象草基因的克隆及生物信息學(xué)分析

吳娟子　錢(qián)晨　張建麗

摘要：從象草中克隆了基因，并對(duì)其進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的表達(dá)序列信息，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性的PCR引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從象草中擴(kuò)增出CpCCoAOMT2基因。對(duì)獲得的基因進(jìn)行序列同源性搜索、結(jié)構(gòu)域搜索及3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等生物信息學(xué)分析。測(cè)序結(jié)果表明，CCoAOMT2基因全長(zhǎng)926 bp，含110 bp的5′-UTR、741 bp的CDS和75 bp的3′-UTR，共編碼246個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為BankIt1975804；Blastn和BlastT分析結(jié)果顯示，[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]基因及其編碼的蛋白在核苷酸水平和氨基酸水平上與多種植物的CCoAOMT基因和CCoAOMT蛋白具同源性；預(yù)測(cè)CpCCoAOMT2蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為27 253，等電點(diǎn)為508，是一個(gè)不含跨膜結(jié)構(gòu)域、不含信號(hào)肽分子的親水性、穩(wěn)定蛋白。分子進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，CpCCoAOMT2蛋白與禾本科植物的CCoAOMT蛋白親緣關(guān)系最近，與裸子植物和蕨類(lèi)植物關(guān)系較近，而與雙子葉植物的關(guān)系較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：象草；咖啡酰酸輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶；基因克隆；生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào)： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0033-04

收稿日期：2016-12-14

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31302025）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（14）5035]；國(guó)家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系鹽城綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目（編號(hào)：CARS-35）；浙江省寧波市科技計(jì)劃（編號(hào)：2016C10018）。

作者簡(jiǎn)介：吳娟子（1977—），女，湖北京山人，博士，副研究員，主要從事牧草育種和產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究。E-mail：jzwu2014@jaasaccn。

象草（Cenchrus purpureus Schum）是一種多年生禾本科C4植物，具有高生物量，高光合效率、多用途、不占用耕地的優(yōu)點(diǎn)。它是世界上生物量最高的草本，年生物量可達(dá)45 t/hm2。它可作為草食畜禽的優(yōu)質(zhì)青飼料，理想的水土保持作物，高質(zhì)量人造板、紙漿和木質(zhì)纖維素類(lèi)能源的優(yōu)質(zhì)原料[1-7]。大量研究表明，植物細(xì)胞壁組成和特征對(duì)木質(zhì)纖維素類(lèi)的高效利用具有重要意義，例如，提高其細(xì)胞壁的纖維素含量，降低其木質(zhì)素含量，可以改善其飼料品質(zhì)和木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化利用效率[8-10]；提高其木質(zhì)素含量，有利于其作為板材的性能。因此，木質(zhì)素是限制細(xì)胞壁降解利用的關(guān)鍵因素之一，如何合理改變象草木質(zhì)素組成和含量對(duì)于有效利用象草具有重要意義。

木質(zhì)素是一種復(fù)雜的酚類(lèi)聚合物，木質(zhì)素單體合成是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究表明，主要有10種酶參與了木質(zhì)素單體的合成。目前，國(guó)內(nèi)外通過(guò)改變這10種酶基因的表達(dá)，調(diào)控植物木質(zhì)素含量與組分的研究進(jìn)展迅速，已相繼從多種不同的植物中分離克隆了多個(gè)木質(zhì)素生物合成代謝中的關(guān)鍵酶基因[10-11]?？Х弱］o酶A甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoyl CoA O-methyltransferase，CCoAOMT）是植物木質(zhì)素生物合成過(guò)程中一類(lèi)重要的甲基轉(zhuǎn)移酶，催化咖啡酰CoA甲基化為阿魏酰CoA[12-14]。國(guó)內(nèi)外的研究表明，抑制楊樹(shù)和輻射松[14]等植物的CCoAOMT基因表達(dá)，植物木質(zhì)素含量下降，同時(shí)伴隨S/G比值增大，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)變得疏松，易于去除，且不影響植物的正常生長(zhǎng)。迄今為止，已經(jīng)從玉米、小麥、大麥、水稻、綠竹、南荻和柳枝稷等禾本科植物中克隆了CCoAOMT基因。NCBI中已有一個(gè)象草CCoAOMT基因（核酸登錄號(hào)：KJ9957361）的記錄，但未見(jiàn)其他研究和相關(guān)報(bào)道。本研究從象草中分離克隆了另1個(gè)CCoAOMT基因，命名為[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以期為研究象草CCoAOMT基因及其編碼蛋白在象草木質(zhì)素代謝中的功能提供理論依據(jù)，為象草的木質(zhì)素改良提供基礎(chǔ)。

1材料和方法

11試驗(yàn)材料

象草品系為eg7，種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，在自然條件下生長(zhǎng)，待植株生長(zhǎng)5個(gè)月后取植株中部的莖段，迅速置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

12試驗(yàn)方法

121引物設(shè)計(jì)

基于筆者所在課題組完成的象草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用Primer50軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性PCR擴(kuò)增引物F：5′-GAGTAGTGGGCGACCTGTGA-3′和R：5′-GAAGGGGAAGGAAAACTTATTG-3′，引物序列由通用生物公司合成。

122象草總RNA的提取、純化及cDNA的合成

采用TRIzol（Invitrogen）試劑提取象草莖總RNA，用RNase-free DNase Ⅰ（Fermentas）除去象草總RNA樣品中的DNA污染，12% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA純化效果，NanoDrop2000檢測(cè)濃度。參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。

123象草基因的RT-PCR擴(kuò)增

25 μL PCR反應(yīng)體系為：10×LA PCR Buffer 25 μL，MgCl2 25 μL，dNTP Mixture 4 μL，正、反向引物各05 μL，LA Taq DNA酶025 μL，ddH2O 1325 μL，模板cDNA 15 μL。PCR反應(yīng)使用降落PCR，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火（1～2循環(huán)70 ℃，3～4循環(huán)69 ℃，5～6循環(huán)68 ℃，7～8循環(huán)67 ℃，9～10循環(huán)66 ℃，11～12循環(huán)65 ℃，13～14循環(huán)64 ℃，15～16循環(huán)63 ℃，17～18循環(huán)62 ℃，19～20循環(huán) 61 ℃，21～22循環(huán)60 ℃，23～24循環(huán)59 ℃，25～26循環(huán) 58 ℃，27～28循環(huán)57 ℃，29～30循環(huán)56 ℃）每個(gè)循環(huán)40 s，72 ℃ 90 s；72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。采用凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR驗(yàn)證與目標(biāo)條帶一致后送通用生物公司測(cè)序。[JP]endprint

124合成序列拼接、比對(duì)和生物信息學(xué)分析

所得的序列用Sequencher 48進(jìn)行拼接并根據(jù)峰圖進(jìn)行手工校正。測(cè)序完成后，3次測(cè)序結(jié)果中的2次共同核苷酸合并為基因片段最終序列。利用DNAMAN V6和BioXM26軟件進(jìn)行序列比對(duì)和氨基酸序列的推導(dǎo)，并通過(guò)NCBI的BLAST工具與GenBank中的已知序列比較，進(jìn)行蛋白序列的相似性分析。利用ProtParam軟件在線分析蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)；采用TMHMM在線分析軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；通過(guò)SignalIP分析軟件對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別使用在線分析軟件NPSA和SWISS-MODEL完成。利用MEGA606軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

2結(jié)果與分析

21象草莖基因全長(zhǎng)cDNA克隆

以象草莖中RNA為模板，利用F/R引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得了預(yù)期大小的cDNA片段（圖1）。將目的片段進(jìn)行回收、純化、驗(yàn)證并測(cè)序，獲得的CpCCoAOMT2基因全長(zhǎng)為926 bp，含110 bp的5′-UTR、75 bp的3′-UTR和1個(gè) 741 bp（111～851 bp）的開(kāi)放閱讀框，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA，G+C含量為649%，共編碼246個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為BankIt1975804。

22象草CpCCoAOMT2蛋白的生物信息學(xué)分析

用在線網(wǎng)站（http：//webExpasyorg/protparam）預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的分子式為C1 212H1 926N328O365S10，總原子數(shù)為3 841個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為27 253。Leu、Ala和Asp在氨基酸組成中出現(xiàn)頻率較高，分別占總氨基酸的122%、102%和93%，而Trp、Cys和His出現(xiàn)的頻率較低，僅占 08%、12%和24%；理論pI為508，其中帶正電荷（Arg+Lys）和負(fù)電荷（Asp+Glu）殘基總數(shù)分別為27個(gè)和37個(gè)；不穩(wěn)定系數(shù)為2605，是不穩(wěn)定蛋白；脂肪族系數(shù)為9793；親水性平均系數(shù)為-0100，屬親水性蛋白；半衰期為30 h。

TMHMM軟件（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)CpCCoAOMT2蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。采用分析軟件SignalIP（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/）對(duì)獲得的CpCCoAOMT2氨基酸序列的信號(hào)肽序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)其沒(méi)有信號(hào)肽序列。通過(guò)NPS（https：//npsa-prabiibcpfr/cgi-bin/secpred_hnnpl）預(yù)測(cè)CpCCoAOMT2氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其多肽鏈中主要結(jié)構(gòu)元件是α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，分別占4797%和3862%，延伸鏈占1341%；運(yùn)用SWISSMODEL工具（https：//swissmodelexpasyorg）對(duì)CpCCoAOMT2的氨基酸序列進(jìn)行同源三維建模（圖2），模型以Automated mode方式構(gòu)建，建模范圍是從第19個(gè)到第245個(gè)氨基酸，其建模參考模板為高粱（Sorghum bicolor）咖啡酰輔酶A甲基轉(zhuǎn)移酶（登陸號(hào)：5kva1A），目標(biāo)蛋白與參考蛋白的序列比對(duì)一致性為6344%。

23象草[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]基因推導(dǎo)酶蛋白氨基酸序列比較與分子進(jìn)化分析

在Pfam（http：//pfamxfamorg）和NCBI上對(duì)獲得的[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)CpCCoAOMT2具有Methyltransf_3（O-methyltransferase，PfamPF01596）和AdoMet_MTases（S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases，cd02440）保守區(qū)，是一種甲基轉(zhuǎn)移酶（圖3）。將[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列與柳枝稷（Panicum virgatum，BAO208821）、玉米（Zea mays，NP_0011525111）和水稻（Oryza sativa，BAG925181）編碼的CCoAOMT氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，其與柳枝稷和玉米的CCoAOMT酶蛋白序列同源性高達(dá)93%、90%，具有高度的保守性，且具有植物甲基酶所共有的A、B、C保守序列元件和CCoAOMT基因家族中所特有的標(biāo)簽序列D、E、F、G、H等5個(gè)保守序列元件[15]（圖4）。

象草[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]基因推導(dǎo)的酶蛋白氨基酸序列與其他植物已報(bào)道的相應(yīng)序列進(jìn)行多序列比較，并構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)（圖5）。結(jié)果顯示，象草CpCCoAOMT2酶蛋白氨基酸序列與禾本科的柳枝稷（Panicum virgatum：BAO208821）、玉米（Zea mays：NP_0011525111）的同源性相對(duì)較高；與禾本科的水稻（Oryza sativa：BAG925181、BAG984141）、小麥（Triticum aestivum：BAD063211）的同源性次之；象草CpCCoAOMT2酶蛋白氨基酸序列與NCBI中已有記錄的象草CpCCoAOMT（Cenchrus purpureus：AIN395351）的同源性相對(duì)較低；而CpCCoAOMT與禾本科中的美洲狼尾草（Cenchrus americanus：ALL436671）、 柳枝稷（Panicum virgatum：BAO208811） 和芒草（Miscanthus lutarioriparius：AEJ830601）的同源性相對(duì)較高。

在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析中可見(jiàn)，本研究所克隆的象草[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]基因與禾本科植物的同類(lèi)基因親緣關(guān)系最近，與裸子植物（臺(tái)灣杉，Taiwania cryptomerioides；臺(tái)灣扁柏，Chamaecyparis formosensis）和蕨類(lèi)植物（江南卷柏，Selaginella moellendorffii）關(guān)系較近，而與雙子葉植物關(guān)系的較遠(yuǎn)（擬南芥，Arabidopsis thaliana；油菜Brassica napus；亞麻Camelina sativa）（圖5、表1），本結(jié)論與李雪平等在禾本科植物綠竹和南荻中的研究結(jié)果[16-17]類(lèi)似，也符合象草分類(lèi)學(xué)中的地位。endprint

3討論

本研究從象草品系eg7中克隆了1個(gè)[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]全長(zhǎng)基因，[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其具有Methyltransf_3和AdoMet_MTases保守結(jié)構(gòu)域，是一種甲基轉(zhuǎn)移酶。對(duì)[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CpCCoAOMT2不僅包含了植物甲基轉(zhuǎn)移酶中普遍存在的A、B和C 3個(gè)保守序列元件，還包含CCoAOMT基因家族中所特有的標(biāo)簽序列，即D、E、F、G和H 5個(gè)保守序列元件[CM（25]，說(shuō)明該基因具有CCoAOMT類(lèi)基因所有的標(biāo)志性特征元

件[15]，因此推測(cè)CpCCoAOMT2是CCoAOMT基因家族的一個(gè)成員，但其具體功能還有待于進(jìn)一步研究。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析中，CpCCoAOMT2基因與禾本科植物的同類(lèi)基因親緣關(guān)系最近，與裸子植物和蕨類(lèi)植物關(guān)系較近，而與雙子葉植物較遠(yuǎn)，本結(jié)論與李雪平等在禾本科植物綠竹和南荻的研究結(jié)果[16-17]類(lèi)似，也與象草分類(lèi)學(xué)中的位置一致。

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