rhBMP-2對大鼠成骨細胞PKA的作用研究

葛 成, 孫海燕, 李齊宏, 于開濤, 舒 瑤, 劉寶林, 楊連甲

實驗研究

rhBMP-2對大鼠成骨細胞PKA的作用研究

葛 成, 孫海燕, 李齊宏, 于開濤, 舒 瑤, 劉寶林, 楊連甲

目的 探討rhBMP-2對大鼠成骨細胞PKA的影響。方法 首先，分別以rhBMP-2(200 μg/L)、PKI-rhBMP-2(1 mg/L的PKI預刺激30 min后加rhBMP-2)干預大鼠成骨細胞0、10、30、60 min，檢測PKA的活性；然后，檢測在200 μg/L的rhBMP-2分別作用10、20、30 min后，大鼠成骨細胞的cAMP濃度；再通過RT-PCR方法，檢測rhBMP-2分別作用0(con)、30、60 min后，細胞內PKAα及PKAβ mRNA。結果 rhBMP-2干預成骨細胞30、60 min后，PKA活性升高(P<0.05)，PKI預刺激30min后，細胞PKA活性顯著降低(P<0.01)，rhBMP-2使已經降低的PKA活性逐漸升高，尤其是在加入rhBMP-2 60min后(P<0.01)。rhBMP-2干預成骨細胞10、20、30min后，細胞內的cAMP濃度無明顯變化(P>0.05)。rhBMP-2對成骨細胞PKAα及PKAβmRNA的影響很小，在60min之內，無顯著變化(P>0.05)。 結論rhBMP-2可以直接或者通過cAMP以外的某個途徑，促進體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞內PKA的活性，對PKA的合成代謝在短期內(60min內)無明顯影響。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白; 蛋白激酶A; 成骨細胞; 信號通路

骨組織形成是一個受很多局部因子精細調控的漸進發(fā)展過程，在這些局部因子中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是對成骨細胞調節(jié)最有效的因子之一。BMP屬于外分泌型信號分子，是TGF-beta超家族成員，有很強的促成骨能力[1]。有學者觀察到BMP引起的細胞功能表現與廣泛存在于動物細胞內的環(huán)磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase, PKA)信號途徑有一定的關聯，PKA的活化是骨形成和BMP誘導的成骨細胞分化不可缺少的一環(huán)[2-4]。Nakao等[5]發(fā)現，cAMP-PKA信號通路的活化，對BMP誘導成骨活性有明顯的增強作用。葛成等[6-7]實驗發(fā)現，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2, rhBMP-2)能促進成骨細胞表達更多活化狀態(tài)的PKA。這些結果提示，BMP信號途徑與PKA信號途徑之間，存在一定的關聯作用。本實驗擬觀察rhBMP-2對大鼠成骨細胞內PKA的活性是否有直接的影響， rhBMP-2是通過使成骨細胞內產生大量的PKA特異性激活物cAMP來完成對PKA的活化，還是促進成骨細胞內PKA酶本身的轉錄和翻譯。自2013年3月，筆者利用放射免疫測定和反轉錄聚合酶鏈式反應方法，對此加以探討。

1 材料與方法

1.1 主要材料

選擇7 d SD仔鼠(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)，胎牛血清(浙江金華犢牛利用研究所)，rhBMP-2(第四軍醫(yī)大學生化教研室)，亮抑酶肽、抑肽酶、胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、L-抗壞血酸、地塞米松(美國SIGMA公司)，PKA Assay System(美國PROMEGA公司)，考馬斯亮藍G-250(華美生物工程公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

無菌條件下，取7 d SD仔鼠四肢長骨，剔凈軟組織，剪成1 mm骨塊，反復沖洗，用含10%FBS的誘導培養(yǎng)液組織塊法培養(yǎng)成骨細胞。約80%匯合后，用差速貼壁法純化并傳代。

1.3 rhBMP-2和PKI干預實驗

當傳代的細胞在10 cm培養(yǎng)皿中約60%匯合時，用含2%FBS(無Dex)的培養(yǎng)液馴化24 h后，分組以rhBMP-2(200 μg/L)、PKI-rhBMP-2(1 mg/L的PKI預刺激30 min后加rhBMP-2)，分別作用0、10、30、60 min，各時間點3復孔。

1.4 PKA活性檢測

按照PKA Assay System試劑盒說明的步驟進行。

1.5 rhBMP-2對成骨細胞cAMP的影響

當傳代的細胞在10 cm培養(yǎng)皿中約60%匯合時，用含2%FBS(無Dex)的培養(yǎng)液馴化24 h后，進入cAMP放射免疫檢測試驗。

經過馴化的成骨細胞，以實驗濃度為200 μg/L的rhBMP-2，分別作用10、20、30 min，各時間點5皿，另設對照組5皿。吸棄培養(yǎng)液，每瓶加入冰冷的高氯酸1 ml，用橡皮刮刀刮下細胞，用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿，勻漿液離心(3000 r/min，15 min)，取上清液，用KOH(0.24 mol/L)調pH 6.3左右，離心(3000 r/min，15 min)，取上清液，-20 ℃保存。測定時操作步驟按I125-cAMP放射免疫試劑盒說明書進行，測定放射性強度。靈敏度好于0.01 nmol/L，標準曲線范圍為0.078，0.156，0.312，0.625，1.250，2.500，5.000，10.000，20.000 nmol/L。根據標準曲線，采用RIA數據處理軟件獲得樣品中cAMP的含量。

1.6 rhBMP-2對成骨細胞PKA mRNA的影響

當傳代的細胞在10 cm培養(yǎng)皿中約60%匯合時，用含2%FBS(無Dex)的培養(yǎng)液馴化24 h后，進入PKA mRNA RT-PCR試驗。

1.6.1 引物設計與合成 本實驗根據GeneBank上SD大鼠的PKAα及PKAβ mRNA全序列設計引物如下：PKAα上游引物：5′CTACAACAAAGCTGTGGACTG3′(21 bp)，下游引物：5′CCTCCTCATAGTCGTCAAAGT3′(21 bp)；PKAβ上游引物：5′GAGTAATGCTGGGCTTGAGGA3′(21 bp)，下游引物：5′GACCTGGATGTAACCCTGGTG3′(21 bp)；β-actin用作PCR的內參照物，根據GeneBank上SD大鼠的β-actin cDNA序列設計引物如下，上游引物：5′AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG3′(24 bp)，下游引物：5′TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT′(21 bp)。由上海生工生物工程公司合成。

1.6.2 總RNA提取 經過馴化的成骨細胞，以實驗濃度為200 μg/L rhBMP-2分別作用0(con)、30、60 min，各時間點3皿。吸棄培養(yǎng)液，按Trizol一步法提取總RNA，測OD260/OD280值，鑒定RNA純度。將總RNA置于EP管中-70 ℃冰箱保存。

1.6.3 總RNA反轉錄反應 按照MBI反轉錄試劑盒說明進行總RNA的反轉錄反應。

1.6.4 聚合酶鏈式反應 按照PCR反應試劑盒說明書，以cDNA為模板，按如下參數進行循環(huán)30次的PCR反應：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，最后一個循環(huán)72 ℃延伸7 min。PCR反應產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查，電泳結果行光密度掃描定量。

1.7 數據分析

按照計量資料的分析方法，分別對各試驗組與對照組進行t檢驗。用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 rhBMP-2對PKA活性的影響

rhBMP-2干預細胞30、60 min，及PKI預刺激30 min后，細胞PKA總活性發(fā)生明顯變化，rhBMP-2使PKA活性升高，PKI使之降低。在PKI預刺激組，rhBMP-2又可以使已經降低的PKA活性逐漸升高，尤其是在加入rhBMP-2 60 min后。見圖1。

2.2 rhBMP-2對cAMP的影響

rhBMP-2對成骨細胞分別作用10、20、30 min后，測得的cAMP濃度與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.3rhBMP-2對PKAmRNA的影響

各樣本OD260/OD280值均在1.6～2.0，說明RNA純度較高。圖3,4所示為PKAα、PKAβ和β-actin的mRNA的RT-PCR擴增產物電泳結果，各實驗組均在240bp處出現特異性擴增條帶，即β-actin條帶；圖3示各實驗組在356bp處出現特異性擴增條帶，即PKAα條帶；圖4示各實驗組在442bp處出現特異性擴增條帶，即PKAβ條帶。光密度掃描定量分析實驗結果表明：rhBMP-2對成骨細胞PKAmRNA的影響很小，在60min之內，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

BMP有很強的促成骨能力，是外分泌型信號分子。而信號轉導的重要特征之一在于它是一個網絡系統(tǒng)，具有高度的非線性內涵和整合作用的特點。蛋白質的可逆磷酸化反應是細胞信號轉導的主要機制之一，這種可逆磷酸化過程主要由大量的蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成，其中，PKA是廣泛存在于動物細胞的一種重要蛋白激酶[8]，有兩個亞型：α和β。 PKA介導的磷酸化反應常被視為細胞內信號傳遞途徑上的重要一環(huán)[9]，而對影響PKA活性因素的研究，則是探討其在細胞內多種功能的重要方法。

Li和He等[2-3]觀察到PKA的活化，能夠提高BMP-2誘導在成骨細胞分化中有重要作用的Dlx3蛋白和轉錄因子Osterix的表達，增強其穩(wěn)定性。Gangopahyay等[10]實驗發(fā)現，BMP-2促進肺動脈內皮細胞一氧化碳合酶活性的作用依賴于PKA的活化，在使用PKA抑制劑PKI或H89的情況下，BMP-2的作用受到抑制。Han等[11]實驗發(fā)現，PKA通過磷酸化Dlx5，使其促進成骨的活性更強，而且，BMP-2對Dlx5蛋白水平的提高作用部分依賴于PKA的激活。作者認為，PKA參與了成骨細胞分化及骨形成的幾個環(huán)節(jié)，在BMP誘導的成骨細胞分化成骨過程中，PKA的活化即使不是充分條件，也是必要條件。

我們發(fā)現，經cAMP干預后，體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞ALP活性明顯升高，而PKI干預的結果正相反，ALP活性下降。說明PKA活性受到影響后，成骨細胞的ALP的活性發(fā)生了變化，提示PKA參與了成骨細胞特異性表型的表達。rhBMP-2作用一段時間，可以使已經被PKI降低的ALP活性有一定程度的升高，說明PKA可能與rhBMP-2的作用機制有一定關系[6]。通過免疫細胞化學方法又觀察到，在體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞內，存在活化型的PKAα和PKAβ的表達[7]，這提示rhBMP-2能夠激活PKAα和PKAβ。因此，有必要用更加直接的實驗手段來觀察PKA活性變化和BMP之間的關系。本實驗觀察到的現象，更直接地顯示出BMP對PKA活性的促進作用。PKI刺激成骨細胞后，PKA活性明顯降低(30 min，P<0.01)，rhBMP-2不僅使PKA活性升高，而且當作用時間較長時，可以使已經被PKI降低的PKA活性逐漸升高，這說明BMP確實能夠影響PKA的活性。Ohta等[12]的實驗也觀察到了cAMP-PKA信號通路與BMP之間的關聯現象。

但BMP究竟以何種方式激活PKA，是直接作用于PKA，還是首先產生大量的PKA特異性的上游因子cAMP呢？因此，我們嘗試探討rhBMP-2激活PKA的機制是否是通過cAMP途徑。Tsukamoto等[13]在觀察BMP2和BMP4對生長激素釋放肽作用于AtT20細胞系的實驗中發(fā)現,BMP對cAMP的合成無明顯影響。然而，有學者觀察到，BMP-4和BMP-6能夠提高腦垂體瘤細胞系GH3細胞內cAMP水平[14]。

圖1rhBMP-2對細胞內PKA活性的影響 圖2rhBMP-2對細胞內cAMP的影響 圖3PKAα和β-actin電泳 圖4PKAβ和β-actin電泳

Fig 1 Effect of rhBMP-2 on PKA activity in SD rat osteoblasts. Fig 2 Effect of rhBMP-2 on cAMP in SD rat osteoblasts. Fig 3 Electrophoresis pattern of PKAα and β-actin. Fig 4 Electrophoresis pattern of PKAβ and β-actin.

本實驗發(fā)現，rhBMP-2干預細胞30 min之后，成骨細胞PKA活性即發(fā)生明顯變化(升高)。那么，PKA的活性升高，是在細胞受到干預的30 min內，由于其特異性上游激活劑cAMP數量增加而導致的嗎？通過放射免疫測定的方法，我們測定了rhBMP-2對成骨細胞分別作用10、20、30 min后，細胞內cAMP的濃度，結果發(fā)現實驗組與對照組的cAMP水平無明顯差異(P>0.05)。說明rhBMP-2對細胞內的cAMP沒有直接影響，即cAMP沒有直接參與rhBMP-2激活PKA的過程。這個結果與Tsukamoto等[13]的實驗類似，提示在不同的細胞中，BMP對cAMP的影響可能不盡相同。另外，我們又應用RT-PCR方法，觀察rhBMP-2是否影響PKA的mRNA水平，初步探討rhBMP-2是否促進成骨細胞內PKA酶本身的轉錄。實驗結果表明，rhBMP-2對成骨細胞PKAmRNA的影響很小，在60min的作用時間里，PKAmRNA沒有顯著變化(P>0.05)，說明rhBMP-2對PKA的轉錄層面沒有產生迅速而又直接的影響。

由此提示，rhBMP-2可以直接或者通過cAMP以外的某個途徑，促進體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞內PKA的活性，對PKA的合成代謝在短期內(60min內)無明顯影響。但作用時間延長后，rhBMP-2是否促進cAMP或PKA的合成，尚待進一步研究證實。

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Effect of rhBMP-2 on Protein Kinase A of osteoblasts in SD rat

GECheng,SUNHai-yan,LIQi-hong,etal.

(DepartmentofStomatology, 307HospitalofPLA,Beijing100071,China)

Objective To explore the effect of rhBMP-2 on PKA activity of osteoblasts in SD rat. Methods Firstly, PKA activities were measured after the cells were treated with rhBMP-2 (200 μg/L) and PKI-rhBMP-2 (1 mg/L PKI pretreating for 30 minutes ) for 0, 10, 30 and 60 minutes respectively. Then, the cAMP concentration was detected after the cells were treated with rhBMP-2 for 10, 20, 30 minutes and PKAα and PKAβ mRNA was also measured byRT-PCR after the cells were treated with rhBMP-2 for 0, 30, 60 minutes. Results The PKA activity was increased by rhBMP-2 treating for 30 and 60 minutes (P<0.05).PKAactivitywasdecreasedafterPKIpretreatedfor30minutes(P<0.01),whereasrhBMP-2elevatedthedepressedPKAactivityinatime-dependentmanner(P<0.05).NodifferenceoftheamountofcAMPwasfoundbetweentheexperimentalgroup(treatedwithrhBMP-2for10, 20, 30minutesrespectively)andthecontrolgroup(P>0.05).PKAmRNAwasdetectedthroughRT-PCwithin60minutes,therewasnosignificanteffectofrhBMP-2onratcellsPKAmRNAlevel(P>0.05). Conclusion PKA activity in SD rat osteoblasts can be increased by rhBMP-2 directly or by some pathway except for cAMP signal pathway. And rhBMP-2 does not affect PKA synthesis (mRNA level) in the exposure time less than 60 minutes.

Bone morphogenetic protein; Protein kinase A; Osteoblast; Signal pathway

國家自然科學基金資助項目(30070818)；北京市自然科學基金資助項目(7152110)

100071 北京，中國人民解放軍第三○七醫(yī)院 口腔科(葛 成,孫海燕,李齊宏,于開濤,舒 瑤)；第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī) 院(劉寶林,楊連甲)

葛 成(1972-)，男，山東人，副主任醫(yī)師，博士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.011

R

A

1673-7040(2015)04-0220-04

2014-12-08)