青海蠶豆中原花青素和左旋多巴的含量測定和品種間差異的比較

申士富，錢 靜，劉 廷，李俊松，趙永貴，狄留慶

(1南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210046； 2江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，南京 210046；3青海源興工貿(mào)有限公司，西寧 810000)

青海蠶豆中原花青素和左旋多巴的含量測定和品種間差異的比較

申士富1，2，錢 靜1，2，劉 廷1，2，李俊松1，2，趙永貴3，狄留慶1，2

(1南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210046；2江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，南京 210046；3青海源興工貿(mào)有限公司，西寧 810000)

目的：建立青海蠶豆中左旋多巴和原花青素含量測定方法，測量22批樣品的含量。方法：采用紫外分光光度法測量原花青素的含量，檢測波長為554nm。采用HPLC法檢測蠶豆中L-多巴含量：色譜柱：漢邦ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)，流動相：甲醇-0.1mol/L冰醋酸溶液(5∶95)；流速：0.8 mL/min；測定波長：280 nm；柱溫：25/3℃；進樣量：20μL。結(jié)果：原花青素在75～375μg/mL范圍內(nèi)線性良好、L-多巴在75～375μg/mL范圍內(nèi)線性良好。結(jié)論：青海蠶豆中左旋多巴和原花青素含量測定方法穩(wěn)定可靠。

青海蠶豆；左旋多巴；原花青素；紫外分光光度法；HPLC

青海蠶豆由于地產(chǎn)青海省，海拔高，有籽粒大而飽滿、顏色乳白、無蟲(豆象)的特點，被國際市場公認為世界上最好的蠶豆之一[1]。研究表明，蠶豆中含有的原花青素(OPC)具有抗氧化、抑菌、抗癌和抗突變等生理活性[2]。青海蠶豆因其含有左旋多巴(L-DOPA)而被用作治療帕金森癥、高血壓、腎功能衰竭和肝硬化的膳食補充劑。本文采用UV、HPLC等分析方法分別測定青海蠶豆中原花青素、左旋多巴的含量，對開展青海蠶豆的品質(zhì)評價及等級區(qū)分具有重要的應用價值。

1 儀器試劑

TU-1810型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；美國Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)(2998 PDA檢測器)；漢邦ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；Anke TGL-16C高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；電子分析天平(BP211D型德國Satrorius公司，F(xiàn)A1204B上海精密科學有限公司)；Milli-Q Synthesis 108超純水儀(美國密理博公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)。

試藥與試劑：乙醇(分析純，南京化學試劑股份有限公司，批號150827677E)；甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)；乙酸(分析純，國藥化學試劑有限公司)；鹽酸(分析純，揚州滬寶化學試劑有限公司)；左旋多巴(中國食品藥品檢定研究院，批號：100170-200303)；正丁醇(江蘇強盛功能化學股份有限公司，批號20140102)；十二水硫酸鐵銨(國藥集團化學試劑有限公司，批號20141014)。青海12號蠶豆、13號蠶豆以及馬牙蠶豆，均由青海源興工貿(mào)有限公司提供，樣品來源信息見表1。

2 結(jié)果與方法

2.1 不同品種蠶豆的皮及子葉中原花青素類物質(zhì)的含量測定

2.1.1供試品溶液的制備 取蠶豆皮粉1g，精密稱定，置于錐形瓶中，加50mL 50%乙醇溶液，稱重，60℃水浴1h，待冷卻后補足失重，離心(6 000r/min，7min)取上清即為供試品溶液[3]。

2.1.2對照品溶液的制備 取原花青素對照品適量，精密稱定，加50%乙醇制成0.994 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3檢測波長的選擇 分別精密吸取供試品溶液及適宜濃度的對照品溶液2mL，加入5%鹽酸正丁醇溶液15mL及2%硫酸鐵銨溶液0.5 mL，100±2℃水浴加熱40 min，冷卻后于190～800 nm波長范圍內(nèi)測定，波長選擇為554nm(圖1、圖2)。

表1 青海蠶豆品種及產(chǎn)地信息

圖1 原花青素紫外吸收光譜圖

圖2 供試品紫外吸收光譜圖

2.1.4線性關系考察 配制系列濃度原花青素對照品溶液(75、150、225、300、375μg/mL)，按2.1.3項下方法顯色，以2.1.1項下空白溶液作對照，在554nm處測定吸光度(A)值，得原花青素A值對質(zhì)量濃度的回歸方程Y=0.002 3X+0.006 1，r=0.999 1，結(jié)果表明，原花青素在75～375μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.1.5精密度考察

取原花青素對照品溶液(225μg/mL)按2.1.3項下方法顯色，以2.1.1項下空白溶液作對照，在554 nm處測定吸光度(A)值，連續(xù)測定6次，結(jié)果RSD為1.67%。

2.1.6重復性試驗 取蠶豆皮粉樣品(湟源縣和平鄉(xiāng)和平村)，按2.1.1項下方法制備供試品溶液6份，用50%乙醇稀釋2倍后按2.1.3項下方法顯色，以2.1.1項下空白溶液作對照，在554 nm處測定吸光度(A)值，結(jié)果其平均含量為18.74 mg/g，RSD為1.43%。

2.1.7穩(wěn)定性試驗 取蠶豆皮粉樣品，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，用50%乙醇稀釋2倍后按2.1.3項下方法顯色，以2.1.1項下空白溶液作對照，分別于0、5、10、15、20、30、40、60 min時在554 nm處測定吸光度(A)，RSD為2.53%。

2.1.8加樣回收率試驗 取蠶豆皮粉樣品，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，用50%乙醇稀釋2倍，與225μg/mL原花青素對照品溶液按體積比1∶1混合，制備6份供試品溶液，按2.1.3項下方法顯色，以2.1.1項下空白溶液作對照，在554 nm處測定吸光度(A)值，回收率在97.58%～101.37%之間，RSD為1.50%(表2)。

表2 原花青素加樣回收率結(jié)果

2.1.9結(jié)果 青海蠶豆中原花青素含量測定結(jié)果見表3。

2.2 不同品種蠶豆中左旋多巴的含量測定

2.2.1色譜條件[4]色譜柱：漢邦ODS-2(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相：甲醇-0.1mol/L冰醋酸溶液(5∶95)；流速：0.8 mL/min；測定波長：280 nm；柱溫：25℃；進樣量：20μL。

2.2.2提取方法考察 取青海蠶豆粉末(互助縣東山鄉(xiāng))0.5g，精密稱定，加入酸性乙醇20mL，分別采用回流加熱1h、超聲提取1h以及冷浸法提取24 h，再于4 000r/min離心10 min，取上清液5.0 mL于蒸發(fā)皿中60℃水浴上揮干，加入0.1mol/mL的HAc溶液(含有0.05%L-半胱氨酸作為抗氧劑)復溶，定容至2mL，經(jīng)14 000 r/min離心7 min，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

按2.5.1項下色譜條件進樣，測定，結(jié)果冷浸、回流、超聲所得分別為442.12、924.56、241.81峰面積均值/mg(n=3)，回流提取的左旋多巴含量最高，因此，選擇加熱回流提取[5]。

表3 青海蠶豆中原花青素含量測定結(jié)果(n=3)

2.2.3提取溶劑考察 取經(jīng)打粉后的蠶豆粉末0.5g，精密稱定，分別加入鹽酸乙醇溶液、醋酸乙醇溶液、鹽酸溶液和醋酸溶液各20mL，回流加熱1h后，再于4 000 r/min離心10 min，取上清液5.0 mL于蒸發(fā)皿中60℃水浴上揮干，加入0.1mol/mL的HAc溶液(含有0.05%L-半胱氨酸作為抗氧劑)復溶，定容至2mL，經(jīng)14 000 r/min離心7 min，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得[5]。

按2.2.1項下色譜條件進樣，每種提取方式制備3份，記錄左旋多巴峰面積，按每mg樣品量計算面積值，結(jié)果分別為834.0、285.8、287.7、197.6峰面積均值/mg(n=3)。鹽酸乙醇溶液提取的左旋多巴含量最高，因此，選擇鹽酸乙醇溶液。

2.2.4提取時間考察 取經(jīng)打粉后的蠶豆粉末0.5g，精密稱定，加入鹽酸乙醇溶液20mL，分別回流加熱0.5、1、1.5h后，再于4 000 r/min離心10 min，取上清液5.0 mL于蒸發(fā)皿中60℃水浴上揮干，加入0.1mol/mL的HAc溶液復溶(含有0.05%L-半胱氨酸作為抗氧劑)，定容至2mL，經(jīng)14 000 r/min離心7 min，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[5]。

按2.5.1項下色譜條件進樣，測定，記錄左旋多巴峰面積，按每mg樣品量計算面積值，結(jié)果分別為817.5、924.6、573.4峰面積均值/mg(n=3)，提取時間為1h的左旋多巴含量最高。

2.2.5供試品溶液制備 取經(jīng)打粉后的蠶豆粉末0.5g，精密稱定，加入鹽酸乙醇溶液(9mL鹽酸加85%乙醇至1 000mL)20mL，回流加熱1h后，再于4 000 r/min離心10 min，取上清液5.0 mL于蒸發(fā)皿中60℃水浴上揮干，加入0.1mol/mL的HAc溶液復溶(含有0.05%L-半胱氨酸作為抗氧劑)，定容至2mL，經(jīng)14 000r/min離心7 min，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.6對照品溶液的制備及空白溶液的制備 精密稱取左旋多巴對照品適量，加鹽酸溶液配成每1mL含405.8μg的溶液，作為對照品貯備液。取0.1mol/mL的HAc溶液溶液(含有0.05%L-半胱氨酸作為抗氧劑)10mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為空白對照液。

圖3 對照品溶液(A)、空白溶液(B)、供試品溶液(C)

2.2.7方法學考察 (1)系統(tǒng)適應性試驗及專屬性考察 按照“ 2.2.1”項下色譜條件，分別量取 “2.2.5”及“2.2.6”項下溶液各20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，詳見圖3。結(jié)果，對照品與樣品溶液主峰的保留時間一致，空白溶液在左旋多巴相應位置處無色譜峰出現(xiàn)，不干擾左旋多巴的含量測定。理論塔板數(shù)以左旋多巴峰計算不低于2 000。(2)精密度試驗：取同一份標準品溶液，重復進樣6次，記錄所測各組分峰面積，結(jié)果左旋多巴色譜峰面積的RSD(n=6)為0.16%，儀器精密度良好。(3)線性試驗：精密吸取405.8μg/mL的左旋多巴對照品溶液適量，依次稀釋1、2、4、8、16、32、64、128倍，過0.45μm濾膜，分別吸取20μL，用高效液相色譜，依法測定，以對照品濃度X(μg/mL)為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。左旋多巴的線性方程為Y=19 618X+7 753.3，線性范圍為3.17～405.8μg/mL，r =0.999 9。(4)重復性試驗：取湟源縣申中鄉(xiāng)申中村馬牙蠶豆，按2.2.5供試品溶液制備方法，制備5份，進樣，測定。結(jié)果表明，左旋多巴平均含量為292.00μg/g，RSD(n=5)為2.80%，表明重復性良好。(5)穩(wěn)定性試驗：取同一份供試品溶液，進樣20μL，分別在0、2、4、6、12、24h進樣1次，記錄所測成分峰面積。結(jié)果左旋多巴色譜峰峰面積的RSD(n=6)為0.69%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。(6)加樣回收試驗：取已知含量樣品蠶豆粉 6份，每份約2.5g，精密稱定，加入左旋多巴對照品64.93mg，按照“2.5.4”項下制備供試品溶液。結(jié)果左旋多巴的平均加樣回收率為99.15%(n=6)，RSD為2.41%，表明具有良好的準確性(表4)。

表4 加樣回收試驗

2.2.8樣品含量測定 取9批樣品，按2.2.5項下方法制備，依法進樣測定，結(jié)果見表5。

表5 各產(chǎn)地蠶豆中左旋多巴含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)果與討論

(1)原花青素測定結(jié)果表明，三個品種的蠶豆原花青素含量均值由高到低分別為青海13號22.77mg/g、青海12號22.23mg/g、馬牙蠶豆20.05mg/g，差距不大?；ブh西山鄉(xiāng)的蠶豆原花青素的含量較高為28.15 mg/g，大通縣塔兒溝鎮(zhèn)塔兒溝村的蠶豆原花青素含量最低為17.95mg/g。(2)左旋多巴測定結(jié)果表明，青海13號320.7μg/g>青海12號332.03μg/g>馬牙蠶豆263.41μg/g，20批樣品中左旋多巴的含量在115.3～533.81μg/g。大通縣塔兒溝鎮(zhèn)塔兒溝村的蠶豆左旋多巴含量最低為115.3μg/g，互助縣西山鄉(xiāng)的蠶豆左旋多巴含量最高為533.81μg/g。(3)蠶豆皮中含有豐富的左旋多巴，但目前，我國蠶豆在加工過程中有豆皮、豆莢等副產(chǎn)物，一般都不能加以利用[7]。另外，目前常采用炒焙、油炸等加工方式，大多經(jīng)過高溫。文獻報道左旋多巴不穩(wěn)定，易氧化，故測了加工后的左旋多巴的含量。取加工(煮熟取蠶豆皮、去皮的蠶豆、帶皮蠶豆)和未加工的申中鄉(xiāng)申中村馬牙蠶豆適量進行測定，含量分別為生蠶豆(去皮)115.94μg/g、熟蠶豆(去皮)44.47μg/g、生蠶豆皮208.95μg/g、熟蠶豆皮41.48μg/g、生蠶豆292.00μg/g、熟蠶豆52.89μg/g。結(jié)果表明，左旋多巴高溫下明顯不穩(wěn)定。(4)在考察左旋多巴穩(wěn)定性的實驗中左旋多巴含量下降較快。文獻報道L-DOPA具有較強的還原性，在空氣中變黑，是導致左旋多巴含量下降的原因。因此加入抗氧化劑。(5)蠶豆皮中左旋多巴和原花青素的含量較豐富。樣品中原花青素的含量14.92～28.15 mg/g，左旋多巴的含量在115.3～550.13μg/g，與相關文獻中的結(jié)果一致[6]。對于蠶豆的質(zhì)量標準的建立和進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。◇

[1]胡軍.左旋多巴的植物資源[J]. 中國野生植物，1987(3)：25-29.

[2]張宏.蠶豆皮原花青素制備及其抗氧化活性研究[D]. 武漢工業(yè)學院，2012.

[3]鄭開斌，李愛萍，曹奕鴦，等.蠶豆花左旋多巴液相色譜檢測方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012，28(3)：688-690.

[4]曹奕鴦.蠶豆左旋多巴(L-DOPA)含量的研究[D].福建農(nóng)林大學，2010.

[5]宋江峰，李大婧，劉春泉.發(fā)芽蠶豆左旋多巴超聲強化提取及其動力學過程[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2012(19)：248-254.

[6]Ben-Shlomo Y，Marmot MG.Survival and cause of death in a cohort of patients with parkinsonism：possible clues to aetiology[J]. Neurol Neurosurg Psychiatry，1995，58(37)：293-299.

[7]傅翠真，李安智，張豐德，等.食用豆種質(zhì)資源品質(zhì)鑒定及營養(yǎng)特性[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，1994(5)：33-38.

Determination of Oligomeric Proanthocyanidins and Levodopa in Broad Bean from Qinghai Province and Comparison of Differences Among Varieties

SHEN Shi-fu1，2，QIAN Jing1，2，LIU Ting1，2，LI Jun-song1，2, ZHAO Yong-gui3,DI Liu-qing1，2

(1College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China;2Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of Chinese Materia Medica，Nanjing 210046，China;3Qinghai Yuanxing Industry & Trade Co.，Ltd.，Xining 810000,China)

【Objective】 To establish a method for determination of levodopa and oligomeric proanthocyanidins (OPC)content for measuring 22 batches of samples.【Method】 Detection wavelength of UV spectrophotometric method for OPC was 554nm.HPLC method was established to detect the content of L-dopa in broad bean：column：hanbon ODS-2 (250mm * 4.6mm，5 μm)，mobile phase：methanol -0.1mol/L acetic acid solution (5∶95)；flow rate 0.8 mL/min；detection wavelength 280 nm；column temperature 25℃；sample size 20μL.【Result】 The results showed that the range of 75～375μg/mL was good linear for OPC and L-DOPA.【Conclusion】 The two methods were stable and reliable.The content of the 20 batches of samples were determined，and the changes of the content before and after processing were compared.

broad bean；levodopa(L-DOPA)；oligomeric proanthocyanidin(OPC)；Ultraviolet Spectrophotometry；HPLC

江蘇省重點研發(fā)專項資金項目(項目編號：BF2016004)；青海省星火計劃項目(項目編號：2014-NS-306)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(項目編號：PAPD)；江蘇省“青藍工程”創(chuàng)新團隊支持計劃資助(項目編號：QLP)。

申士富(1991— )，男，在讀碩士，研究方向：中藥藥劑學。

狄留慶(1964— )，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥藥劑學。

(責任編輯 唐建敏)