缺血性中風(fēng)病患者體質(zhì)、證候與MMP9，IL6，MTHFR基因多態(tài)性的相關(guān)性研究

孫帥玲++謝雁鳴++張寅 王志飛 楊靖 王丹巧 焦玥 陳軍 陶艷會

[摘要]通過研究缺血性中風(fēng)病患者證候、體質(zhì)與MMP9，IL6，MTHFR基因多態(tài)性之間相互關(guān)系，對缺血性中風(fēng)病患者從體質(zhì)、證候與MMP9，IL6，MTHFR基因多態(tài)性關(guān)系進(jìn)行分析。采集缺血性中風(fēng)病患者的相關(guān)資料，建立數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果納入的61例缺血性中風(fēng)病患者中風(fēng)痰瘀阻證患者出現(xiàn)頻率最高，共30例；痰濕質(zhì)是缺血性中風(fēng)病患者易發(fā)體質(zhì)，共20例；體質(zhì)與證候?qū)?yīng)關(guān)系分析顯示：氣虛體質(zhì)患者發(fā)病后傾向表現(xiàn)為氣虛血瘀證；痰濕體質(zhì)和平和體質(zhì)患者發(fā)病后傾向表現(xiàn)為風(fēng)痰瘀阻證；證候與MMP9，IL6關(guān)系：風(fēng)痰瘀阻證、氣虛血瘀證患者M(jìn)MP9，IL6分布經(jīng)Z檢驗有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<005），氣虛血瘀證患者M(jìn)MP9水平明顯高于風(fēng)痰瘀阻證患者；風(fēng)痰瘀阻證患者IL6水平明顯高于氣虛血瘀證患者；證候、體質(zhì)與MTHFR基因多態(tài)性關(guān)系：61個樣本中，共檢測到雜合突變34例；純和突變15例；無突變12例，該基因位點突變率是未突變患者的408倍；痰濕質(zhì)患者發(fā)病后其MTHFR C677T基因型傾向于表現(xiàn)為CT基因型；風(fēng)痰瘀阻證患者發(fā)病后易表現(xiàn)為TT基因型；陰虛動風(fēng)證患者發(fā)病后易發(fā)生雜和突變，表現(xiàn)為CT基因型。從缺血性中風(fēng)病患者證候與體質(zhì)關(guān)系分析顯示，痰濕質(zhì)、平和質(zhì)患者發(fā)病后易表現(xiàn)為風(fēng)痰瘀阻證；氣虛質(zhì)患者發(fā)病后易表現(xiàn)為氣虛血瘀證。提示發(fā)病前如對于偏頗體質(zhì)進(jìn)行調(diào)理，或許對預(yù)防缺血性中風(fēng)病有一定效果；從缺血性中風(fēng)病患者證候與MMP9，IL6關(guān)系分析顯示，風(fēng)痰瘀阻證與IL6水平具有相關(guān)性，氣虛血瘀證與MMP9水平具有相關(guān)性。從缺血性中風(fēng)病患者證候與MTHFR基因多態(tài)性關(guān)系分析顯示，TT基因型患者發(fā)病后易表現(xiàn)為風(fēng)痰瘀阻證，CT基因型患者發(fā)病后易表現(xiàn)為陰虛動風(fēng)證；從缺血性中風(fēng)病患者體質(zhì)與MTHFR基因多態(tài)性關(guān)系分析顯示，CT基因型患者易表現(xiàn)為痰濕質(zhì)。為更深入地認(rèn)識缺血性中風(fēng)病病機(jī)提供依據(jù)，為臨床治療與預(yù)防提供干預(yù)策略。

[關(guān)鍵詞]缺血性中風(fēng)病； 體質(zhì)； 證候； MMP9，IL6，MTHFR基因多態(tài)性

Study on relationship between constitution and syndrome of MMP9，

IL6 and MTHFR gene in patients with ischemic stroke

SUN Shuailing1， XIE Yanming1， ZHANG Yin1， WANG Zhifei1， YANG Jing1*， WANG Danqiao2，

JIAO Yue2， CHEN Jun3， TAO Yanhui3

（1. Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chineses Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2. Medical Experiment Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3. Wuhan Branch， Beijing Liuhe Large Gene Technology Co.， Ltd.， Wuhan 430000， China）

[Abstract]By studying the relationship between syndromes， physique and MMP9， IL6 and MTHFR gene polymorphisms in patients with ischemic stroke，The relationship between MMP9， IL6 and MTHFR gene polymorphism was analyzed in patients with ischemic strokeThe data were collected by collecting the data of patients with ischemic stroke， and the statistical analysis was carried out Syndrome：61 cases of ischemic stroke patients with stroke phlegm stasis syndrome in patients with the highest frequency， a total of 30 cases； Physical constitution： phlegm is ischemic stroke patients prone to physical， a total of 20 cases； The analysis of the relationship between constitution and syndrome shows that the patients with qi deficiency constitution tend to show qi deficiency and blood stasis syndrome after onset， The analysis of the relationship between constitution and syndrome shows that the patients with qi deficiency constitution tend to show qi deficiency and blood stasis syndrome after onset， Phlegm constitution and physical condition after the onset of symptoms tend to wind phlegm stasis syndrome； Syndrome and MMP9， IL6 relationship：The distribution of MMP9 and IL6 in patients with qi and phlegm stasis syndrome and qi deficiency and blood stasis syndrome was significantly different from that in Z test （P<005）. The level of MMP9 in patients with qi deficiency and blood stasis syndrome was significantly higher than that in patients with wind phlegm and blood stasis syndrome；The level of IL6 in patients with phlegm and blood stasis syndrome was significantly higher than that in patients with qi deficiency and blood stasis syndrome Syndrome， constitution and MTHFR gene polymorphism： among the 61 samples， 34 were heterozygous mutations， 15 were pure and mutated， 12 had no mutation， The mutation rate of this locus was 408 times that of patients without mutationsThe genotype of MTHFR C677T in patients with phlegm dampness tends to be CT genotype Wind phlegm stasis syndrome in patients with easy to appear after the TT genotype； Yin deficiency syndrome in patients prone to miscellaneous and mutations， the performance of CT genotype； Analysis of the relationship between syndromes and physique in patients with ischemic stroke，Phlegm and dampness， flat quality patients after the onset of easy to show the wind phlegm stasis syndrome； Qi deficiency after the onset of symptoms in patients with Qi and blood stasis Suggesting that before the onset of such as for the partial physical conditioning， may be on the prevention of ischemic stroke have a certain effect； Analysis of the relationship between syndromes and MMP9 and IL6 in patients with ischemic stroke， Wind phlegm stasis syndrome and IL6 levels are related， Qi deficiency and blood stasis syndrome and MMP9 levels are related Analysis of the relationship between syndromes and MTHFR gene polymorphism in patients with ischemic stroke， TT genotype after the onset of symptoms prone to wind phlegm stasis syndrome， CT genotype patients after the onset of easy manifestations of Yin deficiency wind syndrome； Analysis of the relationship between physique and MTHFR gene polymorphism in patients with ischemic stroke， CT genotype is easy to show phlegmFor more indepth understanding of pathogenesis of ischemic stroke to provide the basis， For the clinical treatment and prevention to provide intervention strategies.endprint

[Key words]ischemic stroke； physical； syndrome； MMP9， IL6， MTHFR gene polymorphism

缺血性中風(fēng)病是指因腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧所致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化，近年來缺血性中風(fēng)病發(fā)病率、死亡率逐年升高，全球疾病負(fù)擔(dān)研究報告指出，自2010年來缺血性中風(fēng)病成為導(dǎo)致中國居民死亡主要原因。西醫(yī)微觀學(xué)即基因、蛋白層面對該病的研究成為目前的熱點，基因翻譯蛋白；中醫(yī)對于缺血性中風(fēng)病認(rèn)識多從宏觀角度即證候與體質(zhì)層面，體質(zhì)是證候內(nèi)在基礎(chǔ)，體質(zhì)學(xué)說與基因組學(xué)都具有遺傳本質(zhì)，都受先天因素與后天環(huán)境影響產(chǎn)生改變，這些相似性決定了他們之間具有關(guān)聯(lián)，基因與蛋白之間、證候與體質(zhì)之間又有一定聯(lián)系，因此，從體質(zhì)、證候、基因、蛋白層面對該病進(jìn)行研究，深入了解其發(fā)病機(jī)制，為臨床治療與預(yù)防提供一定參考作用。

1資料

11研究對象

2016年11月1日—2017年1月10日期間分布在全國7家臨床單位（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院、河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院豫東醫(yī)院、廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院、長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、太原市中醫(yī)院）缺血性中風(fēng)病患者61例。

12診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組2014年發(fā)布的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[1]。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照1996年國家中醫(yī)藥管理局全國中醫(yī)腦病急癥科研協(xié)作組制定的《中風(fēng)病診斷與療效評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》[2]。

13納入、排除及剔除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病史及CT/MRI等檢查符合TOAST分型屬大動脈粥樣硬化性腦梗死；②首次發(fā)病患者≥50%；③初發(fā)患者2周以內(nèi)；④年齡35～80歲；⑤本人或法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①西醫(yī)診斷為TIA、出血性腦卒中及混合型腦卒中；②TOAST分型標(biāo)準(zhǔn)為心源性栓塞型、其他明確病因型缺血性腦卒中；③西醫(yī)診斷為腦梗死但意識不清。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合納入標(biāo)準(zhǔn)而被誤納入者；②納入后無任何數(shù)據(jù)者。

14中醫(yī)證候

依據(jù)1996年國家中醫(yī)藥管理局全國中醫(yī)腦病急癥科研協(xié)作組制定的《中風(fēng)病診斷與療效評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》中醫(yī)證型、中醫(yī)癥狀體征。

15中醫(yī)體質(zhì)

依據(jù)中華中醫(yī)藥學(xué)會2009年發(fā)布的《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》[3]標(biāo)準(zhǔn)的中醫(yī)體質(zhì)分型。

2方法

21生物樣本采集

符合入組條件的所有研究對象抽血前1天清淡飲食，晚飯后禁食8～12 h，第2天空腹抽取外周靜脈血，用于蛋白檢測的靜脈血離心后分裝在EP管，-80 ℃冰箱保存；用于基因多態(tài)性分析的靜脈血置于 EDTA 抗凝管中，-80 ℃冰箱保存。

22MMP9檢測

221材料

Elisa試劑盒（R&D公司），批號（lot）P118203；美國Bioteck Eon全自動酶標(biāo)儀。

222酶聯(lián)免疫吸附法

試劑盒4 ℃保存，使用前恢復(fù)至室溫。待測樣品-80 ℃保存，使用前融化至室溫，充分混勻后使用。溶液配制：用超純水按照1∶25進(jìn)行稀釋。對照品配制：用超純水溶解Humman MMP9標(biāo)準(zhǔn)品，得質(zhì)量濃度為20 μg·L-1的儲備液。混勻，15 min后使用。每管加入500 μL Calibrator Diluent RD510后，對儲備液依次進(jìn)行對倍稀釋。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為20，10，5，25，125，0625，0313 μg·L-1。只含有Calibrator Diluent RD510作為0 μg·L-1。

223Substrate solution配制

顯色劑A和顯色劑B等體積混合后避光保存。使用前15 min內(nèi)配制。樣品稀釋：按照預(yù)實驗結(jié)果稀釋所有樣品（取10 μL樣品加入490 μL的Calibrator Diluent RD510進(jìn)行稀釋）。加樣：取出事先準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板，固定于板架上，每加入100 μL Assay Diluent RD134，然后每孔分別加入不同質(zhì)量濃度的對照品和樣本各100 μL，蓋上封板膜，室溫下，振動孵育 2 h。洗板：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)液體，用事先準(zhǔn)備好的洗液重復(fù)洗板4次，400 μL/孔。最后一次沖洗后在實驗臺上鋪幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下拍干孔內(nèi)殘余的液體。每孔加入Humam MMP9 Conjugate 200 μL，蓋上封板膜，在室溫下振動孵育 1 h；再次洗板；每孔加入Substrate Solution 200 μL，室溫下避光靜置30 min。每孔加Stop solution 50 μL，終止反應(yīng)（顏色由淡藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色）。測定：在終止反應(yīng)后30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取各孔的吸光度A，在540 nm波長處讀取各孔的A作為校正值。相減后得到校正后的A。計算：根據(jù)對照品濃度及A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個樣本的濃度。以對照品A對數(shù)為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定回歸方程Y=7076 98/[1+（X/91603 35）×（-0879 36）]+0033 26，R2=0997 8。

23IL6檢測

231材料

Elisa試劑盒（R&D公司），批號（lot）P123142；美國Bioteck Eon全自動酶標(biāo)儀。

232溶液配制

試劑盒4 ℃保存，使用前恢復(fù)至室溫。待測樣品-80 ℃保存，使用前融化至室溫，充分混勻后使用。洗液：用超純水按照1∶10進(jìn)行稀釋。對照品配制：用超純水溶解Humman IL6標(biāo)準(zhǔn)品，得到質(zhì)量濃度為20 μg·L-1的儲備液?；靹颍?5 min后使用。每管加入500 μL Calibrator Diluent RD175后，對儲備液依次進(jìn)行稀釋。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為10，5，125，0625，0313，0156 μg·L-1，只含有Calibrator Diluent RD175作為0 μg·L-1。endprint

233酶聯(lián)免疫吸附法

Substrate solution配制：顯色劑A和顯色劑B等體積混合后避光保存。使用前15 min內(nèi)配制。樣品稀釋：按照預(yù)實驗結(jié)果稀釋所有樣品（取10 μL樣品加入490 μL的Calibrator Diluent RD175進(jìn)行稀釋）。加樣：取出事先準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板，固定于板架上，每加入100 μL Assay Diluent RD134，然后每孔分別加入不同濃度的對照品和樣品各100 μL，蓋上封板膜，室溫下，振動孵育 2 h。洗板：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)液體，用事先準(zhǔn)備好的洗液重復(fù)洗板6次，400 μL/孔。最后一次沖洗后在實驗臺上鋪幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下拍干孔內(nèi)殘余的液體。每孔加入Humam IL6 Conjugate 200 μL，蓋上封板膜，在室溫下振動孵育2 h；再次洗板；每孔加入Substrate Solution 200 μL，室溫下避光靜置60 min。每孔加入Amliter Solution 200 μL，室溫下避光靜置30 min。每孔加Stop solution 50 μL，終止反應(yīng)（顏色由淡藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色）。測定：在終止反應(yīng)后30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取各孔的吸光度A，在640 nm波長處讀取各孔的A作為校正值。相減后得到校正后的A。計算：根據(jù)對照品濃度及A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個樣本的濃度。以對照品A對數(shù)為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定直線回歸方程Y=0067X+0148 9，R2=0999 8。

24基因檢測

241全血DNA提取

采用QIAamp DNA Micro kit提取全血DNA提取。實驗通過ATL、蛋白酶K和AL在56 ℃下使細(xì)胞裂解，釋放出核內(nèi)的DNA，再通過柱純化技術(shù)回收釋放的DNA。取200 μL全血（不要取血塊）轉(zhuǎn)至一新的15 mL離心管中。加入300 μL的ATL buffer。加入20 μL蛋白酶K。加入300 μL的AL buffer，在Vortex上振蕩15 s，確保Mix充分混勻。56 ℃恒溫孵育30 min （若用Thermomixer，需要mix，若用水浴鍋孵育則需要每5 min左右手動搖勻1次） 。孵育后取出樣品，待降到室溫后加入200 μL的無水乙醇（4 ℃或-20 ℃冰凍），Vortex 15 s，室溫靜置3 min。

242DNA純度檢測

吸取DNA溶液2 μL，在紫外線分光光度儀上測定樣品在230，260，280 nm波長處的吸光度A；DNA純度=A260/A280。純度均達(dá)標(biāo)A260/A280﹥18，A260/A230>20。

243DNA檢測方法

2431儀器與試劑5417R低溫臺式離心機(jī)（Eppendorf），PTC200 PCR儀（BIORAD），DYY8C電泳儀（北京六一儀器廠），UVIV紫外分析儀（北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所），ABI 3730XL型DNA測序儀（Applied Biosystems），Ex Taq DNA聚合酶（Takara）。

2432引物設(shè)計根據(jù)NCBI網(wǎng)站上提供的標(biāo)準(zhǔn)參考序列，針對MTHFR C677T的位點rs1801133軟件Primer Premier 50進(jìn)行引物設(shè)計。（S03210620F）rs1801133F：TGTGGGAGTTTGGAGCA，（S03210620R）rs1801133R：CTGATTTAAGCAGGATTTGT，743 bp；測序引物（S03210620F）rs1801133F1：CATCCCTCGCCTTGAACAG。

2433PCR擴(kuò)增條件按照2432確定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見表1。

2434PCR產(chǎn)物純化按照Millipore公司96純化板操作流程操作：向96純化板孔中加入100 μL ddH2O，取出PCR產(chǎn)物至96純化板中室溫靜置10 min，真空抽濾泵抽 10 min至抽干，向96孔純化板中加入40 μL ddH2O，室溫溶解10 min，取出對應(yīng)的孔中的純化產(chǎn)物至另一96孔PCR板中。

2435PCR產(chǎn)物序列測序測序反應(yīng)體系為2 μL Mix（Bigdye31，5× sequencing buffer，H2O），2 μL純化后的PCR產(chǎn)物，1 μL引物（5 mmol·L-1）。測序反應(yīng)程序為95 ℃ 15 s；95 ℃ 15 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 90 s，35個循環(huán)；終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在北京六合華大基因科技有限公司應(yīng)用Sanger測序法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，應(yīng)用Sequence Scanner軟件將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對找出突變位點。

25資料處理與統(tǒng)計方法

251資料處理

采用雙人雙錄方法將CRF獨立錄入Epidata軟件，對一錄和二錄數(shù)據(jù)進(jìn)行“差異性校驗”，如果前后2次錄入的數(shù)據(jù)有不一致之處，認(rèn)真核實紙質(zhì)CRF或其他原始記錄后一一修改數(shù)據(jù)，直至前后2次錄入的數(shù)據(jù)完全一致。

252統(tǒng)計方法

本研究選擇SPSS 210統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。所有的統(tǒng)計分析檢驗均采用雙側(cè)假設(shè)檢驗，假設(shè)檢驗水準(zhǔn)均取α=005，即P≤005將被認(rèn)為所作檢驗的差別有統(tǒng)計意義。數(shù)據(jù)統(tǒng)計描述與推斷的描述指標(biāo)和假設(shè)檢驗的原則如下：HardyWeinberg平衡定律檢驗入組患者遺傳是否平衡；計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢測，正態(tài)分布資料采用兩獨立樣本t檢驗，結(jié)果用±s表示；兩組間非正態(tài)資料采用MannWhitney U檢驗，3組間偏態(tài)資料行KruskalWallis H檢驗；運用卡方檢驗處理計數(shù)資料；兩變量之間相關(guān)性采用對應(yīng)分析，四變量之間相關(guān)性采用多重對應(yīng)分析。Logistic回歸模型分析痰濕質(zhì)與非痰濕質(zhì)、大動脈型與小動脈型患者發(fā)病危險因素。endprint

26技術(shù)路線圖

本研究對7家臨床單位納入的61例缺血性中風(fēng)病患者進(jìn)行資料、生物樣本采集，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)分析方法探究缺血性中風(fēng)病患者中醫(yī)體質(zhì)、中醫(yī)證候、炎癥相關(guān)蛋白（MMP9，IL6），MTHFR基因多態(tài)性特點，同時對其之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。研究技術(shù)路線見圖1。

3結(jié)果

31人口學(xué)資料分析

總病例61例，患者平均年齡為（6413±753）歲，最大年齡80歲，最小年齡47歲；其中男性患者45例，女性患者16例；既往患有高血壓41例；患有糖尿病患者18例；患有高血脂患者15例。

32中醫(yī)體質(zhì)分析分布情況

61例急性缺血性中風(fēng)病患者中，最常見中醫(yī)體質(zhì)類型是痰濕質(zhì)20例（33%），其余依次為血瘀質(zhì)11例（18%）、平和質(zhì)8例（18%）、氣虛質(zhì)8例（13%）、陰虛質(zhì)4例（7%）、陽虛質(zhì)4例（7%）等，見表2。

33中醫(yī)證候分布情況

61例急性缺血性中風(fēng)病患者中，最常見證型是風(fēng)痰瘀阻證30例（49%），其余依次為氣虛血瘀證11例（18%）、風(fēng)火上擾證7例（12%）、陰虛風(fēng)動證5例（8%）、風(fēng)痰火亢證3例（5%）等，見表2。

34證候與體質(zhì)的相關(guān)性分析

對應(yīng)分析法是由定性變量構(gòu)成的交互匯總表來揭示變量間的聯(lián)系的1種統(tǒng)計學(xué)方法，采用這個方法來初步探索缺血性中風(fēng)病患者證候分型與體質(zhì)分類之間互相分布中的關(guān)系。氣虛體質(zhì)患者發(fā)病后容易表現(xiàn)為氣虛血瘀證；痰濕質(zhì)、平和質(zhì)患者發(fā)病后易表現(xiàn)為風(fēng)痰瘀阻證，見圖2。

35蛋白、基因檢測

351風(fēng)痰瘀阻證、氣虛血瘀證患者M(jìn)MP9，IL6分布及其相關(guān)性比較

MMP9水平氣虛血瘀證患者（26386±117567）明顯高于風(fēng)痰瘀阻證患者（25719±167962），經(jīng)Z檢驗有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<005）；IL6水平風(fēng)痰瘀阻證患者（635±14734）明顯高于氣虛血瘀證患者（344±2246），經(jīng)Z檢驗有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<005）。

352MTHFR C677T基因多態(tài)分析

3521MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測應(yīng)用Sanger測序方法對例61例缺血性中風(fēng)病患者M(jìn)THFR C677T（位點rs1801133）進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示：61個樣本中，共檢測到雜合突變34例；純和突變15例；無突變12例，該基因位點突變率是未突變患者的408倍，見圖3～5。

3522男女患者基因型、等位基因HW遺傳平衡檢測男女患者基因型、等位基因檢測符合HW遺傳平衡，各組具有群體代表性，見表3。

3523體質(zhì)、證候與MTHFR基因型關(guān)系分析CT基因型患者發(fā)病后易表現(xiàn)為痰濕質(zhì)，見圖6。風(fēng)痰瘀阻證患者發(fā)病后其MTHFR C677T基因型易表現(xiàn)為TT基因型；陰虛動風(fēng)證患者發(fā)病后其MTHFRC677T基因型易表現(xiàn)為CT基因型，見圖7。

36體質(zhì)、證候、基因、炎癥相關(guān)蛋白四者之間關(guān)系

應(yīng)用多重對應(yīng)分析對體質(zhì)、證候、驗證相關(guān)蛋白、基因四者之間對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析，因?qū)?yīng)分析中的變量均為計數(shù)資料，MMP9，IL6為計量資料，根據(jù)其參考值范圍，將參考值范圍及小于參考值范圍的值設(shè)置為1，大于參考值范圍的值設(shè)置為2，由于MMP9水平均參考值范圍及小于參考值范圍，故不納入分析，各變量在2個維度上的區(qū)分程度，體質(zhì)、證候這2個變量在2個維度上的區(qū)分程度較好，MTHFR基因在第2維度上區(qū)分程度較好，IL6在兩維度上的區(qū)分程度均較差，見圖8。痰濕質(zhì)與風(fēng)痰瘀阻證之間有聯(lián)系，氣虛質(zhì)與氣虛血瘀證有聯(lián)系，見圖9。

4討論

41缺血性中風(fēng)病患者證候與體質(zhì)的關(guān)系

411風(fēng)痰瘀阻證是缺血性中風(fēng)病患者主要證候

對于缺血性中風(fēng)病成因，歷代醫(yī)家言論各有偏重。現(xiàn)代對其病因?qū)W的認(rèn)識已基本一致，認(rèn)為缺血性中風(fēng)是在氣血虧虛的基礎(chǔ)上，遇有勞倦內(nèi)傷、憂思惱怒、嗜食肥甘厚味、煙酒等誘因，日久可致臟腑陰陽失調(diào)，氣血逆亂，上沖犯腦，發(fā)為中風(fēng)，臨床以突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜、語言謇澀或失語為主癥的常見疾病[4]，多發(fā)于中、老年人。20世紀(jì)80年代，王永炎院士提出中風(fēng)病證候急癥以風(fēng)痰瘀血、痹阻絡(luò)脈、風(fēng)痰上擾、痰熱腑實多見，恢復(fù)期以氣虛血瘀為主。痰、瘀是中風(fēng)的病理基礎(chǔ)和主要治病因素，在病理上密切相關(guān)，兩者皆以虛為基礎(chǔ)，因虛生痰，因虛生瘀，痰瘀互生，痰和瘀往往相互膠著，而脂質(zhì)代謝與中醫(yī)的“痰瘀”密切關(guān)系。痰瘀互結(jié)，蘊(yùn)結(jié)于腦，毒邪內(nèi)生，損傷腦絡(luò)是缺血性中風(fēng)病的主要病理機(jī)制。對缺血性中風(fēng)病患者證型分布規(guī)律，楊牧祥等[5]研究顯示以氣虛、血瘀、痰阻為主；楊利等[6]對中風(fēng)病患者痰瘀證候分布和演變規(guī)律分析顯示，血瘀證和痰證貫穿于中風(fēng)病各個時期，且所占比例較高；中風(fēng)病恢復(fù)期患者以血瘀證、痰證常見。這一證候分布和演變規(guī)律提示，瘀血和痰濁在中風(fēng)病發(fā)病中占有重要地位，且貫穿于缺血性中風(fēng)病始終。因此，痰、瘀因素不容小覷。

412痰濕質(zhì)是缺血性中風(fēng)病患者主要體質(zhì)類型

古代，中醫(yī)就有“肥人多痰濕，肥人多中風(fēng)”之說，當(dāng)代醫(yī)家將缺血性中風(fēng)病病理因素歸納為虛、火、風(fēng)、痰、氣、血，個體到底是因何發(fā)病，則與患者個人體質(zhì)有密切的關(guān)系，但痰濁始終是最主要的病理因素。痰濕質(zhì)的患者多體胖少動，日久脈道澀而不利，痰濕質(zhì)之人，多嗜食肥甘或脾氣虧虛，脾失健運，氣滯痰阻，一旦邪氣相干，或動其伏痰，或邪隨痰化，痰氣交阻，進(jìn)一步澀滯脈道，阻其血氣而成瘀，“賊邪不瀉，或左或右，邪氣反緩，正氣即急，正氣引邪，唱僻不遂”而生風(fēng)。所以痰濕質(zhì)是缺血性中風(fēng)病發(fā)生時生痰、生疾、生風(fēng)形成的重要內(nèi)在基礎(chǔ)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性中風(fēng)病具有多危險因素、多發(fā)病機(jī)制，其發(fā)病與個體的先天遺傳因素和后天諸多因素均有相關(guān)性，且隨著危險因素的增多，其發(fā)病的可能性也增加，從而導(dǎo)致了該病臨床病因復(fù)雜，證型多變[7]。本研究亦證明了痰濕質(zhì)與缺血性中風(fēng)病具有顯著的相關(guān)性。且痰濕質(zhì)患者在體質(zhì)量、體重指數(shù)、腰圍、體質(zhì)得分方面均高于非痰濕質(zhì)患者，揭示了痰濕質(zhì)在缺血性中風(fēng)病中的體質(zhì)傾向，臨床中通過調(diào)治體質(zhì)預(yù)防缺血性中風(fēng)病時就可以更加有效的有針對性截斷其發(fā)病去路，防其生變，這對缺血性中風(fēng)病防治具有一定的參考作用。endprint

413缺血性中風(fēng)病患者體質(zhì)與證候關(guān)系

中醫(yī)認(rèn)為疾病的發(fā)生乃因陰陽失調(diào)，臟腑生理功能紊亂，心理失調(diào)產(chǎn)生的，是一個復(fù)雜的過程，但總體不外乎正邪相爭這一基本的矛盾斗爭過程。證候隨體質(zhì)轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化，體質(zhì)是產(chǎn)生病證異同的關(guān)鍵關(guān)鍵所在，診治原則必須從于體質(zhì)，體質(zhì)的特殊性決定著疾病發(fā)病后臨床證候類型的傾向性。“證”的特征中包含著體質(zhì)的特征[8]。體質(zhì)與證候關(guān)系密切，體質(zhì)辨證是中醫(yī)辨證論治的延伸，也是指導(dǎo)臨床辨證用藥的重要依據(jù)。自古代起，中醫(yī)一直遵循“辨體辨病辨證”相結(jié)合的診療模式，近幾年來由于只強(qiáng)調(diào)辨證論治，忽略、淡化辨體，致使臨床思維局限，理論覆蓋不全，診療水平下降。在此基礎(chǔ)上，王琦提出“辯體論治”思想。強(qiáng)調(diào)“治病求本， 體質(zhì)為本， 病證為標(biāo)”。張景岳在《景岳全書·卷之四十四烈集》中說“當(dāng)識因人因證之辨。蓋人者，本也；證者，標(biāo)也。證隨人見，成效所由。故當(dāng)以人為先，因證次之?！?/p>

研究顯示痰濕質(zhì)、平和質(zhì)患者發(fā)病后多表現(xiàn)為風(fēng)痰瘀阻證；氣虛質(zhì)患者發(fā)病后多表現(xiàn)為氣虛血瘀證；陰虛質(zhì)患者發(fā)病后易表現(xiàn)為陰虛動風(fēng)證。

痰濕質(zhì)、平和質(zhì)患者中風(fēng)痰瘀阻證患者居多。駱斌等[9]提出痰濕質(zhì)與缺血性中風(fēng)病密切相關(guān)。痰濕質(zhì)者，偏嗜肥甘厚味，脾氣虛弱，脾失健運，濕濁困脾，或脾氣虧虛，氣血不足，外感風(fēng)邪，乘虛入體，氣虛無力行血，血液運行瘀滯，風(fēng)痰瘀阻塞絡(luò)脈，形成風(fēng)痰瘀阻證。本次研究結(jié)果顯示，痰濕質(zhì)人群患有風(fēng)痰瘀阻證的占65%，對應(yīng)關(guān)系分析亦顯示痰濕質(zhì)與風(fēng)痰瘀阻證關(guān)系密切。平和體質(zhì)是指人的臟腑精氣平衡，無明顯體質(zhì)偏向。所謂“陰平陽秘，精神乃治”。其特點是正氣充足，不易發(fā)病，但并不意味著不發(fā)病，若情志刺激、飲食偏嗜，勞倦失常、感受寒邪等導(dǎo)致機(jī)體正氣虧虛，脈絡(luò)空虛，風(fēng)痰乘虛入中，滯于經(jīng)絡(luò)，發(fā)為中風(fēng)。

氣虛質(zhì)患者發(fā)病后易表現(xiàn)為氣虛血瘀證?！鹅`樞·天年》：“人生十歲，五是藏始定，血氣已通……二十歲，血氣始盛……六十，心氣始衰……”五十歲，肝氣始衰……六十歲，心氣始衰……七十歲，脾氣虛……八十歲，肺氣衰……九十歲，腎氣焦……百歲，五臟皆虛，神氣皆去，故形骸獨居而終矣?！标U釋了生命過程中，人體氣血的盛衰變化，隨著年齡增加，氣血日益虧虛。一項針對對老年人體質(zhì)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，氣虛者明顯增加[10]。老年患者氣血不足，絡(luò)脈空虛，風(fēng)邪襲表，衛(wèi)氣不足，不能固護(hù)肌表，溫煦之力差，更易致風(fēng)邪入侵，氣血痹阻經(jīng)脈，導(dǎo)致缺血性中風(fēng)病發(fā)生。李東濤等[11]研究顯示，在疾病演變過程中，氣虛質(zhì)患者多表現(xiàn)出氣虛血瘀證。而這與本研究具有一定相同之處。

陰虛質(zhì)患者發(fā)病后以陰虛動風(fēng)證患者居多。陰津具有化氣生血的功能，陰液是氣血盛衰和氣血正常運行的物質(zhì)基礎(chǔ)，陰液不足無力運行氣血?，F(xiàn)代人多偏嗜油膩、肥甘、炙烤之類食物，日久則易出現(xiàn)虛熱內(nèi)生，陰液耗傷，進(jìn)而導(dǎo)致脈道瘀滯，津液虧虛。陰虛患者，精血虧虛，水不涵木，陰不斂陽，肝陽浮越于外，陽氣化風(fēng)，氣血上沖犯腦。陰虛熱生于內(nèi)，灼傷津液，津液不足，筋脈不得滋養(yǎng)，發(fā)為中風(fēng)。萬海同等[12]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰生津方劑對血瘀證具有良好效果，亦從側(cè)面印證了陰虛易導(dǎo)致瘀血產(chǎn)生。

研究結(jié)果提示：體質(zhì)與證候之間有一定聯(lián)系。一定程度上證實了體質(zhì)是證候形成的前提和基礎(chǔ)。患者個體的體質(zhì)特點決定了證候類型，所以在臨床診療中，應(yīng)重視辨體與辨證的統(tǒng)一，因時、因地、因人制宜，通過掌握體質(zhì)與證候之間的關(guān)聯(lián)性，針對不同體質(zhì)，提高正氣，增強(qiáng)個體抗病能力，避免內(nèi)邪自生，達(dá)到未病先防的目的。此外，亦可根據(jù)體質(zhì)判斷證候的傾向和疾病的預(yù)后，安未受邪之地，防止疾病的進(jìn)一步演變。因此，研究體質(zhì)與證候的關(guān)聯(lián)性，可以更行之有效的預(yù)防缺血性中風(fēng)病的發(fā)生。

42缺血性中風(fēng)病患者證候與炎癥相關(guān)蛋白關(guān)系

隨著缺血性中風(fēng)病發(fā)病機(jī)制研究的深入，腦缺血早期的炎癥反應(yīng)及其損傷作用引發(fā)研究者高度關(guān)注，臨床試驗研究、動物模型研究均支持炎癥反應(yīng)參與缺血性腦損傷，炎性細(xì)胞因子作為重要的免疫遞質(zhì)，被認(rèn)為是其發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵媒介。有研究者發(fā)現(xiàn)，血清IL6濃度越高，動脈粥樣硬化發(fā)生的概率越大，并且IL6的含量隨著梗死病灶體積的擴(kuò)大而增高[13]。諸多研究認(rèn)為，IL6能夠刺激基質(zhì)金屬蛋白酶的合成，如IL6能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞釋放MMP1和MMP2U43，亦能增加MMP9和MMP13的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的功能[1417]。Dziedzic T等[18]研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后炎癥反應(yīng)增高，IL6水平明顯升高，可作為治療的靶點。

據(jù)相關(guān)研究顯示，不穩(wěn)定斑塊內(nèi)含有大量激活T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，在一定程度上證實了炎癥反應(yīng)在斑塊的破裂中起決定性作用[19]而動脈粥樣硬化斑塊是否脫落又是導(dǎo)致缺血性中風(fēng)病關(guān)鍵所在。MMP9能夠破壞血腦屏障、引起炎癥反應(yīng)、誘發(fā)性腦損傷和血管源性腦水腫。血腦屏障受損后，活化的白細(xì)胞通過破壞了的血腦屏障滲出到腦組織內(nèi)，釋放的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，能夠加快神經(jīng)元的凋亡，加重腦損害，是造成斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵酶，是影響斑塊穩(wěn)定性的重要因素[20]。Kalela等[21]研究發(fā)現(xiàn)隨著MMP9濃度升高，血管狹窄加重，提示MMP9可以作為動脈粥樣硬化及腦梗死等病情活躍的標(biāo)志物，并可作為隨訪指標(biāo)。MMP9能夠降解血管基膜，使內(nèi)皮通透性增加，白細(xì)胞、脂質(zhì)成分、細(xì)胞因子等侵入內(nèi)膜下，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。MMP9水平增高，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，易脫落形成栓子，是IS發(fā)生及再發(fā)的危險因素之一。

MMP9，IL6對缺血性中風(fēng)病患者損傷與中醫(yī)痰、瘀理論極其相似， MMP9，IL6與痰濁、瘀血之邪均為體內(nèi)代謝病理產(chǎn)物，作為致病因素又易引起廣泛的損害和多種病變；痰瘀結(jié)聚，日久不消，蘊(yùn)而化毒，痰瘀侵蝕血管，損傷血管的完整性，亦可會導(dǎo)致MMP9，IL6水平升高[22]。這與本研究顯示MMP9水平是痰濕質(zhì)患者高發(fā)缺血性中風(fēng)病的重要影響因素具有一定的相通之處。此外，本研究顯示缺血性中風(fēng)病風(fēng)痰瘀阻證患者M(jìn)MP9，IL6水平較其他證候高；大動脈型風(fēng)痰瘀阻證患者M(jìn)MP9，IL6水平明顯高于小動脈型患者。提示缺血性中風(fēng)病證候、亞型很可能受其含量變化影響。endprint

因此， MMP9，IL6失調(diào)可能對缺血性中風(fēng)病的發(fā)生及預(yù)后產(chǎn)生影響，人為調(diào)整MMP9，IL6有可能成為治療缺血性腦血管病的新途徑。探討IL6，MMP9水平與缺血性中風(fēng)病之間的關(guān)系，為早期預(yù)防缺血性中風(fēng)病的發(fā)生提供可靠依據(jù)，通過測定患者IL6，MMP9水平的高低，及時了解病情變化，指導(dǎo)臨床用藥，對提高患者的臨床療效與生存質(zhì)量，降低其發(fā)病率具有重要意義。

43MTHFR C677T基因多態(tài)性與缺血性中風(fēng)病關(guān)系

目前，關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性研究較為廣泛的是是位于MTHFR基因第4外顯子的CT突變，可造成其編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，引起MTHFR酶的活性降低，該酶的生物學(xué)活性下降促進(jìn)Hcy水平增高，而高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化的獨立危險因素[23]。大量研究證實MTHFR 677位T突變是導(dǎo)致HHcy最關(guān)鍵遺傳物質(zhì)。本研究中，劉丙立等[24]的研究結(jié)果顯示TT基因型Hcy濃度明顯高于其他2個基因型Hcy濃度，這與本研究結(jié)果一致。但其Hcy濃度比較顯示無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，這可能與本研究樣本量較小有關(guān)。本研究基因檢測結(jié)果顯示61例患者中，非突變CC基因型共12例，突變基因型TT，CT基因型共49例；突變基因型是非突變基因型的4倍，基因多態(tài)性對Hcy 的影響與MTHFR耐熱性及活性改變有關(guān)，有文獻(xiàn)報道[25]，TT型活性較正常下降50%～70%，而CT 型下降25%～30%，提示Hcy水平與MTHFR的基因型密切相關(guān)，此外，Hcy能夠促進(jìn)IL6，MMP9等炎癥因子合成，損傷血管內(nèi)皮，參與動脈粥樣硬化形成[2627]， 因此，MTHFR C677T基因位點突變可能導(dǎo)致缺血性中風(fēng)病發(fā)生。

431MTHFR C677T基因型與缺血性中風(fēng)病患者證候關(guān)系

痰濁與瘀血，皆屬于人體津血代謝失常的病理產(chǎn)物，津血同源，痰源于津，瘀本于血，津血在生理上同源，由此推論，痰瘀在病理上則具有相關(guān)性。氣血津液運行障礙，則水濕內(nèi)?；蜓轲觥Ｒ欢l件下二者在又可相互轉(zhuǎn)化，相兼為病。瘀血內(nèi)停，瘀阻血脈，影響津液輸布，水液聚為痰濁；而痰凝不散也可繼發(fā)血瘀病證。因此，痰、瘀是中風(fēng)病病理基礎(chǔ)中的重要環(huán)節(jié)。本研究顯示風(fēng)痰瘀阻證是缺血性中風(fēng)病高發(fā)證候類型，風(fēng)痰瘀阻證患者發(fā)病后其MTHFR C677T基因型易表現(xiàn)為TT基因型。在一定程度上，推論TT基因型與缺血性中風(fēng)病風(fēng)痰瘀阻證病理基礎(chǔ)產(chǎn)生具有相關(guān)性，由此推斷，MTHFR突變TT基因型可能是缺血性中風(fēng)病風(fēng)痰瘀阻證高發(fā)的分子生物學(xué)機(jī)制之一，其不同基因型可能成為指導(dǎo)臨床辨證用藥的參考指標(biāo)之一。

432MTHFR C677T基因型與缺血性中風(fēng)病患者體質(zhì)關(guān)系

中醫(yī)認(rèn)為體質(zhì)決定個體對某種致病因素的易感性，本研究顯示痰濕質(zhì)是缺血性中風(fēng)病的高發(fā)體質(zhì)類型。痰濕質(zhì)的高分布頻率說明該體質(zhì)對缺血性中風(fēng)病具有較高的易感性。痰濕質(zhì)患者CC基因型3個，TT基因型14個，突變基因型發(fā)病風(fēng)險是非突變型患者的46倍，且痰濕質(zhì)與MTHFR C677T基因多態(tài)性對應(yīng)分析中顯示MTHFR C677T基因的CT基因型患者發(fā)病后易表現(xiàn)為痰濕質(zhì)，此外，Logistic回歸分析亦顯示飲酒、CT基因型是痰濕質(zhì)患者發(fā)病易感因素。MTHFR C677T位點突變的CT基因型使痰濕質(zhì)患者發(fā)病風(fēng)險增高。中醫(yī)認(rèn)為痰濕質(zhì)是體內(nèi)水液運行障礙，導(dǎo)致氣機(jī)、血液運行不暢，損傷血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管病變與凝血異常，這些病理改變是缺血性中風(fēng)病發(fā)病關(guān)鍵因素，所以筆者認(rèn)為CT基因型可能與痰濕質(zhì)病理機(jī)制具有相關(guān)性，MTHFR C677T位點的突變，產(chǎn)生的CT基因型可能是痰濕質(zhì)高發(fā)缺血性中風(fēng)病的分子生物學(xué)機(jī)制之一[2829]。

體質(zhì)與MTHFR基因多態(tài)性分析顯示CT基因型發(fā)病后易表現(xiàn)為痰濕質(zhì)，而在證候?qū)用鎰t表現(xiàn)為陰虛動風(fēng)證。體質(zhì)具有相對穩(wěn)定性，而證候具有動態(tài)性，痰濕質(zhì)乃因臟臟功能失調(diào)，水液運化障礙，水濕內(nèi)停，聚濕成痰，痰濕內(nèi)蘊(yùn)，現(xiàn)在社會生活節(jié)奏快，壓力大，長期精神緊張，或煩勞過度，易致痰郁化熱，灼傷陰液，耗傷陰津，且本病患者多位中老年人，本身陰液不足，陰不制陽，陽亢化風(fēng)，氣血上逆，猝然發(fā)病。

44缺血性中風(fēng)病體質(zhì)、證候、炎癥相關(guān)蛋白、MTHFR基因多態(tài)性的關(guān)系

本研究應(yīng)用多重對應(yīng)分析對缺血性中風(fēng)病患者體質(zhì)、證候、炎癥相關(guān)蛋白、MTHFR基因多態(tài)性四者之間的關(guān)系進(jìn)行分析顯示痰濕質(zhì)與風(fēng)痰瘀阻證之間有聯(lián)系，氣虛質(zhì)與氣虛血瘀證之間有聯(lián)系，證候、體質(zhì)與驗證相關(guān)蛋白以及MTHFR基因多態(tài)性之間關(guān)系較弱，究其原因，可能與本研究樣本量較小有一定關(guān)系，因而對于體質(zhì)、證候、炎癥相關(guān)蛋白、MTHFR基因多態(tài)性之間關(guān)系需在大樣本前瞻性研究基礎(chǔ)上加以驗證。

SNP是人群中分布最為廣泛的一種基因多態(tài)，是中醫(yī)辨證的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，從疾病相關(guān)基因多態(tài)性分布層面出發(fā)研究不同證型IS發(fā)病機(jī)制，為臨床證候的診斷提供分子生物學(xué)依據(jù)，對于探討缺血性中風(fēng)病發(fā)病機(jī)制具有重要作用。本研究初步探究缺血性中風(fēng)病證候、中醫(yī)體質(zhì)與MTHFR基因型之間的相關(guān)性，由于本研究樣本量較小，其結(jié)果可能有一定的偏差，在未來研究中將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步探討缺血性中風(fēng)病證候、體質(zhì)、基因多態(tài)性之間關(guān)系。

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[責(zé)任編輯張燕]endprint