鈣離子感受蛋白STIM1與Orai1在鈣敏感受體介導(dǎo)鈣內(nèi)流及NO生成中的相互作用*

王臘梅， 鐘 華， 唐 娜， 龐麗娟， 張春軍， 何 芳△

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2病理生理教研室， 3病理教研室， 新疆 石河子 832002)

鈣離子感受蛋白STIM1與Orai1在鈣敏感受體介導(dǎo)鈣內(nèi)流及NO生成中的相互作用*

王臘梅1, 2， 鐘 華1, 2， 唐 娜1, 2， 龐麗娟1, 3， 張春軍1, 2， 何 芳1, 2△

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院1新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2病理生理教研室，3病理教研室， 新疆 石河子 832002)

目的研究Ca2+感受蛋白[基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)與鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Orai1)]在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)鈣敏感受體(CaSR)介導(dǎo)的鈣內(nèi)流和一氧化氮(NO)生成中的相互作用。方法將CaSR激動(dòng)劑精胺[鈣池操縱性鈣通道(SOC)和受體操縱性鈣通道(ROC)均激活]單用或與ROC模擬劑12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)+CaSR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex 231(激活ROC、阻斷SOC)、蛋白激酶C(PKC)抑制劑Ro 31-8220和PKCα/β1選擇性抑制劑Go 6976(激活SOC、阻斷ROC)聯(lián)合孵育HUVECs；利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HUVECs中STIM1和Orai1的蛋白表達(dá)和共定位；免疫共沉淀法檢測(cè)STIM1和Orai1之間的相互作用；取2～3代HUVECs隨機(jī)分為特異性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(shSTIM1+shOrai1組)、空質(zhì)粒組(vehicle-STIM1+vehicle-Orai1組)和未轉(zhuǎn)染組(control組)，將3組細(xì)胞分別加入上述4組不同藥物刺激，采用熒光探針Fura-2/AM檢測(cè)HUVECs中Ca2+濃度的變化，NO熒光探針DAF-FM DA負(fù)載方法同步檢測(cè)HUVECs中NO生成的變化。結(jié)果STIM1和Orai1蛋白表達(dá)共定位于胞漿，與control組相比，加入Calhex 231+TPA、Ro 31-8220和Go 6976刺激后，STIM1和Orai1在胞漿中的定位均減少，且二者的相互作用均減弱；在4種不同處理因素作用下，shSTIM1+shOrai1組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和NO凈熒光強(qiáng)度均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論STIM1與Orai1以二元復(fù)合物的形式共同調(diào)節(jié)CaSR，并通過激活SOC和ROC介導(dǎo)鈣內(nèi)流及NO生成。

基質(zhì)相互作用分子1； 鈣釋放激活鈣通道蛋白1； 鈣敏感受體； 一氧化氮

鈣離子(calcium ion，Ca2+)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子，鈣庫的排空可以激活胞外Ca2+的內(nèi)流，這種鈣內(nèi)流的方式被稱作鈣池操縱性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry，SOCE)，在傳遞細(xì)胞信息方面非常重要。血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)Ca2+內(nèi)流可釋放舒張因子如一氧化氮(nitric oxide，NO)以維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。血管內(nèi)皮功能障礙是多種心血管疾病的共同病理機(jī)制。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中，精胺(spermine)可通過激活鈣敏感受體(Ca2+-sensing receptor，CaSR)而引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular Ca2+concentration，[Ca2+]i)升高及NO的生成。

在生理?xiàng)l件下，鈣池操縱性鈣通道(store-operated calcium calcium channels，SOC)和受體操縱性鈣通道(receptor-operated channels，ROC)作為非興奮細(xì)胞介導(dǎo)的胞外Ca2+內(nèi)流的主要途徑，兩者以協(xié)同的方式參與了CaSR激活，進(jìn)而引發(fā)持續(xù)Ca2+內(nèi)流和NO生成[1-2]。本課題組近期的研究逐步揭示了SOCE的分子機(jī)制，確定了瞬時(shí)受體電位通道1(transient receptor potential channel 1，TRPC1)、基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)和鈣釋放激活鈣通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1，Orai1)均為參與CaSR經(jīng)SOC和ROC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和NO生成過程中的關(guān)鍵分子組件，以SOCE復(fù)合體的形式對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生作用[3]。亦有研究表明組成SOC亞基的Orai1、TRPC1和STIM1關(guān)鍵分子組件和相互作用模式在不同細(xì)胞類型有所不同。如在Jurkat細(xì)胞Orai1是構(gòu)成SOC必需的分子組件，敲低TRPC1或TRPC3則不影響SOC和ROC。本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上，試圖闡明STIM1與Orai1在鈣敏感受體介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流和NO生成中的相互作用模式，有助于學(xué)者以介導(dǎo)鈣活動(dòng)相關(guān)機(jī)制為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選，并為心血管疾病防治提供新思路。

材 料 和 方 法

1實(shí)驗(yàn)材料

健康孕婦剖宮產(chǎn)的新鮮臍帶來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科(性別和體重不限)，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和個(gè)人知情同意。

2主要試劑

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Sciencell)；蛋白酶抑制劑(Calbichem)；G418(Biosharp)；去內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega)；LipofectamineTM2000、Fura-2/AM與Opti-MEM(Invitrogen)；shRNA(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒和DAF-FM DA(NO熒光探針)(Beyotime)；ECL發(fā)光試劑盒(ThermoBiosharp)；鼠抗人STIM1單克隆抗體和鼠抗人Orai1多克隆抗體(Abcam)；鼠抗β-actin單克隆抗體(Santa Cruze)；II 抗(Protein Tech)；其余均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

3主要儀器

CX-102型超凈工作臺(tái)(安徽蚌埠凈化設(shè)備廠)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；Ca2+成像系統(tǒng)FV300、倒置熒光顯微鏡IX-70和激光共聚焦顯微鏡FV300(Olympus)。

4方法

4.1HUVECs的培養(yǎng) 依據(jù)參考文獻(xiàn)的方法[4-5]培養(yǎng)HUVECs，在無菌條件下取健康孕產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)胎兒的新鮮臍帶。采用胰酶消化法用含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基(添加100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素混合液)原代培養(yǎng)HUVECs，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。

重組質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，基因轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)合文獻(xiàn)[6]的方法，取對(duì)數(shù)生長期的HUVECs接種于6孔板(取2個(gè)6孔板鋪板)，待細(xì)胞融合至85%時(shí)，將STIM1 shRNA與Orai1 shRNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染至HUVECs中。實(shí)驗(yàn)中1～3孔為轉(zhuǎn)染STIM1 shRNA和Orai1 shRNA的HUVECs，即實(shí)驗(yàn)組(shSTIM1+shOrai1組);4～6孔為空質(zhì)粒組(vehicle-STIM1+vehicle-Orai1組);7～9孔為未做任何轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞，即空白對(duì)照組(control組)。分別在轉(zhuǎn)染后的24 h、48 h和72 h于熒光顯微鏡下觀察GFP熒光。同時(shí)采用G418進(jìn)行逐步篩選獲得穩(wěn)定克隆。

4.2免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HUVECs中STIM1與Orai1的蛋白表達(dá) 取于玻片上生長24 h 的HUVECs，PBS溶液沖洗細(xì)胞，冰甲醇固定20 min后，0.5% Triton-PBS透化10～15 min，封閉后輕甩去封閉液，滴加相應(yīng) I 抗混合液，4 ℃孵育(選用濕盒保持玻片濕度)。次日洗片后滴加對(duì)應(yīng)熒光標(biāo)記的 II 抗混合液(1∶100稀釋)，室溫避光孵育1 h。洗片，1 mg/L DAPI 室溫避光孵育15 min復(fù)染細(xì)胞核。洗片，滴加防淬滅劑后于熒光顯微鏡下觀察STIM1與Orai1的蛋白表達(dá)情況。陰性對(duì)照組以PBS代替相應(yīng) I 抗孵育，鏡下觀察并記錄結(jié)果。

4.3免疫共沉淀法檢測(cè)HUVECs中STIM1與Orai1的相互作用 (1)STIM1多克隆抗體沉淀(正向)：將2～3代HUVECs接種于放有圓形玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞達(dá)85%融合，與藥物孵育20 min，加入裂解液充分裂解后，12 000×g離心 3～5 min，取上清，加入 I 抗，4 ℃搖床過夜，按1∶10體積比加 50%的 Protein G Agarose，4 ℃ 搖床上混勻10 min后，1 000 r/min，4 ℃離心15 min，吸除上清液，不能吸掉的Protein G Agarose 用裂解液(500 μL)洗滌沉淀5次，洗滌時(shí)離心條件和吸除上清液要求同上。完成最后1次洗滌后去上清，加入SDS蛋白上樣緩沖液中，混勻煮沸5 min， 200×g離心 3 min ，取上清進(jìn)行SDS-PAGE，用Orai1作為I抗(1∶1 000)進(jìn)行Western blot分析。(2)Orai1單克隆抗體沉淀(反向)：用STIM1作為I抗(1∶1 000)進(jìn)行Western blot分析，方法同(1)。實(shí)驗(yàn)中用非特異性鼠IgG代替 I 抗沉淀作為對(duì)照。

4.4HUVECs中Ca2+濃度的熒光測(cè)定 首先將聯(lián)合轉(zhuǎn)染的HUVECs接種于放有圓形玻片的小培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合至85%以上后，分別加入CaSR激動(dòng)劑精胺及ROC模擬劑(TPA)+CaSR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex 231、PKC抑制劑Ro 31-8220與PKCα/β1選擇性抑制劑Go 6976。聯(lián)合轉(zhuǎn)染48 h后將Fura-2/AM與含鈣液以1∶499的比例混合后加入，37 ℃孵育細(xì)胞后并去酯化處理[6]。激光共聚焦監(jiān)測(cè)熒光的動(dòng)態(tài)變化,分析得出兩激發(fā)光的熒光強(qiáng)度比值的變化 (即Δratio)以反映[Ca2+]i。

4.5HUVECs中NO濃度的熒光測(cè)定 HUVECs處理同4.4。聯(lián)合轉(zhuǎn)染48 h后按1∶2 000比例加入DAF-FM DA熒光探針稀釋液，37 ℃孵育細(xì)胞后室溫避光條件下，在細(xì)胞層面實(shí)時(shí)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱[6]，并通過Ingenuity Pathway Analysis軟件進(jìn)行分析。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1免疫熒光技術(shù)觀察HUVECs中STIM1與Orai1的蛋白表達(dá)

在激光共聚焦顯微鏡下胞核的DNA染料(DAPI)陽性著色顯示為藍(lán)色熒光，STIM1的陽性著色為紅色熒光，Orai1的陽性著色為綠色熒光，橙黃色熒光則代表紅色和綠色熒光的疊加熒光。結(jié)果可見正常對(duì)照組HUVECs中STIM1和 Orai1蛋白的表達(dá)呈陽性，兩者共定位于胞漿，HUVECs分別經(jīng)Calhex 231+TPA+精胺+Ca2+、Ro 31-8220+精胺+Ca2+和Go 6976+精胺+Ca2+刺激后鏡下的熒光示STIM1和Orai1在胞漿中的定位均減少，兩者的結(jié)合也明顯減少，見圖1。

2免疫共沉淀法檢測(cè)HUVECs中STIM1與Orai1的相互作用

各處理組正向STIM1/Orai1或反向Orai1/STIM1分別與靜息狀態(tài)下的正向STIM1/Orai1或反向Orai1/ STIM1的相對(duì)比值的百分?jǐn)?shù)表示STIM1和Orai1相互作用的強(qiáng)弱。與control組和spermine+Ca2+組比較，Calhex 231+TPA+spermine+Ca2+組、Ro 31-8220+spermine+Ca2+組和Go 6976+spermine+Ca2+組中STIM1和Orai1的相互作用減弱(P<0.05)，見圖2。

3不同處理因素對(duì)聯(lián)合轉(zhuǎn)染后HUVECs中[Ca2+]i和NO的生成的影響

3.1聯(lián)合轉(zhuǎn)染STIM1與Orai1使精胺誘導(dǎo)的HUVECs中[Ca2+]i和NO生成減少 采用脂質(zhì)體法將shSTIM1與shOrai1同時(shí)轉(zhuǎn)染HUVECs，48 h后用G418進(jìn)行穩(wěn)篩，加入精胺處理細(xì)胞，與對(duì)照組(control組，即精胺+Ca2+組)及空質(zhì)粒組(精胺+Ca2++vehicle-STIM1+vehicle-Orai1組)相比，實(shí)驗(yàn)組(精胺+Ca2++shSTIM1+shOrai1組)的[Ca2+]iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值均明顯降低(P<0.05)。同時(shí)沉默STIM1與Orai1基因，能夠使CaSR經(jīng)SOC和ROC介導(dǎo)的[Ca2+]i和NO生成減少，見圖3。

3.2聯(lián)合轉(zhuǎn)染STIM1與Orai1使TPA+Calhex231誘導(dǎo)的HUVECs中[Ca2+]i和NO生成減少 同3.1的方法加入TPA+Calhex231處理細(xì)胞，與對(duì)照組(Calhex 231+TPA+精胺+Ca2+組)及空質(zhì)粒組(Calhex 231+TPA+精胺+Ca2++vehicle-STIM1+vehicle-Orai1組)相比，實(shí)驗(yàn)組(Calhex 231+TPA+精胺+Ca2++shSTIM1+shOrai1組)中[Ca2+]iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值均明顯降低(P<0.05)。這說明同時(shí)沉默STIM1與Orai1基因能夠使CaSR經(jīng)ROC介導(dǎo)的[Ca2+]i和NO生成減少，見圖4。

Figure 1. The protein expression of STIM1 and Orai1 in HUVECs were detected by immunocytochemical. A1～A4: protein expression and immunofluoresence of Orail1 and STIM1 for nuclear in HUVECs stimulated by spermine； B1～B4， C1～C4 and D1～D4： protein expression and immunofluoresence of Orail1 and STIM1 stimulated by Calhex 231+TPA+spermine， Ro 31-8220+spermine and Go 6976+spermine， respectively； E1： blank control group； E2： negative control group (×60).

圖1免疫熒光檢測(cè)HUVECs中STIM1與Orai1的蛋白表達(dá)

3.3聯(lián)合轉(zhuǎn)染STIM1與Orai1使Ro 31-8220介導(dǎo)的的HUVECs中[Ca2+]i和NO生成減少 同3.1的方法加入PKC抑制劑Ro 31-8220處理細(xì)胞，與對(duì)照組(Ro 31-8220+精胺+ Ca2+組)及空質(zhì)粒組(Ro 31-8220+精胺+Ca2++vehicle-STIM1+vehicle-Orai1組)相比，實(shí)驗(yàn)組(Ro 31-8220+精胺+Ca2++shSTIM1+shOrai1組)中[Ca2+]iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值均明顯降低(P<0.05)。這說明同時(shí)沉默STIM1與Orai1基因能夠使CaSR經(jīng)SOC介導(dǎo)的[Ca2+]i和NO生成減少，見圖5。

Figure 2. The interaction between STIM1 and Orai1 examined by co-immunoprecipitation (Co-IP). A: positive Co-IP, Orai1 as a resistance； B: reverse Co-IP, STIM1 as a resistance； C: semi-quantity analysis of the interaction. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsspermine+Ca2+group.

圖2免疫共沉淀法檢測(cè)HUVECs中STIM1與Orai1的相互作用

Figure 3. The dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio (A～D) and NO fluorescence intensity (E～H) after spermine treatment in shSTIM1 and shOrai1 double transfected HUVECs. A and E: control group; B and F: vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group; C and G: shSTIM1+shOrai1 group. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsvehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group.

圖3精胺刺激HUVECs后STIM1與Orai1聯(lián)合干擾組Ca2+和NO熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化

Figure 4. The dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio (A～D) and NO fluorescence intensity (E～H) after Calhex 231+TPA treatment in shSTIM1 and shOrai1 double transfected HUVECs. A and E: control group; B and F: vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group; C and G: shSTIM1+shOrai1 group. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsvehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group.

圖4TPA+Calhex231刺激HUVECs后STIM1與Orai1聯(lián)合轉(zhuǎn)染組Ca2+和NO熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化

Figure 5. Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio (A～D) and NO fluorescence intensity (E～H) after Ro 31-8220 treatment in shSTIM1 and shOrai1 double transfected HUVECs. A and E: control group; B and F: vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group; C and G: shSTIM1+shOrai1 group. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsvehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group.

圖5Ro31-8220刺激HUVECs后STIM1與Orai1聯(lián)合轉(zhuǎn)染組Ca2+和NO熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化

3.4聯(lián)合轉(zhuǎn)染STIM1與Orai1使Go 6976作用的HUVECs中[Ca2+]i和NO生成減少 同3.1的方法加入PKCα/β1抑制劑Go 6976處理細(xì)胞，與對(duì)照組(Go 6976+精胺+ Ca2+組)及空質(zhì)粒組(Go 6976+精胺+Ca2++vehicle-STIM1+vehicle-Orai1組)相比，實(shí)驗(yàn)組(Go 6976+精胺+Ca2++shSTIM1+shOrai1組)中[Ca2+]iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值均明顯降低(P<0.05)。這說明同時(shí)沉默STIM1與Orai1基因，能夠使CaSR經(jīng)SOC介導(dǎo)的[Ca2+]i和NO生成減少，見圖6。

Figure 6. The dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio (A～D) and NO fluorescence intensity (E～H) after Go 6976 treatment in shSTIM1 and shOrai1 double transfected HUVECs. A and E: control group; B and F: vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group; C and G: shSTIM1+shOrai1 group. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsvehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group.

圖6Go6976刺激HUVECs后STIM1與Orai1聯(lián)合轉(zhuǎn)染中Ca2+和NO熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化

討 論

心腦血管疾病現(xiàn)已成為危害人類健康和致死的主要因素，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。隨著人們對(duì)STIMs與Orais生物學(xué)作用及機(jī)制深入研究，發(fā)現(xiàn)其在心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。如STIM1和Orai1作為SOCE的調(diào)節(jié)蛋白存在于多種細(xì)胞中[7]，Voelkers等[8]首次證實(shí)STIM1和Orai1均表達(dá)于心肌細(xì)胞，并且是TG 耗竭Ca2+庫后引發(fā)SOCE所必須的蛋白質(zhì)，STIM1基因沉默后，可降低舒張期[Ca2+]i及咖啡因誘發(fā)的肌漿網(wǎng)中Ca2+釋放。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)STIM1表達(dá)水平不變的情況下，當(dāng)應(yīng)用一些化學(xué)試劑使Orai1蛋白表達(dá)減少時(shí)，SOCE減弱且通過基因敲除技術(shù)分別敲除Orai1和STIM1基因，結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致SOCE作用減弱，提示SOCE作用的減弱與Orai1和(或)STIM1蛋白表達(dá)水平降低有直接關(guān)系[9]。大量文獻(xiàn)證實(shí)在不同細(xì)胞由TRPCs、STIMs和Orais三者之間形成的二元或三元復(fù)合物調(diào)節(jié)SOC或ROC介導(dǎo)的生理和病理生理功能。如在HEK293細(xì)胞株STIM1與Orai1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與細(xì)胞膜的結(jié)合處激活SOC[10]，在腎小球膜細(xì)胞TRPC1和TRPC4共同組成SOC功能亞基，并通過STIM1/TRPC4相互作用介導(dǎo)SOC激活[11]，在血小板TRPC6與Orai1和STIM1相互作用激活SOC[12]。在大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞研究證實(shí)血小板衍生生長因子依賴Orai1/STIM1-SOC介導(dǎo)了平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[13]，STIM1/Orai1構(gòu)成SOC過度激活參與了自發(fā)性高血壓腦卒中大鼠主動(dòng)脈血管明顯的收縮[14]。TRPCs、肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)和微管末端結(jié)合蛋白1(microtubule end-binding protein 1，EB1)等參與了SOC介導(dǎo)的SOCE，它們與STIMs和Orais構(gòu)成SOCE復(fù)合體[3]。Jardin等[15]在人血小板發(fā)現(xiàn)Orai1在介導(dǎo)TRPC1-STIM1相互作用及TRPC1形成鈣通道的激活模式(依賴SOC或ROC)中發(fā)揮重要作用。

課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明，在HUVECs中CaSR在介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流、eNOS活性和NO生成中起著重要作用[2]。Ziegelstein等[4]在人的主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中證實(shí)，在CaSR激動(dòng)劑精胺的刺激下，通過三磷酸肌醇和ryanodine受體敏感的鈣池釋放，可引起[Ca2+]i增加和NO生成，結(jié)果提示在此過程中可能有外鈣內(nèi)流的參與，且外鈣內(nèi)流涉及的鈣通道相關(guān)蛋白STIM1、Orai1作為其關(guān)鍵分子組件參與了CaSR激活引發(fā)持續(xù)Ca2+內(nèi)流和NO生成等相關(guān)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。然而STIM1與Orai1二者之間相互作用模式以及功能尚未闡明，因此在這一領(lǐng)域的研究工作也顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)免疫熒光技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HUVECs中，STIM1與Orai1共定位于胞漿，經(jīng)Calhex 231+ TPA +精胺+Ca2+、Ro 31-8220+精胺+Ca2+、Go 6976+精胺+Ca2+刺激后，鏡下熒光顯示STIM1與Orai1在胞漿中的定位均減少且相互作用減弱。為了闡明STIM1與Orai1在HUVECs中CaSR介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流及NO生成中的作用，實(shí)驗(yàn)將特異性的STIM1 shRNA與Orai1 shRNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染HUVECs，保證沉默基因有效抑制相關(guān)表達(dá)的同時(shí)，用精胺與HUVECs孵育激活SOC和ROC通路，發(fā)現(xiàn)在HUVECs中沉默STIM1與Orai1可抑制SOC和ROC通路介導(dǎo)的[Ca2+]i升高和NO生成。隨后分別用Calhex 231+TPA、Ro 31-8220和Go 6976處理細(xì)胞，在細(xì)胞外含Ca2+的情況下檢測(cè)HUVECs中[Ca2+]i與NO生成的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ca2+內(nèi)流和NO的生成過程中有SOC和(或)ROC參與，且在HUVECs中同時(shí)沉默STIM1與Orai1后對(duì)[Ca2+]i和NO生成均有抑制作用。最終證明STIM1與Orai1以二元復(fù)合物的形式作為SOC和ROC關(guān)鍵組件調(diào)節(jié)了CaSR途徑介導(dǎo)的鈣內(nèi)流和NO生成。

在血管系統(tǒng)中CaSR可通過增加[Ca2+]i調(diào)節(jié)NO的釋放和鉀通道激活，在調(diào)節(jié)血管張力及高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，而上述研究又為深入認(rèn)識(shí)血管系統(tǒng)中STIM1和Orai1調(diào)節(jié)CaSR功能的生理和病生理作用和機(jī)制提供了重要理論基礎(chǔ)。未來的研究將更多闡明在心血管系統(tǒng)的不同細(xì)胞中STIM1和Orai1的功能、寡聚化模式及調(diào)節(jié)機(jī)制，了解不同細(xì)胞中SOC和ROC的結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)機(jī)制之間的細(xì)微差別，進(jìn)而在分子水平實(shí)現(xiàn)對(duì)選擇性靶向作用治療臨床心血管疾病的防治提供一個(gè)新的途徑。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 宋延君)

InteractionbetweenSTIM1andOrai1incalcium-sensingreceptor-mediatedcalciuminfluxandnitricoxidegeneration

WANG La-mei1, 2, ZHONG Hua1, 2, TANG Na1, 2, PANG Li-juan1, 3, ZHANG Chun-jun1, 2, HE Fang1, 2

(1KeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseases,MinistryofEducation，2DepartmentofPathophysiology，3DepartmentofPhysiology,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China.E-mail:fangf2002shz@126.com)

AIM: To investigate the interaction of Ca2+-sensing proteins， stromal interaction molecule 1 (STIM1) and calcium release-activated calcium channel protein 1 (Orai1)， in Ca2+-sensing receptor (CaSR)-mediated extracellular Ca2+influx and production of nitric oxide (NO).METHODSHuman umbilical vein endothlial cells (HUVECs) were incubated with CaSR agonist spermine [activating store-operated calcium channels (SOC) and receptor-operated calcium channels (ROC)] alone or combined with CaSR negative allosteric modulator Calhex 231+ROC analogue TPA (activating ROC, blocking SOC), protein kinase C (PKC) inhibitor Ro 31-8220, or PKCα/β1 selective inhibitor Go 6976 (activate SOC, blocking ROC). The protein expression of STIM1 and Orai1 was determined by the method of immunofluorescence. The interaction between STIM1 and Orai1 was examined by co-immunoprecipitation. The second to third passages of HUVECs were divided into STIM1 and Orai1 short hairpin RNA group (shSTIM1+shOrai1 group), vehicle-STIM1+vehicle-Orai1 group and control group， and then incubated with the 4 different treatments above. The intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) was detected using the fluorescent Ca2+indicator Fura-2/AM. The production of NO was also determined by DAF-FM DA fluorescent probe.RESULTSThe protein expression of STIM1 and Orai1 was located in the cytoplasm. Compared with control group, the localization of STIM1 and Orai1 in the cytoplasm was reduced after the HUVECs were incubated with Calhex 231+TPA, Ro 31-8220 or Go 6976, and the interaction of STIM1 and Orai1 was decreased significantly. The [Ca2+]iand the net NO fluorescence intensity in shSTIM1+shOrai1 group were significantly reduced after the 4 different treatments (P<0.05).CONCLUSIONSTIM1 and Orai1 are components of SOC and ROC in store- and receptor-operated Ca2+entry and NO generation.

Stromal interaction molecule 1; Calcium release-activated calcium channel protein 1; Ca2+-sen-sing receptor; Nitric oxide

R363； R541

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.007

1000- 4718(2017)10- 1773- 08

2017- 03- 20

2017- 07- 18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31160239;No. 81160018)

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