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    細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

    2017-10-27 15:04:01葛含靜
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年16期
    關(guān)鍵詞:鑒定菌株

    摘要:細(xì)菌纖維素具有高結(jié)晶度、生物可降解性和合成可調(diào)控性等優(yōu)良特性,被公認(rèn)為是一種性能較好的纖維素,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、造紙、聲學(xué)等領(lǐng)域。筆者在研究中發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)室自制蕎麥醋自然放置一段時間后,液面上長出厚厚的凝膠狀膜,經(jīng)成分分析,確定該膜成分為纖維素,結(jié)晶度為78%,Iα型纖維素含量為60%。取該蕎麥醋的醪液,經(jīng)富集、分離、初篩和復(fù)篩等,最終從108個單菌落中篩選出1株性能穩(wěn)定的纖維素高產(chǎn)菌株J2,纖維素產(chǎn)量可達(dá) 8762 g/L(濕質(zhì)量)。通過形態(tài)學(xué)與基于16S rRNA序列的分子生物學(xué)鑒定,確定菌株J2為漢森氏葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter hansenii,GenBank登錄號為GU213109)。

    關(guān)鍵詞:細(xì)菌纖維素;菌株;鑒定;漢森氏葡糖醋桿菌

    中圖分類號: S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼:

    文章編號:1002-1302(2017)16-0282-04

    收稿日期:2016-10-19

    基金項(xiàng)目:陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃(編號:2016JQ3036)。

    作者簡介:葛含靜(1981—),女,陜西咸陽人,博士,講師,主要從事糧食工程與發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新、食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)等方面的研究。E-mail:gehanjing1981@163com。

    細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose,簡稱BC)是某些海洋生物(如被囊綱動物)、細(xì)菌(醋酸桿菌、假單胞桿菌、土壤桿菌、無色桿菌、八疊球菌等菌屬的細(xì)菌)代謝產(chǎn)物,由β-1,4-D-吡喃葡萄糖聚合而成,不摻雜任何其他形式的多糖,純度極高。與普通植物纖維相比,BC機(jī)械強(qiáng)度高、吸水保水率高、生物適應(yīng)性良好,被認(rèn)為是性能較好的纖維素,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、造紙、石油開采等領(lǐng)域。

    目前,學(xué)術(shù)界對BC的合成研究主要是圍繞培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化、菌株的代謝工程改造、高產(chǎn)菌株的自然選育及誘變選育等方面展開。陳軍等利用糖廠副產(chǎn)物——酸化糖蜜生產(chǎn)BC,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量顯著提高,且用紅茶菌的復(fù)合菌種能更高效地利用碳源[3]。夏露等利用甲醇廢水發(fā)酵生產(chǎn)BC,發(fā)現(xiàn)以木醋桿菌靜態(tài)發(fā)酵,BC產(chǎn)量較低[4]。楊雪霞等研究發(fā)現(xiàn),剪切力會影響纖維素產(chǎn)生菌的形態(tài)和生物量,不利于BC合成[5]。翁媛媛等以惰性吸附載體固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)BC,在避免剪切力的同時,增加了固液界面的表面積,BC產(chǎn)量為液態(tài)靜置發(fā)酵產(chǎn)量的3倍,但后處理難度增加了很多。de Melo等對漢森氏葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter hansenii) ATCC23769纖維素合成酶操縱子中部分基因進(jìn)行克隆,采用過表達(dá)這些基因以期提高BC產(chǎn)量。周勝虎等從腐爛的水果中自然分離得到BC產(chǎn)生菌JX303335[8]。余曉斌等通過紫外誘變[9],杜雙奎等通過高靜水壓誘變方法[10]實(shí)現(xiàn)了BC高產(chǎn)突變株的成功選育。盡管BC生物合成的研究在各個方面都取得了長足進(jìn)展,但從源頭上自然篩選出性能穩(wěn)定的BC高產(chǎn)菌株,優(yōu)化其發(fā)酵條件,表征其產(chǎn)BC性能相關(guān)指標(biāo),仍具有重要的研究意義。本研究初步篩選出了1株BC產(chǎn)量高且傳代穩(wěn)定的菌株J2,并擬對其進(jìn)行鑒定,同時,擬對菌株J2所產(chǎn)BC的超微結(jié)構(gòu)和超分子結(jié)構(gòu)也作鑒定,為后續(xù)通過誘變或基因工程方法選育優(yōu)良的BC產(chǎn)生菌株奠定基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    11試驗(yàn)材料

    本試驗(yàn)所用材料為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制蕎麥醋。

    12試驗(yàn)試劑

    細(xì)菌基因組提取試劑盒、2 000 bp DNA marker、Ex Taq酶,均購自日本TaKaRa公司。DNA膠純化及回收試劑盒,購自美國Amersham Biosciences公司。細(xì)菌16S rRNA通用擴(kuò)增引物F9/R1510及測序引物F9、R1510和F520,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他試劑均為分析純級或生化試劑級。

    13培養(yǎng)基

    富集培養(yǎng)基:20 g/L葡萄糖,5 g/L酵母膏,1 g/L K2HPO4,10 g/L MgSO4·7H2O,無水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%,005 g/L 制霉素,pH值自然。

    基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基:20 g/L葡萄糖,5 g/L酵母膏,1 g/L K2HPO4,15 g/L MgSO4·7H2O,無水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%,pH值自然。分離培養(yǎng)基、斜面保藏培養(yǎng)基配方在基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加17%瓊脂。

    基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:20 g/L葡萄糖,5 g/L酵母膏,1 g/L K2HPO4,10 g/L MgSO4·7H2O,無水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%,pH值自然。

    所有培養(yǎng)基均于121 ℃高壓滅菌15 min后備用。

    14方法

    141菌種篩選[11]富集:自制蕎麥醋于自然條件放置一段時間,液面長出厚厚的凝膠狀膜。經(jīng)成分分析,確定為BC。吸取10 mL該醋樣,加到90 mL富集培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng) 4 d,培養(yǎng)基表面長出BC。

    分離:吸取1 mL長膜的富集培養(yǎng)液,用無菌生理鹽水稀釋成濃度梯度為10-1、10-2、…、10-7的溶液。吸取后3個濃度梯度的稀釋液各02 mL,涂布于分離培養(yǎng)基平板,30 ℃培養(yǎng)5 d,選擇菌落長勢良好、分布均勻且菌落數(shù)適中的1個平板,挑取所有單菌落,接種于斜面培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)18~24 h,長出豐厚菌苔后,保藏于4 ℃冰箱。

    初篩:將保藏的菌種各挑取1環(huán),分別接種于10 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)5 d,篩選產(chǎn)BC的菌株,挑取其菌膜,連續(xù)2次劃線分離,鏡檢為純培養(yǎng)物后,斜面保藏于4 ℃冰箱。

    復(fù)篩:挑取純化的菌株接種于基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基,連續(xù)5代傳代培養(yǎng),測定每代菌株產(chǎn)生的BC濕質(zhì)量,篩選出產(chǎn)量最高且穩(wěn)定的菌株。培養(yǎng)方法:挑取1環(huán)活化的斜面菌苔,接種于100 mL基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基,30 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化,再接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),測定BC產(chǎn)量。

    BC產(chǎn)量的測定:將活化的種子液按10%接種量(體積分?jǐn)?shù))接入1 L發(fā)酵培養(yǎng)基,用8層滅菌紗布封口,30 ℃靜置培養(yǎng)5 d,測定處理后的BC產(chǎn)量。BC處理方法:用蒸餾水過夜沖洗BC膜,然后浸泡于05 mol/L NaOH溶液中并煮至乳白色半透明狀[12]。處理后的BC膜在濾紙上瀝干,稱質(zhì)量(即BC濕質(zhì)量);將瀝干的BC膜在烘箱中于105 ℃烘至恒質(zhì)量,稱質(zhì)量(即BC干質(zhì)量)。纖維素產(chǎn)量用單位體積培養(yǎng)液的纖維素質(zhì)量表示。

    142凝膠狀膜成分分析[11]定性分析:在培養(yǎng)皿中放入1張新的載玻片,倒入蒸餾水,能覆蓋載玻片即可。挑取培養(yǎng) 2 d 的凝膠狀膜,自然平展于載玻片上,取出載玻片并晾干,向膜上滴665%硫酸,然后用碘液染色,在顯微鏡下觀察顯色情況。

    酶解試驗(yàn):取凝膠狀膜,于105 ℃烘干至恒質(zhì)量,準(zhǔn)確稱取0500 0 g,剪碎,加入纖維素酶溶液中,55 ℃長時間保溫,若溶液變清亮且烘干后膜的質(zhì)量減輕90%以上,則可確定凝膠狀膜主要成分為纖維素。

    143BC結(jié)構(gòu)鑒定超微結(jié)構(gòu)表征:用掃描電子顯微鏡(scanning electronic microscope,簡稱SEM)觀察。BC干膜用雙膠碳導(dǎo)電帶安裝在1截銅段上,用鉑涂層設(shè)備為BC膜涂鉑,室溫進(jìn)行掃描電鏡拍照。

    超分子結(jié)構(gòu)表征:用固態(tài)13C-核磁共振光譜(muclear magnetic resonance,簡稱NMR)測定過夜水洗并烘干的纖維素的結(jié)晶度、晶體類型。測試頻率7546 MHz,脈沖寬度 38 kHz,接觸時間1 ms,轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速5~6 kHz,轉(zhuǎn)角547°,循環(huán)時間3 s,每個光譜2 400次掃描。

    144菌種鑒定形態(tài)學(xué)鑒定:取對數(shù)期菌體,結(jié)晶紫染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài);同時,取對數(shù)期菌體劃線接種于種子培養(yǎng)基平板,30 ℃培養(yǎng)3~5 d,觀察菌落形態(tài)。

    分子生物學(xué)鑒定:用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取BC產(chǎn)生菌株基因組DNA。以基因組為模板、F9/R1510為引物擴(kuò)增16S rRNA序列。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對,用MEGA4繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)合表型特征確定其生物學(xué)地位。

    2結(jié)果與分析

    21BC產(chǎn)生菌株篩選

    涂布分離得到108個單菌落(依次編號為J1,J2,…,J108)。初篩發(fā)現(xiàn),有9株菌能產(chǎn)凝膠狀膜,3株所產(chǎn)凝膠狀膜松軟、有空洞。對能產(chǎn)膜的9株菌連續(xù)5代傳代培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)編號J2的菌株的每一代培養(yǎng)物性狀穩(wěn)定、凝膠狀膜產(chǎn)量最高(平均為8762 g/L),且膜外觀結(jié)實(shí)、平滑、有彈性。

    22凝膠狀膜成分分析

    被染色為深藍(lán)色的物質(zhì)在顯微鏡下呈無規(guī)則層狀分布,包裹著未染色的桿狀菌體細(xì)胞。初步判斷,凝膠狀膜主要成分為纖維素。酶解50 h后溶液變清亮,酶解前膜質(zhì)量 0500 2 g,酶解后質(zhì)量0023 6 g,因此可以算出,纖維素含量為(0500 2~0023 6)/0500 2×100%=9528%??梢耘袛?,凝膠狀膜的主要成分為纖維素。

    23BC結(jié)構(gòu)鑒定

    超微結(jié)構(gòu):如圖1所示,堿煮處理的BC中菌體殘留更少;水洗與堿煮后BC超微結(jié)構(gòu)沒有變化,說明純化方法對纖維素的微觀結(jié)構(gòu)沒有影響,這與McKenna等的研究結(jié)果一致。此外,BC的微纖維直徑不足01 μm,呈密集網(wǎng)狀,很多根微纖維組成纖維絲帶,進(jìn)而形成不計其數(shù)的不規(guī)則、相互疊加的孔穴,即三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)持水保水性能良好,也有利于吸附有機(jī)試劑,因而BC可用作吸水材料和吸附材料,用于食品加工及藥物緩釋體系中[14]。

    超分子結(jié)構(gòu):對比天然纖維素的NMR圖譜(圖2),圖3中信號均為纖維素信號,說明菌株J2所產(chǎn)BC純度高,進(jìn)一步測定發(fā)現(xiàn),該纖維素結(jié)晶度達(dá)78%,Iα型纖維含量達(dá)60%。生物材料的結(jié)晶度與其拉伸性能、尺寸穩(wěn)定性及密度呈正相關(guān)[15],因此可知,菌株J2所產(chǎn)BC拉伸性能及尺寸穩(wěn)定性良好、密度高。Iα型是纖維素的亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu),在一定條件下可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的Iβ晶型,BC具有很強(qiáng)的生物適應(yīng)性且在環(huán)境中易于分解,很可能是由于其中Iα型纖維含量高[16]。因此,與高等植物相比(后者Iα型纖維含量為30%[17]),菌株J2所產(chǎn)BC生物適應(yīng)性良好。

    24菌種鑒定

    241形態(tài)學(xué)鑒定J2菌體細(xì)胞呈桿狀,單個或成對,大小為(212~418)μm×(081~092)μm;菌落呈圓形,表面光滑,凸起,不透明,乳白色,大小為09~14 mm,詳見圖4,可初步判斷菌株J2為醋酸桿菌屬。

    242分子生物學(xué)鑒定對菌株J2進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析,如圖5、圖6所示,菌株J2與菌株Ga hansenii NBRC14817、Ga hansenii NBRC14816和Ga hanseniiNBRC14820同支,相似度達(dá)100%。

    微生物的分類鑒定從來沒有一個黃金指標(biāo)。表型特征雖然可進(jìn)行表型分群,但分類學(xué)結(jié)果不夠精準(zhǔn),因而只能用于描述微生物的表型性狀特征。遺傳學(xué)分類法,即根據(jù)核酸分析得到的遺傳相關(guān)性所作的分類,以決定生物表型特征的遺傳特征DNA和RNA作為比較的準(zhǔn)繩,是一種更客觀和高度可信的分類方法。因此,表型鑒定與遺傳學(xué)分類法結(jié)合,可以更為準(zhǔn)確地對未知微生物進(jìn)行分類鑒定。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定與基于16S rRNA序列擴(kuò)增的分子生物學(xué)鑒定,即可確定菌株J2是漢森氏葡糖醋桿菌(Ga hansenii)。

    3結(jié)論

    本研究以筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制蕎麥醋為材料,將該蕎麥醋放置一段時間后,從其表面凝膠狀膜中自然分離出1株性能良好的BC高產(chǎn)菌株J2,其BC結(jié)晶度為78%,Iα型纖維含量為60%,表明BC密度高,拉伸性、尺寸穩(wěn)定性和生物適應(yīng)性均良好。通過形態(tài)學(xué)鑒定與基于16S rRNA序列的分子生物學(xué)鑒定,確定菌株J2為漢森氏葡糖醋桿菌(Ga hansenii)。

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