高效液相色譜法測(cè)定保健食品中葉酸條件優(yōu)化

董嬌+曹寧陽+喬玲+王爍+岑琴

摘要：采用二極管陣列檢測(cè)器，以保留時(shí)間和紫外特征吸收光譜圖作為定性依據(jù)，建立高效液相色譜法測(cè)定保健品中葉酸的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明：葉酸檢出限2.5μg/mg；在0.1～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；樣品加標(biāo)回收率在90.9%～105.0%之間，RSD小于3.55%，可作為保健食品中葉酸的定量分析方法。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；葉酸；限出限；加收率

中圖分類號(hào)：R115.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-1161（2017）07-0052-02

葉酸（Folic acid）即維生素B9，是一種水溶性維生素。目前市場(chǎng)上銷售的營(yíng)養(yǎng)保健品基本都添加葉酸。葉酸含量測(cè)定有分光光度法、微生物法、高效液相色譜法和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。食品中的葉酸檢驗(yàn)國(guó)標(biāo)方法為微生物法，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)；分光光度法靈敏度較低，選擇性較差；高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法儀器造價(jià)較高，不利于推廣應(yīng)用；2005年版《中國(guó)藥典》中的葉酸測(cè)定采用高效液相紫外檢測(cè)器法，前處理簡(jiǎn)單，但只適用于葉酸含量高的樣品，且流動(dòng)相組成復(fù)雜，對(duì)色譜柱傷害較大。為此，采用高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)保健食品中的葉酸，旨在建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉酸（批號(hào)139092）由Dr.Ehrenstorfer提供。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

島津LC20A高效液相色譜儀，配有M20A二極管陣列檢測(cè)器；HZF-A500電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DB超聲波發(fā)生器：昆山市超聲儀器有限公司；H2050R離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 HPLC色譜條件及色譜柱 Thermo Syncronis C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；

柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。流動(dòng)相：乙腈+0.2%磷酸水（10‥90）。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（500 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取葉酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg（精確至0.1 mg），置于50 mL容量瓶中，加入0.5%氨水溶解，定容至刻度。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液20 μL、200 μL、400 μL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、10.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用水定容，配制成濃度為0.1，1，2，5，10，20，50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.3 樣品前處理 取樣品20～30片，研磨粉碎（膠囊樣品取出內(nèi)容物研磨粉碎），稱取1 g于25 mL容量瓶中，加0.5%的氨水10 mL，超聲提取10 min，冷卻至室溫，加水定容至刻度，混合均勻；軟膠囊樣品，用注射器吸取其內(nèi)容物1 g于50 mL離心管中，加入0.5%氨水5 mL及水15 mL，加入正己烷20 mL劇烈振蕩3 min，棄去正己烷，水層移至25 mL容量瓶中，用水定容。

上述定容后的溶液高速離心（不小于4 000 r/min），取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇 目前葉酸測(cè)定多用緩沖鹽作流動(dòng)相，本試驗(yàn)選用乙腈-磷酸水作流動(dòng)相。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩者的洗脫分離效果沒有明顯差異，但乙腈-磷酸水流動(dòng)相的配制過程更為簡(jiǎn)單。分別用0.1%，0.2%，0.5%的磷酸溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：磷酸溶液濃度越大，葉酸色譜峰的峰形越尖銳，保留時(shí)間加長(zhǎng)；隨著磷酸濃度增加，溶液pH值降低?？紤]色譜柱使用壽命，選擇0.2%的磷酸溶液作為流動(dòng)相。當(dāng)乙腈與0.2%磷酸水的比例為10‥90時(shí)，可獲得最佳分離效果且保留時(shí)間較短（見圖1）。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 由葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜圖1可知，葉酸在285 nm下吸光度最大，故檢測(cè)波長(zhǎng)定為285 nm，其特征吸收光譜圖見圖2。

2.2 提取液選擇

葉酸在堿性溶液中穩(wěn)定，而其他水溶性維生素在酸性條件下穩(wěn)定，故用0.5%氨水提取樣品中的葉酸，以避免其他水溶性維生素干擾。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.3.2中得到的葉酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按1.3.1色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)（y，響應(yīng)值）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，葉酸在0.1～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=1.655 6e-0.05X-0.026 7，線性相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 9。

2.4 檢出限

在以上分析條件下，方法檢出限為2.5 μg/mg（以3倍噪聲計(jì)）。

2.5 回收率和精密度

取空白樣品5份，加入不同濃度葉酸標(biāo)樣，按1.3.3進(jìn)行樣品前處理，進(jìn)樣20 μl，結(jié)果見表1。

2.6 樣品分析

測(cè)定4種含有葉酸的保健食品，含量分別為397.4，363.5，117.0，154.3 μg/mg，平行樣相對(duì)誤差分別為0.2%，0.2%，0.3%，0.3%。實(shí)際樣品分析證明，本方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，適用于保健品中葉酸的測(cè)定。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化建立用高效液相色譜測(cè)定保健食品中葉酸的方法，方法檢出限為2.5 μg/mg；0.1～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 9；樣品加標(biāo)回收率在90.9%～105.0%之間，RSD小于3.55%。此測(cè)定方法的樣品前處理簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，可作為保健食品中葉酸的定量分析方法。

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Abstract： To establish the method for determining folic acid added in health food by HPLC by using diode array detector and taking retention time and absorption sectrum of ultraviolet characteristic as qualitative basis.

The experimental results showed that： The detection limit of folic acid was 2.5 μg/mg； It had a good linear relation when the concentration ranging from 0.1 to 50μg/mL； The sample added recovery was between 90.9%～105.0%， RSD<3.55%. The method can be used as the quantitative analysis method to determine the folic acid added in health food.

Key words： HPLC； folic acid； detection limit； recoveryendprint