設(shè)計(jì)空間法研究龍血竭酚類提取物的精制工藝

張建 張欣 畢宇安 徐桂紅 黃文哲 王振中 蕭偉

[摘要]運(yùn)用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念，采用“設(shè)計(jì)空間”方法優(yōu)化龍血竭酚類提取物的精制工藝。首先將龍血素B、7，4′二羥基黃酮含量及其轉(zhuǎn)移率、總干膏收率等5個(gè)指標(biāo)做為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），采用PlackettBurman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）為堿濃度、堿倍量和堿溶溫度。再采用BoxBehnken設(shè)計(jì)建立CQA和CPP間的數(shù)學(xué)模型，方差分析顯示模型P均小于005，失擬值均大于005，可以較好的描述CQA和CPP之間的關(guān)系。設(shè)定龍血素B、7，4′二羥基黃酮含量及其轉(zhuǎn)移率、總干膏收率5個(gè)指標(biāo)的控制限度，通過(guò)Monte Carlo仿真法計(jì)算獲得基于概率的設(shè)計(jì)空間并驗(yàn)證。結(jié)果表明，優(yōu)化后的純化方法能夠保證龍血竭酚類提取物精制工藝穩(wěn)定，有助于提高酚類提取物批次間質(zhì)量均一性，為生產(chǎn)自動(dòng)化控制提供數(shù)據(jù)支撐。

[關(guān)鍵詞]龍血竭酚類提取物； 精制工藝； 關(guān)鍵工藝參數(shù)； 關(guān)鍵質(zhì)量屬性； 設(shè)計(jì)空間

Studying on purification technology of Resina Draconis phenol

extracts based on design space method

ZHANG Jian1，3， ZHANG Xin2，3， BI Yuan2，3， XU Guihong2，3， HUANG Wenzhe2，3， WANG Zhenzhong2，3， XIAO Wei1，2，3*

（1. College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

3. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process Newtech for Chinese Medicine， Lianyungang 222001， China）

[Abstract]The "design space" method was used to optimize the purification process of Resina Draconis phenol extracts by using the concept of "quality derived from design" （QbD） The content and transfer rate of laurin B and 7，4'dihydroxyflavone and yield of extract were selected as the critical quality attributes （CQA） PlackettBurman design showed that the critical process parameters （CPP） were concentration of alkali， the amount of alkali and the temperature of alkali dissolution Then the BoxBehnken design was used to establish the mathematical model between CQA and CPP The variance analysis results showed that the P values of the five models were less than 005 and the mismatch values were all greater than 005， indicating that the model could well describe the relationship between CQA and CPP Finally， the control limits of the above 5 indicators （content and transfer rate of laurine B and 7，4'dihydroxyflavone， as well as the extract yield） were set， and then the probabilitybased design space was calculated by Monte Carlo simulation and verified The results of the design space validation showed that the optimized purification method can ensure the stability of the Resina Draconis phenol extracts refining process， which would help to improve the quality uniformity between batches of phenol extracts and provide data support for production automation control

[Key words]Resina Draconis phenol extracts； refining process； critical process parameters； critical quality attributes； design space

龍血竭酚類提取物為中藥5類新藥龍血通絡(luò)膠囊的原料藥，具有活血化瘀通絡(luò)之功效，可用于中風(fēng)病經(jīng)絡(luò)（輕中度腦梗死）恢復(fù)期血瘀證。其有效部位總酚主要包括查耳酮類、黃酮類、黃烷類、色原酮類、茋類及簡(jiǎn)單酚類[1]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、活血、止血、抗細(xì)菌、真菌、改變血液流變學(xué)等藥理作用，其中7，4′二羥基黃酮、龍血素B具有抗血栓、抗血瘀、抗凝血、鎮(zhèn)痛多重功效[2]。endprint

由于龍血竭酚類提取物中酚類化合物與雜質(zhì)間溶解度和pKa等性質(zhì)接近，總酚和雜質(zhì)組分復(fù)雜（已指認(rèn)出18種化合物[3]），對(duì)其溶解度的影響因素多且存在交互作用，難以通過(guò)單因素等簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)或者正交試驗(yàn)獲得所有參數(shù)的合理范圍，所以其精制工藝一直是工業(yè)生產(chǎn)控制的難點(diǎn)。

目前，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）的理念正推動(dòng)中藥制劑生產(chǎn)模式的轉(zhuǎn)變[4]，認(rèn)為只有應(yīng)用“正確”的過(guò)程才能生產(chǎn)出“優(yōu)質(zhì)”的產(chǎn)品[5]。在ICH Q8中，設(shè)計(jì)空間被定義為：可以確保產(chǎn)品質(zhì)量的輸入變量（例如原材料屬性）和工藝參數(shù)之間的多維結(jié)合與相互作用。在設(shè)計(jì)空間之內(nèi)的操作不稱為工藝變更，設(shè)計(jì)空間之外的操作則視為工藝變更[6]。

QbD理念采用的設(shè)計(jì)空間法能夠提供穩(wěn)健生產(chǎn)的工藝參數(shù)范圍，確保產(chǎn)品質(zhì)量的一致性，目前已用于水提、醇沉、水沉和柱色譜等工藝的參數(shù)優(yōu)化[711]。本文以龍血竭酚類提取物為研究對(duì)象，運(yùn)用QbD理念優(yōu)化龍血竭酚類提取物精制工藝，建立關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性間的數(shù)學(xué)模型，通過(guò)Monte Carlo仿真法計(jì)算獲得基于概率的設(shè)計(jì)空間并進(jìn)行驗(yàn)證。

1材料

Ultimate 3000高效液相色譜儀，DAD紫外檢測(cè)器（德國(guó)Thermo Fisher公司）；Mettler XP6電子分析天平（瑞士Mettler公司）；Mettler AE240電子分析天平（瑞士Mettler公司）；Sartorius BSA 224SCW型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；MilliQ Academic純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；H1659臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；K250DB型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

龍血素B（批號(hào)111558201407，供含量測(cè)定用）、7，4′二羥基黃酮（批號(hào)111787201002，供含量測(cè)定用）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈（色譜純，美國(guó)天地公司）、甲酸（色譜純，ROE Scientific公司）、氫氧化鈉（南京化學(xué)試劑股份有限公司）、無(wú)水乙醇（南京化學(xué)試劑股份有限公司）、鹽酸（南京化學(xué)試劑股份有限公司）、水為超純水，其余試劑均為分析純。

龍血竭干膏由龍血竭提取、濃縮、干燥制得（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司）。

2方法

21龍血竭酚類提取物精制工藝

取龍血竭干膏20 g，加入一定濃度氫氧化鈉溶液中攪拌溶解，濾液用稀鹽酸調(diào)pH，沉淀干燥，粉碎，即得。

22分析方法及方法學(xué)驗(yàn)證

221混合對(duì)照品溶液的制備取7，4′二羥基黃酮、龍血素B對(duì)照品適量，精密稱定，加80%乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為3884，5088 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液，即得。

222供試品溶液的制備取龍血竭酚類提取物，混勻，研細(xì)，取約05 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入80%乙醇適量，超聲（250 W，40 kHz）提取30 min，放冷，定容至刻度，搖勻，即得。

223色譜條件Kromasil 1005 C18色譜柱（46 mm×250 mm， 5 μm），流動(dòng)相乙腈（B）01%甲酸水（C）溶液，梯度洗脫（0～30 min，22%～40% B；30～60 min，40%～48% B），體積流量10 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm（龍血素B定量測(cè)定）和325 nm（7，4′二羥基黃酮定量測(cè)定），柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL[1213]?；旌蠈?duì)照品和供試品的HPLC圖見圖1。

224標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍考察精密稱取龍血素B 302 mg，7，4′二羥基黃酮297 mg，以80%乙醇溶解并定容至5 mL量瓶，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度，逐倍稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度溶液。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制回歸曲線，計(jì)算回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

225加樣回收率樣品制備方法取同一供試品，研細(xì)，取約025 g，精密稱定，共稱取6份，置50 mL量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液（各指標(biāo)成分質(zhì)量濃度分別為7，4′二羥基黃酮405 mg·L-1、龍血素B 496 mg·L-1）5 mL，加入80%乙醇適量，

232回歸模型的建立根據(jù)PlackettBurman實(shí)驗(yàn)篩選出的關(guān)鍵工藝參數(shù)，采用BoxBehnken設(shè)計(jì)研究建立龍血竭酚類提取物精制過(guò)程的關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性之間的數(shù)學(xué)模型。各因素和相應(yīng)水平見表3，具體條件見表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)由DesignExpert 80（美國(guó)StatEase公司）完成。

3結(jié)果與討論

31酚類提取物含量測(cè)定分析方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)本研究樣品的實(shí)際含量，對(duì)文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果分別為龍血素B：Y=9559X-5048，r=0999 9，線性范圍1890～6047 mg·L-1；7，4′二羥基黃酮：Y=18679X+4873，r=0999 7，線性范圍1859～5948 mg·L-1。加樣回收率結(jié)果為龍血素B、7，4′二羥基黃酮平均回收率分別為9967%，1009%，RSD均小于26%，證明該分析方法準(zhǔn)確、可靠，可用于本研究中酚類化合物含量測(cè)定。

32關(guān)鍵工藝參數(shù)的篩選

關(guān)鍵工藝參數(shù)篩選見表2。首先對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Y1～Y5）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[1416]，然后通過(guò)多元線性回歸建立工藝參數(shù)和指標(biāo)之間的定量模型，見公式（1）。

Y=a0+∑5i=1axiXi（1）

其中a0為常數(shù)項(xiàng)，Xi為工藝參數(shù)，ai為參數(shù)Xi對(duì)指標(biāo)Y的偏回歸系數(shù)。然后將各偏回歸系數(shù)的絕對(duì)值加權(quán)求和。多元線性回歸計(jì)算由DesignExpert 80（美國(guó)StatEase公司）完成。各指標(biāo)相應(yīng)的偏回歸系數(shù)及決定系數(shù)見表5。結(jié)果顯示5個(gè)模型的R2在0864～0956，表明各個(gè)模型均能較好的描述工藝參數(shù)對(duì)指標(biāo)成分的影響。endprint

為了簡(jiǎn)化計(jì)算，假設(shè)所有指標(biāo)成分的重要性相同，在計(jì)算各工藝參數(shù)偏回歸系數(shù)的絕對(duì)值之和時(shí)，將所有指標(biāo)模型中的偏回歸系數(shù)權(quán)重均設(shè)為1，即表5中偏回歸系數(shù)絕對(duì)值大小表征各個(gè)工藝參數(shù)對(duì)每個(gè)指標(biāo)成分的影響。其中偏回歸系數(shù)絕對(duì)值之和排列順序?yàn)椋簤A溶溫度>堿倍量>堿濃度>pH>酸沉溫度，由此可知堿溶溫度、堿倍量和堿濃度是龍血竭酚類提取物精制過(guò)程的關(guān)鍵工藝參數(shù)。

33回歸模型的分析

331模型的建立及分析關(guān)鍵工藝參數(shù)與關(guān)鍵質(zhì)量屬性之間的數(shù)學(xué)模型采用下式計(jì)算，見公式（2）。

y=b0+∑3i=1biXi+∑3i=1bjX2j+∑2i=1∑3j=i+1bijXiXj（2）

其中，b0為常數(shù)項(xiàng)，bi，bj，bij為偏回歸系數(shù)。采用逐步回歸法簡(jiǎn)化方程，模型移入或移除特定項(xiàng)的P設(shè)定為010。逐步回歸采用DesignExpert 80（美國(guó)StatEase公司）計(jì)算。BoxBehnken結(jié)果見表4，采用二次多項(xiàng)式模型對(duì)CQA（Y1， Y2， Y3， Y4， Y5）及相應(yīng)的CPP（A， B， C）分別進(jìn)行擬合，模型的偏回歸系數(shù)、R2和P結(jié)果見表6。

5個(gè)模型的擬合決定系數(shù)R2均大于093，說(shuō)明模型能解釋大部分變異，響應(yīng)值的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，具有很好的預(yù)測(cè)能力。方差分析結(jié)果顯示P均小于005，模型具有顯著性；失擬值均大于005，實(shí)驗(yàn)誤差不顯著，說(shuō)明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合的情況較好，各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型函數(shù)化。

方差結(jié)果分析以Y2（7，4′二羥基黃酮含量）、Y5（干膏收率）為例，見表7，8。A， B和C對(duì)Y2和Y5有顯著影響，其中Y2在回歸分析時(shí)AB， AC， BC的P均小于005，說(shuō)明A， B， C之間存在交互作用。

332響應(yīng)面分析以Y2（7，4′二羥基黃酮含量）、Y5（干膏收率）為例來(lái)說(shuō)明指標(biāo)成分的含量、干膏收率隨堿濃度、堿倍量、堿溶溫度變化而呈現(xiàn)的規(guī)律。

7，4′二羥基黃酮含量等高線圖見圖2，結(jié)果表明堿濃度越低，堿倍量越低，堿溶溫度越低，7，4′二羥基黃酮含量就越高。

干膏收率的等高線圖見圖3，結(jié)果表明堿濃度越高，堿倍量越高，堿溶溫度越低堿溶酸沉后干膏收率就越高。

34設(shè)計(jì)空間的確立及驗(yàn)證

采用模擬重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的 Monte Carlo法計(jì)算設(shè)計(jì)空間，由MODDE軟件（Umetrics公司）自編程序進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量要求設(shè)定5個(gè)指標(biāo)下限值，計(jì)算出設(shè)計(jì)空間。關(guān)鍵質(zhì)量屬性可接受范圍及達(dá)標(biāo)概率，見表9，運(yùn)用Monte Carlo法計(jì)算獲得基于概率的設(shè)計(jì)空間，見圖4。

堿溶溫度在55～60 ℃下設(shè)計(jì)空間形狀大致相同，所以只展示55 ℃的設(shè)計(jì)空間；圖4中顏色由綠至紅的漸變表示響應(yīng)值失敗概率由05%逐漸增大。為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)空間的準(zhǔn)確性，在設(shè)計(jì)空間內(nèi)外各選3個(gè)點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，6個(gè)點(diǎn)分別表示為V1，V2，V3，V4，V5，V6，結(jié)果見表10。從驗(yàn)證結(jié)果可知，預(yù)測(cè)值和實(shí)際值接近，模型預(yù)測(cè)性好，因此在設(shè)計(jì)空間內(nèi)操作可以保證工藝的穩(wěn)健性。

4結(jié)論

本文為解決龍血竭酚類提取物中酚類成分的純化工藝問(wèn)題，運(yùn)用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念，采用“設(shè)計(jì)空間”方法優(yōu)化龍血竭酚類提取物精制工藝。利用PlackettBurman設(shè)計(jì)和偏回歸系數(shù)法，研究發(fā)現(xiàn)堿濃度、堿倍量、堿溶溫度為關(guān)鍵工藝參數(shù)；再采用BoxBehnken設(shè)計(jì)和逐步回歸法，建立了CQA和CPP的數(shù)學(xué)模型；最后運(yùn)用Monte Carlo法計(jì)算出龍血竭酚類提取物精制工藝的設(shè)計(jì)空間，并通過(guò)了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

酚類化合物由于結(jié)構(gòu)差異，擁有不同的pKa，因此在不同pH溶液中，具有不同的溶解度。龍血竭酚類提取物精制即是通過(guò)有效成分與雜質(zhì)溶解度的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)龍血竭總酚的純化。本文通過(guò)尋找關(guān)鍵工藝參數(shù)、建立CQA和CPP間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型、建立設(shè)計(jì)空間的方法有效地解決了這個(gè)問(wèn)題，找到合適的設(shè)計(jì)空間，提高了工藝過(guò)程的穩(wěn)健性和靈活性，為探索酚類化合物的純化工藝提供了有益的參考。優(yōu)化后的純化方法能夠保證龍血竭酚類提取物精制工藝穩(wěn)定，有助于提高批次間質(zhì)量均一性，為生產(chǎn)自動(dòng)化控制提供數(shù)據(jù)支撐。

[參考文獻(xiàn)]

[1]劉芳， 戴榮繼， 鄧玉林， 等. 龍血竭化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥房， 2010， 21（15）：1437.

[2]何書平 血竭的藥理研究[J]. 中國(guó)藥房， 2008， 19（254）：1912.

[3]秦建平， 李家春， 吳建雄，等. 基于UPLC結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的龍血竭指紋圖譜研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40（6）：1114.

[4]徐冰， 史新元， 吳志生，等. 論中藥質(zhì)量源于設(shè)計(jì)[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2017， 42（6）：1015.

[5]陳彬華， 文彬 QbD理念在藥品研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)量控制過(guò)程中的應(yīng)用[J]. 上海醫(yī)藥， 2008， 9（10）：446.

[6]徐冰， 史新元， 喬延江，等. 中藥制劑生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)空間的建立[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2013， 38（6）：924.

[7]Gong X， Li Y， Chen H， et al. Design space development for the extraction process of Danhong injection using a Monte Carlo simulation method[J]. PLoS ONE， 2015， 10（5）：e0128236.

[8]Gong X， Zhang Y， Pan J， et al. Optimization of the ethanol recycling reflux extraction process for saponins using a design space approach[J]. PLoS ONE， 2014， 9（12）：e114300.

[9]魏海龍， 賀亮， 甘慶軍，等. 茯苓菌絲體多糖徑向流色譜分離參數(shù)優(yōu)化[J]. 浙江林業(yè)科技， 2011， 31（2）：1.

[10]郝吉福， 王建筑， 郭豐廣，等. 基于BoxBehnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化龍血竭固體脂質(zhì)納米粒的制備[J]. 中成藥， 2011， 33（10）：1713.

[11]許之麟， 黃文華， 龔行楚，等. 設(shè)計(jì)空間法優(yōu)化黨參一次醇沉工藝[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40（22）：4411.

[12]秦建平， 吳建雄， 李家春， 等. 不同產(chǎn)地龍血竭中5種成分的HPLC法測(cè)定[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床， 2013， 28（4）：547.

[13]秦建平， 林夏， 潘有智，等. 基于指紋圖譜分析和多成分同時(shí)定量的龍血通絡(luò)膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J]. 中草藥， 2015， 46（20）：3028.

[14]沈金晶， 龔行楚， 潘堅(jiān)揚(yáng)，等. 基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念的金銀花水提液石灰乳沉淀工藝優(yōu)化研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2017， 42（6）：1074.

[15]嚴(yán)斌俊， 郭正泰， 瞿海斌，等. 丹紅注射液醇沉關(guān)鍵工藝參數(shù)篩選方法[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2013， 38（11）：1672.

[16]劉爽悅， 沈金晶， 李文龍，等. 3種關(guān)鍵工藝參數(shù)辨識(shí)方法的比較研究[J]. 中草藥， 2016， 47（18）：3193.

[責(zé)任編輯孔晶晶]endprint