雙親性載體HA—GMS的構(gòu)建及載胰島素納米乳的評(píng)價(jià)

樸明貫 左阿龍

摘 要： [目 的]利用酯化反應(yīng)合成單硬脂酸甘油酯修飾雙親性透明質(zhì)酸載體（HA-GMS），優(yōu)化處方制成油包水（W/O）型HA-GMS納米乳，并胰島素為模型藥物研究理化性質(zhì)，提高胰島素胃腸道穩(wěn)定性和生物利用度。

[方 法]以單硬脂酸甘油酯（GMS）酯化透明質(zhì)酸（HA）的羧基合成雙親性化合物HA-GMS，以納米乳相區(qū)面積為考察指標(biāo)，對(duì)制備空白納米乳的油相，內(nèi)水相pH進(jìn)行優(yōu)化，加制備HA-GMS，研究濃度對(duì)空白納米乳的影響；制備W/O型HA-GMS胰島素納米乳，進(jìn)行理化性質(zhì)的考察和酶降解實(shí)驗(yàn)，并以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)胰島素納米乳的降糖效果進(jìn)行考察。

[結(jié) 果]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，透明質(zhì)酸的羧基和單硬脂酸甘油酯的羥基酯化成功。HA-GMS的胰島素納米乳的載水量達(dá)到6%左右，平均粒徑為33.9nm，通過透射電鏡顯示胰島素納米乳為圓整的球形或橢圓形，大小較均勻。胰島素納米乳酶降解實(shí)驗(yàn)中，90分鐘時(shí)胰島素剩余百分比分別為21%和37%，顯著提高胰島素的胃腸道穩(wěn)定性。藥效學(xué)研究表明口服胰島素納米乳有一定降糖作用，灌胃4小時(shí)大鼠血糖含量達(dá)到初始值的70.28%，作用效果達(dá)到12小時(shí)左右。

[結(jié)論]HA-GMS納米乳給藥系統(tǒng)能顯著增加胰島素在胃腸道中的穩(wěn)定性，在大鼠體內(nèi)顯著增加胰島素的生物利用度，并延長(zhǎng)胰島素降糖作用時(shí)間。

關(guān)鍵詞： 透明質(zhì)酸，胰島素，W/O納米乳

【中圖分類號(hào)】 R94 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A【文章編號(hào)】 2236-1879（2017）20-0297-02

多肽類藥物口服給藥面臨的問題是胃腸道環(huán)境的影響和腸道粘膜的低通透性，口服首先被胃蛋白酶水解，后進(jìn)入腸道，遭各種蛋白酶的降解致多肽類藥物口服生物利用度降低。對(duì)蛋白質(zhì)類藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾，能增加脂溶性，提高膜滲透性和抵抗酶分解能力，但修飾后的前藥生物活性往往降低，體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)也會(huì)因一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變發(fā)生變化，產(chǎn)生新分子實(shí)體的安全性評(píng)價(jià)也是長(zhǎng)期過程[1]。研究結(jié)果顯示，多肽類口服生物利用達(dá)到上限，有必要探索新口服吸收方法及藥物傳遞系統(tǒng)。

納米乳是表面活性劑分子在油水界面上，疏水端伸向油相，親水端伸向水相自發(fā)形成有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的劑型[2]，油包水（W/O）型微納米乳一直作為制備蛋白質(zhì)類藥物的給藥系統(tǒng)[25]。有效使用多種生物可降解材料及具有生物相容性的材料為藥物的載體，使藥物與相應(yīng)的載體材料形成尺度在納米級(jí)的給藥系統(tǒng)。這種新型的納米藥物傳遞系統(tǒng)由于其結(jié)構(gòu)能對(duì)藥物進(jìn)行有效的包裹，口服能對(duì)藥物在胃腸道中具有一定的保護(hù)作用[3]，較小粒徑也增加在胃腸道中的比表面積，從而增加吸收面積[4]，新功能性載體材料的應(yīng)用，也能改善制劑在胃腸道中的吸收和保護(hù)作用[6]。

透明質(zhì)酸是在細(xì)胞外基質(zhì)、結(jié)締組織和高等動(dòng)物的器官中廣泛分布天然蛋白多糖[7]。將采用透明質(zhì)酸合成單硬脂酸甘油酯酯化的HA-GMS雙親性化合物，制備W/O型HA-GMS載胰島素納米乳，W/O型HA-GMS納米乳對(duì)蛋白質(zhì)類藥物的保護(hù)作用。

1.材料與儀器

材料。

透明質(zhì)酸；磷酸二氫鈉；磷酸氫二鈉，丙酮；透析袋；碳二亞胺鹽酸鹽；N-羥基琥珀酰亞胺；單硬脂酸甘油酯；吐溫80；司盤80；乙醇；肉豆蔻酸異丙酯；中鏈甘油三酯；大豆油；胰島素；磷酸緩沖液；硫酸鈉；乙腈；四氧嘧啶；SPF級(jí)，Wistar鼠，體重240-260g，雄性。

1.1儀器。

磁力攪拌器；超速冷凍離心機(jī)；冷凍干燥機(jī)（Virtis BT2k，SP SCIENTIFIC）；超聲清洗器；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（STARTER 2100）；漩渦儀（West Thorndale Ave）；電子天平（BSA2201）；核磁共振儀（AV-300，）；傅里葉紅外光譜測(cè)定儀；血糖儀（SURESTEP PLUS）；JL-1197型激光粒度分布測(cè)試儀；HP1100高效液相色譜儀；日本JEM-1200EX透射電鏡。

2.方法與結(jié)果

2.1HA-GMS納米口服給藥系統(tǒng)的制備和優(yōu)化。

2.1.1HA—GMS的合成與表征。

對(duì)HA的羧基進(jìn)行共價(jià)修飾，在羧基上連接疏水性基團(tuán)GMS，增加HA的疏水性。首先把HA和EDC/NHS分別溶解在PBS（pH為7.4），攪拌2h，將溶液滴入GMS丙酮溶液中，反應(yīng)24h，將得到的混合物在15000rpm，4℃下離心20min/次，直到不渾濁，將上清液用透析膜透析3天[9]，冷凍干燥得到樣品粉末，用紅外光譜和核磁共振氫譜表征結(jié)果如圖1和圖2。

在圖1中，3466cm-1左右為HA的-OH基團(tuán)，1800-1600為C=O，1260-1000為C-O單鍵，在2922.16附近產(chǎn)生伸縮振動(dòng)，1400-1500的伸縮為sp3，sp2的C-H，經(jīng)酯化引入碳水化合物鏈，HA-GMS比HA所有吸收都尖銳，驗(yàn)證GMS單體連接新HA鏈。圖2，HA-GMS在1ppm左右出現(xiàn)的峰進(jìn)一步證明HA連接含H基團(tuán)。透明質(zhì)酸的羧基和單硬脂酸甘油酯的羥基化成功。

2.2.2納米乳的制備和優(yōu)化。

選擇常見油相，表面活性劑，助表面活性劑混合后，滴水相，超聲分散5min，采用單因分析法分別考察納米乳的最佳油相，最適HLB值，應(yīng)用軟件Origin8繪制偽三相圖，用AutoCAD計(jì)算處方相圖中納米乳面積考察空白處方，選擇納米乳相區(qū)面積較大的處方對(duì)水相pH進(jìn)行考察，為后續(xù)載胰島素篩選最佳酸性水相[10]。

IPM在HLB=5，7的時(shí)候有較大的納米乳相區(qū)面積，分別為5.73%和3.38%。選擇IPM為油相在HLB值為5-8之間進(jìn)行進(jìn)一步篩選。HLB=9時(shí)，各納米乳相區(qū)均較小，HLB值較小時(shí)傾向形成油包水體系，較大時(shí)更傾向形成水包油體系，選擇三種在納米乳中安全性較高的三種油相，分子體積大小排列為MCT

HLB=5，Km=2和HLB=8，Km=4時(shí)均有較大的納米乳相區(qū)面積，分別為4.58%和4.42%。Km=2時(shí)，納米乳相區(qū)的面積隨著HLB值增大而減小，不符合HLB理論。Km=3時(shí)，隨著HLB值的增大，納米乳相區(qū)無(wú)顯著變化，Km=4時(shí)，納米乳相區(qū)有增大的趨勢(shì)。據(jù)不同Km值和HLB值得到的納米乳相區(qū)面積，綜合考慮存放過程中，發(fā)現(xiàn)HLB=8，Km=4時(shí)雖有較大的納米乳相區(qū)面積，但納米乳會(huì)產(chǎn)生分層現(xiàn)象，綜合考慮制劑的載水量，選擇載水分別為5.75%，4.95%，3.28%的三個(gè)處方進(jìn)一步考察，處方組成如表1。

圖5看出，在1號(hào)和2號(hào)處方中，內(nèi)水相pH等于2，有較大的載水量，處方3中，pH對(duì)載水量幾乎無(wú)影響，可能是因?yàn)樘幏?中，載水量較少，pH對(duì)載水量的影響不顯著，在空白納米乳載親水性藥物時(shí)，在不影響藥物穩(wěn)定性前提下，內(nèi)水相pH為2時(shí)有較大載藥量。

2.2.3HA-GMS納米乳的制備和優(yōu)化。

制備的理論可以提高油水界面的穩(wěn)定性的HA-GMS為兩親性材料，選擇載水量較高的處方，在空白納米乳中加入不同濃度的HA-GMS，測(cè)載水量變化，研究HA-GMS對(duì)納米乳制劑穩(wěn)定影響。

測(cè)定結(jié)果可看出，HA-GMS在0.5-12mg/ml時(shí)載水量無(wú)顯著變化，濃度大于12mg/ml時(shí)，載水量急劇下降。制備過程發(fā)現(xiàn)，納米乳制備一定時(shí)間，未加入HA-GMS的納米乳分層現(xiàn)象明顯，HA-GMS能提高納米乳的穩(wěn)定性。

2.2HA-GMS胰島素納米乳口服載藥系統(tǒng)的評(píng)價(jià)和酶降解實(shí)驗(yàn)。

2.2.1胰島素納米乳的粒徑和形態(tài)。

選擇載水量較高的處方1，加胰島素，用負(fù)染色法制備樣品：取胰島素納米乳適量，取1-2滴于銅網(wǎng)上，靜一段時(shí)間，自然晾干，滴2%磷鎢酸溶液，負(fù)染3min，自然揮干。透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)，拍照，多分散激光粒度儀測(cè)量粒徑大小，結(jié)果如圖7，圖8所示。

制得胰島素納米乳為球形或橢圓形，大小較均勻。因測(cè)前存放時(shí)間較長(zhǎng)，有一定聚集現(xiàn)象。圖8粒徑分布看出，粒徑分布較窄，大小分布均勻，平均粒徑為33.9nm，較小粒徑使乳滴不易發(fā)生聚集，利保持胰島素納米乳的穩(wěn)定性。

2.2.2 HA-GMS胰島素納米乳體外酶降解實(shí)驗(yàn)。

依最優(yōu)處方制備胰島素納米乳，用0.01mol/L鹽酸配置相同藥物含量的胰島素溶液，分別加入到配置好的人工胃液，37℃孵化，在0，3，6，9，15，30，60，90min應(yīng)用反透析法在透析袋內(nèi)取樣200μL，高效液相色譜法測(cè)定胰島素含量，色譜柱：美國(guó)Thermo Hypersil GOLD C18柱，流動(dòng)相為0.1mol/L磷酸二氫鈉-0.1mol/L硫酸鈉-乙腈，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0；流速為1.0ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm；進(jìn)樣量為20μL，柱溫為30℃[11]。計(jì)算胰島素的剩余率。

在胃蛋白酶中，胰島素原料藥18min左右即降解完全，在胃液中，90min剩余百分含量約為21%。在胰蛋白酶的降解下，胰島素90min降解量約為96%，胰島素制劑在胰蛋白酶的降解下90min剩余百分含量約為37%。結(jié)果顯示，胃蛋白酶對(duì)胰島素制劑的降解效果較強(qiáng)，納米乳制劑均對(duì)胰島素有一定的保護(hù)作用。

2.3口服HA-GMS胰島素納米乳的大鼠體內(nèi)降血糖實(shí)驗(yàn)。

取鼠15只，飼養(yǎng)3天，禁食12時(shí)，照150mg/kg腹腔注射四氧嘧啶，在充足日光照射下飼養(yǎng)5天，造模5天，禁食12時(shí)，尾靜脈取血，照血糖儀說明方法測(cè)定大鼠空腹血糖濃度，血糖濃度大于11mmol/L為造模成功[12]。

取糖尿病鼠12只，隨機(jī)分4組，每組3只，分別為載藥納米乳組，原料藥組，空白納米乳組，對(duì)照組，載藥納米乳組和原料藥組給藥相當(dāng)原料藥20IU/kg，實(shí)驗(yàn)過程禁食，自由飲水，于0，1，2，3，4，6，8，10，12h尾靜脈取血，血糖儀測(cè)定血糖值，算各時(shí)間血糖濃度占初始血糖濃度百分比，繪制血糖曲線。

原料藥組，空白納米乳組與對(duì)照組對(duì)比均無(wú)顯著差異，說明納米乳輔料對(duì)血糖值無(wú)顯著影響，胰島素納米乳制劑組與其他組相比，降糖效果顯著，降糖效果持久。原料藥組與載藥納米乳組對(duì)比，證明表面活性劑和油相共同包裹的胰島素有效避免胃腸道中胃蛋白酶水解，使胰島素不受胃腸道中環(huán)境的影響。制備W/O型納米乳可以有效促進(jìn)胰島素口服吸收。

3.討論

原料藥組與載藥納米乳組對(duì)比，證明雙親性載體HA-GMS構(gòu)建納米乳有效避免胰島素在胃腸道中被胃蛋白酶水解，納米乳內(nèi)水相給胰島素提供穩(wěn)定的環(huán)境，胰島素不受胃腸道中環(huán)境的影響。

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