UHPLC法測定柴黃片中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量探討

河南省駐馬店市食品藥品檢驗所（463000）趙曉麗

柴黃片主要由兩味中草藥制備而成，分別為柴胡和黃芩，屬于中成藥制劑，患者服用后能夠發(fā)揮解表清熱的效果，在風(fēng)熱型感冒癥狀中具有良好的用途[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，柴黃片中有效成分抗炎、抗菌效果明顯。現(xiàn)階段，柴黃片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)能夠?qū)S芩的成分黃芩苷進(jìn)行測定，但是無法對柴胡皂苷類成分進(jìn)行科學(xué)控制。這種情況下，會給柴黃片的用藥安全帶來一定影響[2]。為此，對柴黃片中柴胡皂苷類成分進(jìn)行準(zhǔn)確測定，具有積極意義。本研究主要采用UHPLC法對柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量進(jìn)行測定，為進(jìn)一步完善柴黃片質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與測量方法

1.1 測量儀器與試藥 采用高效液相色譜儀（型號為Agi1260），配置DAD檢測器，將二異丁基-十八烷基鍵合硅膠色譜柱作為主要填料。電子天平、超聲波清洗儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器及超純水機；選取陜西盤龍制藥公司提供的柴黃片，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d由特定渠道分離制備，通過UHPLC法測定，純度＞98%，其他試劑均為分析純，如甲醇、超純水等。

1.2 溶液配制 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d（干燥至恒重）、黃芩苷對照品，其中黃岑苷對照品劑量為11.5mg，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分別為12mg。將上述制品放置在容量瓶中（25mL），添加濃度為50%的甲醇溶解劑，并將其稀釋到刻度。將柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分別配制為0.50mg/mL、0.48mg/mL的對照品溶液。采用0.45μm微孔濾膜過濾處理，并放置在零下4℃環(huán)境中冷藏，以作備用。

1.3 液相色譜條件 ①柴胡皂苷a：采用Hypersil C18色譜柱法（4.6×250m，5μm），以乙腈磷酸水溶液作為流動相（A）-0.01%；磷酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～30min，30%A～60%A），科學(xué)設(shè)定梯度洗脫值，控制流速（1mL/min），檢驗波長控制在254nm，柱溫則為35℃，運行時間35min，進(jìn)樣量10μL。②柴胡皂苷d：用Hypersil C18色譜柱法（4.6×250m，5μm），以乙腈磷酸水溶液作為流動相（A）-0.01%；磷酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～30min，30%A～60%A），科學(xué)設(shè)定梯度洗脫值，控制流速（1mL/min），檢驗波長控制在210nm，柱溫則為30℃，運行時間35min，進(jìn)樣量10μL。③黃岑苷色譜條件：采用Hypersil C18色譜柱法（4.6×250m，5μm），以甲醇作為流動相，0.2%磷酸溶液（45∶55，V/V），科學(xué)設(shè)定梯度洗脫值，控制流速（1mL/min），檢驗波長控制在278nm，柱溫則為35℃，運行時間35min，進(jìn)樣量10μL。

1.4 樣品處理 柴胡皂苷制備：柴胡皂苷a和柴胡皂苷d供試品的制備方法，分別取3批柴黃片，并采用0.45μm微孔濾膜進(jìn)行過濾及相應(yīng)處理，所得柴胡皂苷a供試品和柴胡皂苷d供試品。分別取3批1mg柴黃片于5個100mL容量瓶中，采用流動相進(jìn)行稀釋，至刻度后充分混合均勻。嚴(yán)格根據(jù)處方要求，制備陰性對照品，此對照品中不含有柴胡。與此同時，按照柴胡皂苷a和柴胡皂苷d供試品，制備不含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的陰性樣品。

2 結(jié)果

2.1 專屬性實驗 精密吸取柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品溶液，同時取相應(yīng)的供試品溶液，結(jié)合陰性對照品，并將上述制品注入到液相色譜儀中，并對色譜圖進(jìn)行準(zhǔn)確記錄。

2.2 穩(wěn)定性實驗 取相同供試品溶液，結(jié)合相關(guān)操作，對穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗，制備進(jìn)樣量，對RSD值進(jìn)行測量。

2.3 重復(fù)性實驗 在上述特定色譜條件下，對溶液進(jìn)行連續(xù)性進(jìn)樣處理，并對峰面積進(jìn)行準(zhǔn)確測量，并對柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的RSD含量進(jìn)行測定。

2.4 試驗結(jié)果 柴黃片中柴胡皂苷a線性范圍為0.98～5.67μg（r2=0.9991），柴胡皂苷d線性范圍為0.059～0.052μg（r2=0.9997）；柴胡皂苷a的平均加樣回收率為98.0%，柴胡皂苷d的平均加樣回收率為96.5%；柴胡皂苷a的RSD為2.0%，柴胡皂苷d的RSD為1.8%。上述研究結(jié)果證實，測定峰面積RSD值精密度良好，且供試品溶液在10h之內(nèi)穩(wěn)定性良好，說明本研究所采用的測量方法可開展重復(fù)性操作，見附表。

附表 柴黃片中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量

3 討論

中藥制劑在制備過程中，在兼顧中藥制備技術(shù)的基礎(chǔ)上，綜合現(xiàn)代制造技術(shù)，在臨床多種疾病診治中發(fā)揮重要作用。但是，中藥制劑成分比較復(fù)雜，在質(zhì)量控制上存在一定難度，對患者用藥安全產(chǎn)生較大影響[3]。

建立完善、科學(xué)、有效的藥物成分測量方法，并制定出相對合理的限度指標(biāo)，是現(xiàn)階段中成藥制劑的重要方法。但是，根據(jù)目前現(xiàn)有的相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，中成藥方制劑成分測量方法不夠完善，很多可控性指標(biāo)在很大程度上也無含量測量。高效液相色譜法在現(xiàn)階段中藥制劑質(zhì)量控制與評價中具有廣泛的用途，其主要原理為利用指紋圖譜技術(shù)，對藥物有效成分的含量或者所占比例進(jìn)行分析，從而及時知曉藥物中主要成分的總體情況，從而為樣品質(zhì)量控制提供有效幫助，保證中成藥制劑本身的科學(xué)性與合理性，并保持其使用質(zhì)量的穩(wěn)定性，減少用藥不良反應(yīng)，提高患者用藥治療效果。

柴黃片中主要含有兩味中草藥，分別為柴胡和黃芩，因此選擇黃芩的主要成分黃芩苷及柴胡的主要成分柴胡皂苷a、d作為主質(zhì)量控制的關(guān)鍵性指標(biāo)，對其進(jìn)行定量檢測，能夠明確成分含量。但是，由于兩種成分的吸收波長存在一定差異，同時在中成藥中含量不同。本研究采用UHPLC法，對柴黃片中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：柴黃片中柴胡皂苷a線性范圍為0.98～5.67μg（r2=0.9991），柴胡皂苷d線性范圍為0.059～0.052μg（r2=0.9997）；柴胡皂苷a的平均加樣回收率為98.0%，柴胡皂苷d的平均加樣回收率為96.5%，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的RSD分別為2.0%、1.8%。

以上所得數(shù)據(jù)說明，測定峰面積RSD值精密度良好，且供試品溶液在10h之內(nèi)穩(wěn)定性良好，說明本研究所采用的測量方法可開展重復(fù)性操作，UHPLC測量法不僅操作簡單，同時具有可靠性，所得數(shù)據(jù)真實可信，且具有良好的重現(xiàn)性。與此同時，通過上述測量方法，能夠最大程度保證柴黃片定量控制指標(biāo)的科學(xué)性，并為其選擇提供一定參考。本實驗結(jié)果表明，所建立的方法能夠簡便、快速、準(zhǔn)確的測定柴黃片中柴胡皂苷a、d的含量，可以作為該制劑的一個質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

總之，采用UHPLC法對柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量進(jìn)行測定，操作簡便，安全可靠，具有良好的重現(xiàn)性，在柴黃片中成藥主要含量測量中發(fā)揮比較重要的作用，能夠不斷完善中成藥方劑質(zhì)量體系的構(gòu)建。