，美國Bio-Rad公司；5427R低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；Stepone plus熒光定量PCR儀，美國 ABI公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機，寧波新芝科器研究所；DMI8熒光顯微鏡，德國Leica公司。

2 方法

2.1 ox-LDL的制備 取健康人血漿200mL，利用序列超速離心法分離脂蛋白，取密度為1.019～1.063g·L-1的部分，經(jīng) Saphrose 6B凝膠柱層析后得到純化的低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）。純化后的 LDL，加入10μmol·L-1CuSO4氧化24h，而后加入10μmol·L-1的EDTA-2Na終止氧化。取少量氧化樣品，用MDA試劑盒測定LDL氧化程度。于含0.2% EDTA-2Na的PBS中透析除去 Cu2+，濃縮后即得ox-LDL，再經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，BCA法測定濃度后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組 RAW264.7細胞置于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每隔2～3d傳代1次。將置于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中的對數(shù)生長期RAW264.7細胞消化，計數(shù)，每孔2×105個細胞接種于六孔板中，分為NC組（正常培養(yǎng)的RAW264.7細胞）、ox-LDL組（50μg·mL-1ox-LDL孵育RAW264.7細胞24h）、GPs 10組（10μg·mL-1GPs+50μg·mL-1ox-LDL共同孵育RAW264.7細胞24h）、GPs 50組（50 μg·mL-1GPs+50μg·mL-1ox-LDL共同孵育RAW264.7細胞24h）、GPs 100組（100μg·mL-1GPs+50μg·mL-1ox-LDL共同孵育RAW264.7細胞24h）和CLIC1 siRNA組（RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染CLIC1 siRNA 12h后，50μg· mL-1ox-LDL孵育24h），再進行后續(xù)實驗。

2.3 細胞內(nèi)TC及FC含量測定 細胞處理結(jié)束后，4°C、2 000r/min離心5min，收集各組細胞，以PBS沖洗3次，按照每106個細胞中加入0.1mL細胞裂解液的比例，在各組中加入細胞裂解液，離心后取上清液測定各組細胞內(nèi)TC和FC的含量并用BCA法測定上清液的蛋白濃度，以每mg蛋白濃度校正TC、FC的含量。膽固醇酯與TC比值 [（CE%）]＝（TC-FC）/TC× 100%。具體操作按膽固醇檢測試劑盒說明書進行。

2.4 油紅O染色 細胞處理結(jié)束后，棄去各組培養(yǎng)液，以PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，再以PBS洗3次后加入油紅O染液染色30min，最后用60%異丙醇洗1次，倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

2.5 熒光定量PCR檢測CLIC1、CD36 mRNA的表達 按Trizol試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，并按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增。引物序列如表1所示。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃ 15s，60℃ 60s，40個循環(huán)。調(diào)整基線和閾值讀出各孔的循環(huán)數(shù)（Ct）。利用比較Ct法檢測各樣本CLIC1、CD36 mRNA的表達情況。倍增變化率＝2-△△Ct(△△Ct＝目的基因△Ct－內(nèi)參基因△Ct）。

2.6 免疫印跡法檢測泡沫細胞內(nèi)CLIC1、CD36蛋白表達 細胞處理結(jié)束后，PBS洗3次，每孔加100 μL RIPA裂解液（含1μL PMSF），用刮刀將細胞刮下。轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，冰上裂解30min，4℃、12 000r/ min離心10min，取上清液。BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗孵育2h，洗膜，化學(xué)顯影，分析各條帶灰度值。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.7 免疫熒光觀察CLIC1的細胞膜定位 將細胞接種于24×24mm蓋玻片上，每片接種2×105個細胞。細胞處理完畢后，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15min，羊血清工作液37℃孵育60min。用PBS按說明書的比例稀釋一抗，滴到細胞爬片表面，倒扣，37℃孵育2h，PBS洗3次，加入PBS稀釋的二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗3次，DAPI染核15min，甘油封片，熒光顯微鏡下拍照觀察。

2.8 MQAE檢測細胞內(nèi)氯離子濃度 將細胞接種于六孔板中，每孔2×105個細胞。細胞處理完畢后，顯微鏡下計數(shù)，各組取相同的細胞數(shù)，離心，在含有5mmol·L-1MQAE的Krebs-HEPES緩沖液中37℃避光孵育1h，隨后用Krebs-HEPES緩沖液洗滌5次，進行熒光測定，并在熒光顯微鏡下拍照觀察。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.0進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗，大于兩組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 GPs對RAW264.7細胞內(nèi)TC、FC含量的影響與NC組相比，50μg·mL-1ox-LDL處理RAW264.7細胞24h后，細胞內(nèi)TC與FC含量明顯增加（P＜0.001，P＜0.01），CE（%）達到60%以上（P＜0.01），說明ox-LDL可以誘導(dǎo)巨噬細胞脂質(zhì)累積，并轉(zhuǎn)化成泡沫細胞。與ox-LDL組 比較，50、100μg·mL-1GPs聯(lián) 合 處 理RAW264.7細胞后，細胞內(nèi)TC含量（P＜0.01，P＜0.001）和CE（%）（P＜0.05，P＜0.01）均下降，說明GPs可以降低巨噬細胞脂質(zhì)含量，抑制泡沫細胞形成。而CLIC1 siRNA抑制CLIC1表達后，巨噬細胞內(nèi)TC（P＜0.001）、FC（P＜0.05）含量和CE（%）（P＜0.01）也下調(diào)，說明CLIC1表達參與了巨噬細胞脂質(zhì)的積累。見表2。

表2 GPs對細胞內(nèi)TC、FC的影響（±s,n=3）Tab.2 Effect of GPs on TC and FC in cells(±s,n=3)

表2 GPs對細胞內(nèi)TC、FC的影響（±s,n=3）Tab.2 Effect of GPs on TC and FC in cells(±s,n=3)

注：與NC組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與ox-LDL組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。Note:Compared with NC group,**P＜0.01,***P＜0.001;compared with ox-LDL group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.

組別 T C（μ m o l · g -1） F C（μ m o l · g -1） C E（%）N C組o x -L D L組G P s 1 0組G P s 5 0組G P s 1 0 0組C L I C 1 s i R N A組2 0 . 2 7 ± 1 . 3 1 8 1 . 6 0 ± 3 . 6 8 *** 7 2 . 0 4 ± 3 . 0 8 5 6 . 9 5 ± 1 . 8 9 ## 3 8 . 6 5 ± 2 . 6 5 ### 3 2 . 1 5 ± 2 . 4 5 ### 1 3 . 9 6 ± 0 . 9 2 2 6 . 5 5 ± 2 . 0 9 ** 2 5 . 3 0 ± 0 . 8 3 2 4 . 8 9 ± 0 . 8 0 1 9 . 3 7 ± 0 . 9 1 # 1 8 . 7 2 ± 0 . 8 0 # 3 0 . 6 9 ± 5 . 6 0 6 7 . 2 0 ± 3 . 4 8 ** 6 4 . 6 6 ± 2 . 6 2 5 5 . 5 0 ± 1 . 4 9 # 4 7 . 8 7 ± 2 . 2 2 ## 4 1 . 4 1 ± 2 . 6 5 ##

3.2 GPs對RAW264.7細胞脂質(zhì)累積的影響 如圖1所示，與NC組比較，ox-LDL作用RAW264.7細胞24h后，細胞內(nèi)形成明顯的脂滴。與ox-LDL組比較，不同濃度的GPs處理組的細胞內(nèi)脂質(zhì)累積減少，并具有一定的劑量效應(yīng)依賴關(guān)系，說明GPs可以減少RAW264.7細胞脂質(zhì)累積。此外，CLIC1 siRNA抑制CLIC1表達后，ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中脂質(zhì)累積也明顯減少，說明CLIC1可能是調(diào)控巨噬細胞脂質(zhì)累積的一個重要靶點。

圖1 GPs對RAW264.7細胞脂質(zhì)累積的影響（油紅O染色，400×，標(biāo)尺50 μm）Fig.1 Effect of GPs on lipid accumulation in RAW264.7 cells(Oil red O stain,400×,bar 50 μm)

3.3 GPs對CLIC1、CD36 mRNA表達的影響 如表3所示，ox-LDL誘導(dǎo)后，RAW264.7細胞內(nèi)CLIC1（P＜0.01）、CD36（P＜0.001）mRNA的表達顯著升高；100 μg·mL-1GPs或CLIC1 siRNA處理后，ox-LDL誘導(dǎo)的細胞內(nèi)CLIC1（P＜0.01，P＜0.001）和CD36（P＜0.001，P＜0.001）mRNA表達量顯著下降。說明CLIC1的干預(yù)可以抑制CD36的表達，從而減少ox-LDL的攝入，而GPs可以通過調(diào)節(jié)CLIC1和CD36的表達，進而調(diào)控巨噬細胞脂質(zhì)累積，從而延緩AS的進程。

表3 GPs對CLIC1、CD36 mRNA表達的影響Tab.3 Effects of GPs on expression of CLIC1 and CD36 mRNA

3.4 GPs對CLIC1和CD36蛋白表達的影響 免疫印跡法檢測結(jié)果表明：ox-LDL可上調(diào)RAW264.7細胞內(nèi)CLIC1（P＜0.01）和CD36（P＜0.001）蛋白表達，而100 μg· mL-1GPs或CLIC1 siRNA可顯著降低細胞內(nèi)CLIC1（P＜0.001，P＜0.001）和CD36（P＜0.01，P＜0.01）蛋白表達，此結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果一致。見圖2。

3.5 GPs對CLIC1細胞定位的影響 50μg·mL-1ox-LDL處理RAW264.7細胞24h后，細胞膜上CLIC1表達顯著升高，說明ox-LDL可以促進CLIC1的膜轉(zhuǎn)位。與ox-LDL組比較，CLIC1 siRNA抑制CLIC1表達后，細胞膜上CLIC1表達顯著降低。此外，50 μg· mL-1ox-LDL與 50、100 μg·mL-1GPs聯(lián)合處理RAW264.7細胞后，CLIC1在細胞膜上的表達顯著降低，說明GPs可以調(diào)控CLIC1的膜轉(zhuǎn)位，抑制氯離子通道的形成。見圖3。

3.6 GPs對細胞氯離子濃度的影響 50μg·mL-1ox-LDL處理RAW264.7細胞24h后，細胞內(nèi)氯離子濃度顯著升高（P＜0.01）。CLIC1 siRNA抑制CLIC1表達后，氯離子濃度顯著降低（P＜0.01）。與ox-LDL組比較，50、100 μg·mL-1GPs與ox-LDL聯(lián)合處理后，氯離子濃度顯著降低（P＜0.01，P＜0.01），說明GPs可以降低氯離子濃度。見圖4。

圖2 GPs對CLIC1、CD36蛋白表達的影響Fig.2 Effect of GPs on expression of CLIC1 and CD36 protein

圖3 GPs對CLIC1的表達及細胞定位的影響（200×，標(biāo)尺100 μm）Fig.3 Effect of GPs on the expression and localization of CLIC1(200×,bar 100 μm)

4 討論

絞股藍是葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍的根狀莖或全草，有千年藥用歷史，享有“南方人參”美譽[15]。其味甘苦、性寒，有清熱解毒、化痰止咳、益氣健脾之功效[16]。GPs是絞股藍最主要的生物活性成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗AS的作用，能夠有效地保護心腦血管和肝臟。體內(nèi)研究表明，GPs能降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，提高HDL-C水平[8]，同時降低AS大鼠細胞間黏附因子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）、MDA、LDL及主動脈壁的細胞核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）水平，從而發(fā)揮抗AS的作用[17]，但GPs抗AS的具體分子機制尚不清楚。

圖4 GPs對細胞內(nèi)氯離子濃度的影響（200×，標(biāo)尺100 μm）Fig.4 Effect of GPs on intracellular Cl-concentration(200×,bar 100 μm)

AS的發(fā)病機制復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)累積及細胞增殖等緊密相關(guān)[3,18]。已有研究證實，脂質(zhì)在巨噬細胞中累積形成泡沫細胞的過程是AS發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。巨噬細胞通過其表面的清道夫受體CD36攝取ox-LDL形成泡沫細胞，凋亡的泡沫細胞不斷堆積，形成動脈壁脂肪條紋[1-2]。因此，抑制脂質(zhì)的累積，減少泡沫細胞的形成，是減緩AS進程的重要舉措。體外細胞實驗表明，GPs能夠降低巨噬細胞中CD36基因的表達，降低細胞內(nèi)脂質(zhì)累積，抑制泡沫細胞的形成[9]。在本研究中，GPs處理ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細胞后，CD36基因及蛋白水平表達降低，細胞內(nèi)TC、FC含量降低，細胞內(nèi)脂質(zhì)累積減少，說明GPs可以抑制巨噬細胞脂質(zhì)累積，這與前人的研究結(jié)果是一致的。

另外，現(xiàn)有的研究表明AS形成與紊亂的跨膜離子的運動如Ca2+、K+等密切相關(guān)[19-20]，離子通道在離子的跨膜運動中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。而在巨噬細胞攝取ox-LDL的過程中，離子通道是否發(fā)揮作用，目前尚不清楚。CLIC1作為細胞內(nèi)氯離子通道（chloride intracellular channel，CLIC）家族的一員，廣泛分布于哺乳動物的組織和亞細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)，參與了許多重要的生理過程如細胞容量的調(diào)節(jié)、細胞器的酸化、細胞容積穩(wěn)定、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的物質(zhì)運輸、細胞的增殖及分化。并且，CLIC1最早從激活的巨噬細胞中克隆成功，其表達與亞細胞定位與巨噬細胞的吞噬功能密切相關(guān)。已有研究表明，CLIC1的膜轉(zhuǎn)移能促進巨噬細胞的吞噬體酸化，提高巨噬細胞的吞噬功能[14]。同時，在氧化物的刺激下，以可溶形式存在于細胞質(zhì)和核漿內(nèi)的CLIC1，可以發(fā)生改變并插入脂膜充當(dāng)氯離子選擇性通道。既然CLIC1與巨噬細胞吞噬作用有關(guān)，而脂質(zhì)累積又是通過巨噬細胞的吞噬作用進入到細胞內(nèi)的，那么抑制CLIC1的表達，則有可能抑制巨噬細胞的吞噬作用，進而抑制脂質(zhì)的累積。而在此過程中，細胞內(nèi)的氯離子濃度是否發(fā)生改變，目前尚不清楚。因而，本研究采用MQAE法檢測細胞內(nèi)氯離子的濃度，MQAE作為使用最廣泛的一種新型氯離子熒光探針，它以溴離子為配對陰離子，當(dāng)氯離子濃度升高時，可置換出溴離子。因此，MQAE的熒光強度隨著氯離子濃度的增加而成比例地減少。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能提高巨噬細胞細胞內(nèi)氯離子濃度，用CLIC1 siRNA或者不同濃度的GPs處理后，可以降低細胞內(nèi)氯離子濃度，說明細胞內(nèi)氯離子濃度的變化可能會與CLIC1膜轉(zhuǎn)移有關(guān)，而GPs可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氯離子濃度進而調(diào)節(jié)CLIC1，從而影響巨噬細胞對脂質(zhì)的吞噬。

本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細胞后，CLIC1的mRNA及蛋白水平表達顯著升高，且在細胞膜上的表達升高，說明在ox-LDL作用下，CLIC1呈現(xiàn)過表達，并且向細胞膜上轉(zhuǎn)移，從而說明巨噬細胞吞噬ox-LDL的過程伴隨著CLIC1的高表達，證明二者存在著某些關(guān)聯(lián)；而CLIC1 siRNA干擾后，CD36的表達顯著降低，細胞內(nèi)TC、FC含量顯著降低，說明CLIC1在巨噬細胞的脂質(zhì)累積中發(fā)揮著重要的作用，抑制CLIC1可以降低CD36的表達，從而降低ox-LDL的攝入。不同濃度的GPs作用后，CLIC1、CD36的表達呈現(xiàn)下降的趨勢，細胞內(nèi)TC、FC含量顯著降低，脂質(zhì)累積減少。說明GPs可能通過調(diào)控CLIC1的表達，進而調(diào)控清道夫受體CD36的水平，從而抑制巨噬細胞對ox-LDL的吞噬。

綜上所述，CLIC1在巨噬細胞的脂質(zhì)累積中發(fā)揮著重要的作用，抑制CLIC1的表達可以降低巨噬細胞攝入ox-LDL。而GPs則能調(diào)控CLIC1的表達，抑制巨噬細胞脂質(zhì)累積，延緩AS的進程，但其具體機制還需要進一步的探究。

[1] Antonino T,Domenico D R,Rosaria P,et al.Atherosclerosis as an Inflammatory Disease[J].Curr Pharm Des,2012, 18(28):4266-4288.

[2] 劉俊田.動脈粥樣硬化發(fā)病的炎癥機制的研究進展[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2015,36(2):141-152. LIU Juntian.Progressin inflammatory pathogenesisof atherosclerosis[J].Journal of Xi’an Jiaotong University(Medical Sciences),2015,36(2):141-152.

[3] 劉承,李家富,馮健,等.姜黃素對ox-LDL誘導(dǎo)的人單核巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響及機制[J].中藥新藥與臨床藥理,2016,27(3):385-392. LIU Cheng,LI Jiafu,FENG Jian,et al.Effect and related mechanism of curcumin on THP-1 cells formed foam cells induced by ox-LDL[J].Traditional Chinese Drug Research&Clinical Pharmacology,2016,27(3):385-392.

[4] 李露,范紅艷,戴婷,等.絞股藍總皂苷的藥理作用研究進展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報,2015,36(2):147-150. LI Lu,FAN Hongyan,DAI Ting,et al.Advances in pharmacological effects of Gypenosides[J].Journal of Jilin Medical College,2015,36(2):147-150.

[5] Lu K W,Chen J C,Lai T Y,et al.Gypenosides causes DNA damageand inhibitsexpression ofDNA repair genes of human oral cancer SAS cells[J].In Vivo,2010, 24(3):287-292.

[6] He Q,Li J K,Li F,et al.Mechanism of action of gypenosides on type 2 diabetes and non-alcoholic fatty liver disease in rats[J].World J Gastroenterol,2015,21(7): 2058-2066.

[7] Yang Y H,Yang J,Jiang Q H.Hypolipidemic effect of gypenosides in experimentally induced hypercholesterolemic rats[J].Lipids Health Dis,2013,12(1):1-6.

[8] 吳柳松,錢民章.絞股藍總苷對PCSK9基因表達及辛伐他汀降血脂作用的影響[J].中國病理生理雜志,2017,33(1): 79-85. WU Liusong,QIAN Minzhang.Effects of gypenosides on PCSK9 gene expression and blood lipids lowered by simvastatin[J].Chinese Journal of Pathophysiology,2017,33(1): 79-85.

[9] 壽迪飛,盧德趙,王萍兒,等.絞股藍總皂苷調(diào)節(jié)THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇平衡的作用機制[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,35(2):297-300. SHOU Difei,LU Dezhao,WANG Ping’er,et al.The mechanism of gypenosides regulate cholesterol homeostasis in foam cells[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2011,35(2):297-300.

[10]Averaimo S,Milton R H,Duchen M R,et al.Chloride intracellular channel 1(CLIC1):Sensor and effector during oxidative stress[J].Febs Letters,2010,584(10):2076-2084.

[11]Rahman A,Kumar S G,Kim S W,et al.Proteomic analysisfor inhibitory effect of chitosanoligo saccharides on 3T3-LIadipocyte differentiation [J].Proteomics,2008,8(3): 569-581.

[12]Littler D R,Harrop S J,Fairlie W D,et al.The intracellular chloride ion channel protein CLIC1 undergoes a redox-controlled structural transition[J].J Biol Chem,2004, 279(10):9298-9305.

[13]Singh H,Ashley R H.Redox regulation of CLIC1 by cysteine residues associated with the putative channel pore[J].Biophys J,2006,90(5):1628-1638.

[14]Jiang L L,Salao K,Li H,et al.Intracellular chloride channelprotein CLIC1 regulates macrophage function through modulation of phagosomal acidification[J].J Cell Sci, 2012,125(Pt 22):5479-5488.

[15]張濤,袁弟順.絞股藍的功效成分與絞股藍皂甙研究進展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,20(9):60-63. ZHANG Tao,YUAN Dishun.Effectivecomponentsof Gynostemma pentaphyllum and research advances in gypenosides[J].Acta Agriculturae Jiangxi,2008,20(9):60-63.

[16]李時珍.本草綱目[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1985:1326. LI Shizhen.Compendium of Materia Medica[M].Beijing: People's Medical Publishing House,1985:1326.

[17]權(quán)媛,錢民章.絞股藍總甙對高脂誘導(dǎo)動脈粥樣硬化大鼠炎性分子表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,30(4): 403-406. QUAN Yuan,QIAN Minzhang.Effect and mechanism of gypenosides on the inflammatory molecular expression in high-fat induced atherosclerosis rats[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2010,30(4): 403-406.

[18]Zhao J F,Ching L C,Huang Y C,et al.Molecular mechanism of curcumin on the suppression of cholesterol accumulation in macrophage foam cells and atherosclerosis [J].Mol Nutr Food Res,2012,56(5):691-701.

[19]Toyama K,WulffH,Chandy K G,etal.The intermediate -conductance calcium -activated potassium channel KCa3.1 contributes to atherogenesis in mice and humans[J].J Clin Invest,2008,118(9):3025-3037.

[20]Sobey C G.Potassium channelfunction in vascular disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21(1):28-38.

Effect of Gypenosides Inhibiting the Accumulation of Lipid in Macrophage by Regulating CLIC1

ZONG Lei,REN Guangyan,HU Xiao,et alCollege of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To study the effect of gypenosides(GPs)on the accumulation of lipid in RAW264.7 cells and the expression of intracellular chloride channel 1(CLIC1),and investigate the molecular mechanism of anti-atherosclerosis of GPs.[Methods]RAW264.7 cells were inoculated into 6-well plates and divided into NC group,ox-LDL group,GPs 10 group,GPs 50 group,GPs 100 group and CLIC1 siRNA group.After each group had been processed, the accumulation of lipid was detected by oil red O,the total cholesterol(TC)and free cholesterol(FC)in cells were measured by chemical method,the expression of CLIC1 and CD36 were measured with the technologies of qPCR and immunoblotting.Furthermore,immunofluorescence technique was used to observe the localization of CLIC1 and the method of MQAE was used to detect the change of chloride ion concentration.[Results]Compared with the NC group,CLIC1 and CD36 were significantly increased at the mRNA level(P＜0.01,P＜0.001)and protein level(P＜0.01,P＜0.001),the intracellular TC(P＜0.001)and FC(P＜0.01)were significantly increased,the CLIC1 expression on the cell membrane and the concentration of chloride ion were significantly increased(P＜0.01)in the ox-LDL group;however,after treated with CLIC1 siRNA and different concentrations of GPs,intracellular TC(P＜0.001,P＜0.001),FC(P＜0.01,P＜0.01)content and lipid accumulation were decreased,CLIC1 and CD36 expression at the mRNA level and protein level were significantly reduced(P＜0.01，P＜0.001). [Conclusion]CLIC1 plays an important role in lipid accumulation of macrophage.GPs can inhibit accumulation of lipid by regulating CLIC1,and retard the progress of atherosclerosis.

gypenosides;CLIC1;macrophages;total cholesterol;free cholesterol;CD36 mRNA;lipid accumulation;atherosclerosis

R282 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5509（2017）10-0777-07

10.16466/j.issn1005-5509.2017.10.001

國家自然科學(xué)基金（81403133）；浙江省自然科學(xué)基金（LQ14H280004，LY15H280005）

Fund projects：National Natural Science Foundation of China(81403133);Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(LQ14H280004,LY15H280005)

盧德趙，E-mail:ludezhao＠126.com

2017-06-15）