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    腫瘤抑素相關(guān)肽T42對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞的抑制作用

    2017-10-31 10:17:18鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院471000董瑞強(qiáng)張丹鳳孫廣榮
    首都食品與醫(yī)藥 2017年14期
    關(guān)鍵詞:抑素附表緩沖液

    鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院(471000)董瑞強(qiáng) 張丹鳳 孫廣榮

    腫瘤抑素所處的位置為IV型膠原α3鏈的C端非膠原區(qū),其可以會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)肺出血,以及腎小球腎炎。因此不能將其對人體進(jìn)行直接應(yīng)用[1]。本次研究的時(shí)間段為2016年1月~2016年6月,探討腫瘤抑素相關(guān)肽T42對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞的抑制作用,現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料和方法

    1.1 研究材料 本次研究所選用的觀察對象為細(xì)胞,分組的方式為隨機(jī)分組,開展的時(shí)間段為2016年1月~2016年6月,本次研究所采用的大腸桿菌來自SMELD公司,本次研究所采用的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是由我院樣本室自主保存,本次研究所采用的人胃腺癌中分化細(xì)胞株來自廣州生物研究所,本次研究所采用的T42表達(dá)載體的構(gòu)建工作是由本次研究人員共同來完成。

    1.2 研究方法 腫瘤抑素相關(guān)肽T42的表達(dá)與純化:于大腸桿菌菌株中,將T42質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)來,將單菌落進(jìn)行挑選,將其置于LB培養(yǎng)基接種,培養(yǎng)基中含有氨芐青霉素,濃度為100mg/L,對培養(yǎng)基進(jìn)行震蕩,保持溫度為37℃,第2d按照1∶50的比例,再次于LB培養(yǎng)基上接種,培養(yǎng)基含有氨芐青霉素,開始震蕩30min,保持溫度為37℃,將IPTG加入,濃度為0.5mmol/L。繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),時(shí)間6h,保持溫度為28℃,之后開展離心,時(shí)間10min,速度為每分鐘5000轉(zhuǎn),離心完成后,對菌體進(jìn)行收集。于預(yù)冷的裂解緩沖液中將菌體重懸,超聲破菌后,離心,時(shí)間15min,速度每分鐘12000轉(zhuǎn),提取上清液,注入幾丁質(zhì)親和柱。

    細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)的方法選用MTT法進(jìn)行,對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,以及人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng),使其發(fā)展為對數(shù)期,采用胰酶進(jìn)行消化,開展接種,使其位于96孔板,保持溫度為37℃,培養(yǎng)24h后,分6組,分別加T21肽,T19肽,T42肽,T19+T21肽,以及順鉑,上述物質(zhì)分別加不同濃度,對照組加磷酸鹽緩沖液,加液量同上述劑量相同,各濃度共包括6個(gè)復(fù)孔,終濃度為200,100,50,30,以及10mg/L。24h后,將MTT取20μL加入各孔中,孵育時(shí)間為4h,將孔內(nèi)培養(yǎng)液吸取干凈,之后在采用二甲基亞砜進(jìn)行添加,添加量為100μL,開始振蕩,時(shí)間為10min,對吸光度進(jìn)行測定。

    蘇木精-伊紅染色觀察細(xì)胞形態(tài):取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,以及人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞,兩種細(xì)胞的生長期應(yīng)為對數(shù)生長期,接種于24板孔,24h后,將終濃度為40mg/L的T42肽加入各孔,對照組加入磷酸鹽緩沖液,24h后,將蓋玻片取出,進(jìn)行處理,包括固定,漂洗,蘇木精-伊紅染色等,然后借助顯微鏡進(jìn)行觀察。

    細(xì)胞遷移抑制實(shí)驗(yàn):取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,以及人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞,兩種細(xì)胞的生長期應(yīng)為對數(shù)生長期,接種于24板孔,直至其生長覆蓋率超90%后,于孔板底部,采用移液器槍頭進(jìn)行劃痕,形成無細(xì)胞區(qū),寬度約4mm,反復(fù)采用磷酸緩沖液進(jìn)行沖洗,之后采用新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行重新加入,各細(xì)胞分3組,T42肽組,T19+T21肽半量聯(lián)合組,以及對照組,各組設(shè)復(fù)孔3個(gè),于24h后,48h后觀察其遷移能力。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用±s來表示計(jì)量數(shù)據(jù),行t檢驗(yàn);用[例數(shù)(%)]來表示計(jì)數(shù)資料,行X2檢驗(yàn);P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 T42肽對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞生長的影響 T42肽不僅會抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)也會抑制人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞,同時(shí)這種抑制作用于劑量存在明顯的關(guān)系,前者的IC50為45mg/L,后者的IC50為51mg/L。如附表1、2所示。

    附表1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率(%)

    附表2 人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞存活率(%)

    附表3 T42肽對兩種細(xì)胞遷移的抑制作用

    2.2 T42肽對兩種細(xì)胞形態(tài)的影響 T42肽在產(chǎn)生作用達(dá)到24h之后,可以發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,同時(shí)上述兩種細(xì)胞同周圍的細(xì)胞發(fā)生分離,出現(xiàn)了皺縮,細(xì)胞的形狀呈現(xiàn)為卵圓形或圓形。

    2.3 T42肽對兩種細(xì)胞遷移的抑制作用 采用T42肽作用于兩種細(xì)胞,使其發(fā)揮作用達(dá)到24h或是達(dá)到48h,結(jié)果都會對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞的遷移產(chǎn)生明顯的抑制作用。同時(shí)這種抑制作用同40mg/L的T19+T21肽半量聯(lián)合使用差異并不明顯(P>0.05)。如附表3。

    3 討論

    腫瘤抑素在對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺滅時(shí),不會對人體的正常細(xì)胞造成破壞,因此其不具有毒副作用。腫瘤抑素的功能區(qū)包括兩個(gè),因此也就賦予了其具有的雙重抗腫瘤作用[2]。具有更為強(qiáng)烈的腫瘤抑制作用。加之該類物質(zhì)具有較高活性的抗血管作用,達(dá)到內(nèi)皮抑素的10倍,因此在采用其對機(jī)體進(jìn)行治療時(shí),不需要大量用藥,小劑量即可。相應(yīng)的將治療成本有效降低,更有利于臨床應(yīng)用普及[3]。

    腫瘤抑素發(fā)揮其具有的抗血管作用,主要是憑借其對內(nèi)皮細(xì)胞增殖,管狀化,以及細(xì)胞蛋白合成起到抑制作用,本次研究所采用的原核載體,有效地表達(dá)了目的基因,表達(dá)出的融合蛋白,其在上清液中,占到菌體蛋白的含量超過40%,加之采用幾丁質(zhì)親和層析柱,開展純化,因此結(jié)果更為可靠有效。本次研究結(jié)果顯示,T42肽不僅會抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)也會抑制人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞,同時(shí)這種抑制作用與劑量存在明顯的關(guān)系,前者的IC50為45mg/L,后者的IC50為51mg/L。T42肽在產(chǎn)生作用達(dá)到24h之后,可以發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,同時(shí)上述兩種細(xì)胞同周圍的細(xì)胞發(fā)生分離,出現(xiàn)了皺縮,細(xì)胞的形狀呈現(xiàn)為卵圓形或圓形。采用T42肽進(jìn)行使用,使其發(fā)揮作用達(dá)到24h或是達(dá)到48h,都會對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞的遷移產(chǎn)生明顯的抑制作用。同時(shí)這種抑制作用同40mg/L的T19+T21肽半量聯(lián)合使用差異并不明顯(P >0.05)。證實(shí)了T42肽可對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞的生長和遷移起到抑制作用,對腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮增殖發(fā)揮抑制作用,從而可能對血管生長具有抑制作用。

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