酪酸梭菌代謝產(chǎn)物丁酸和氫氣對(duì)急性胃黏膜損傷的作用*

王金丹， 喬莞寧， 朱 靜， 付瑤陽(yáng)， 胡萬(wàn)里， 董人杰， 洪凱睿， 張佳麗， 王方巖△

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 浙江 溫州 325035)

酪酸梭菌代謝產(chǎn)物丁酸和氫氣對(duì)急性胃黏膜損傷的作用*

王金丹1， 喬莞寧2▲， 朱 靜2， 付瑤陽(yáng)2， 胡萬(wàn)里1， 董人杰2， 洪凱睿2， 張佳麗2， 王方巖2△

(溫州醫(yī)科大學(xué)1檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 浙江 溫州 325035)

目的前期研究表明酪酸梭菌對(duì)損傷的胃黏膜具有保護(hù)作用，但具體效應(yīng)物質(zhì)不明。本文通過(guò)檢測(cè)酪酸梭菌的主要代謝產(chǎn)物氫氣和丁酸對(duì)損傷胃黏膜的效應(yīng)，探究黏膜保護(hù)作用的具體機(jī)制。方法將雄性ICR小鼠通過(guò)乙醇灌胃誘導(dǎo)胃黏膜損傷，并以氫氣和丁酸分別進(jìn)行處理，觀測(cè)胃組織的大體變化和組織結(jié)構(gòu)損傷情況，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)炎癥因子白細(xì)胞介素12(IL-12)、Ras相關(guān)核蛋白1(RAN1)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的含量，采用免疫組化法觀測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量變化。結(jié)果胃組織大體觀測(cè)發(fā)現(xiàn)丁酸能夠保護(hù)胃黏膜，而氫氣不具有此作用；HE染色也提示丁酸能夠顯著改善乙醇造成的胃黏膜病理?yè)p傷。RT-qPCR則顯示所檢測(cè)炎癥因子IL-12、RAN1和MCP-1的表達(dá)量較模型對(duì)照組有顯著降低(P<0.01)。在丁酸組，Bax的表達(dá)量較模型組顯著減低(P<0.01)，而Bcl-2的含量卻明顯提高(P<0.01)。結(jié)論酪酸梭菌胃黏膜保護(hù)效應(yīng)的主要產(chǎn)物可能是丁酸而不是氫氣。丁酸能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，下調(diào)Bax/Bcl-2表達(dá)比例，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用。

丁酸； 氫氣； 急性胃黏膜損傷； 炎癥； 細(xì)胞凋亡

胃黏膜損傷是臨床上常見的消化系統(tǒng)疾病。幽門螺旋桿菌感染，使用非甾體抗炎藥物以及過(guò)量飲酒是其最為主要的致病原因。胃黏膜損傷不僅降低了患者的生活質(zhì)量并且容易癌變?，F(xiàn)有的治療手段雖能夠取得較好的短期療效[1]，但長(zhǎng)期來(lái)看，卻存在復(fù)發(fā)率高的嚴(yán)重不足。

本課題組之前的研究顯示酪酸梭菌對(duì)由阿司匹林[2]、應(yīng)激、幽門結(jié)扎以及乙醇[3-4]誘導(dǎo)的小鼠胃黏膜損傷均具有顯著的保護(hù)效果，本文則在以往研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其具體作用機(jī)制。酪酸梭菌能夠產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，但其中最為主要是丁酸和氫氣?，F(xiàn)有研究已證明丁酸和氫氣對(duì)炎癥及氧化相關(guān)的疾病均具有較為突出的治療或者預(yù)防效果。為了證實(shí)丁酸和氫氣是否為酪酸梭菌胃黏膜保護(hù)作用的具體效應(yīng)物質(zhì)，我們利用乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性胃黏膜損傷模型，通過(guò)丁酸和氫氣分別進(jìn)行干預(yù)，對(duì)胃組織的大體損傷和病理變化進(jìn)行分析，判斷其作用，并檢測(cè)炎癥因子及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，對(duì)內(nèi)在的具體機(jī)制進(jìn)行探索。

材 料 和 方 法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性ICR小鼠，體重25～30 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SCXK(浙)2010-0150。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組 將小鼠40只隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、模型組、丁酸組和氫氣組。

2.2給藥情況及動(dòng)物模型制備 丁酸組小鼠在造模前30 min以2 g/kg丁酸鈉的劑量進(jìn)行灌胃；氫氣組小鼠在造模前30 min以0.6 mL的飽和氫水灌胃；模型組則灌予相同體積的生理鹽水。禁食24 h后，以劑量為10 mL/kg的無(wú)水乙醇灌胃，1 h后即建立起乙醇灼燒性胃損傷模型[5]。

2.3標(biāo)本采集 在造模結(jié)束后，取胃組織，做大體觀察胃部黏膜面潰瘍狀況，一部分(n=4)用10%福爾馬林固定，用于HE染色，其余小鼠胃組織(n=6)凍存，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

2.4病理指標(biāo)的檢測(cè)及方法 (1) 潰瘍面積：將胃組織展開平置后，進(jìn)行掃描，獲得的圖像再用軟件Image-Pro Plus (IPP)6.0測(cè)量胃組織的總面積及出血潰瘍面積，并計(jì)算兩者的相對(duì)面積比例。(2)潰瘍抑制百分率：根據(jù)IPP軟件計(jì)算所得的潰瘍面積比值，依照以下公式進(jìn)行潰瘍抑制率百分率計(jì)算：潰瘍抑制率百分率(%)=(對(duì)照組潰瘍面積比例-給藥組潰瘍面積比例)/對(duì)照組潰瘍面積比例×100%。(3)胃組織病理檢測(cè)：將10% 甲醛固定的各組胃組織標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)脫水石蠟包埋，然后制成病理切片，切片厚度約為4～5 μm，HE染色在光鏡下觀察胃黏膜的組織學(xué)變化。

2.5RT-qPCR 取50～100 mg小鼠胃組織于離心管中，加入1 mL TRIzol試劑后充分勻漿，常規(guī)操作提取總RNA。使用核酸蛋白分析檢測(cè)RNA濃度及純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN，貨號(hào)KT201)說(shuō)明書合成樣品cDNA。以合成的cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，貨號(hào)RR820A)說(shuō)明書，在25 μL體系內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如表1。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s后采集熒光信號(hào)，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt計(jì)算出其相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2.6免疫組化實(shí)驗(yàn) 對(duì)Bcl-2和Bax進(jìn)行免疫組化檢測(cè)， I 抗?jié)舛韧ㄟ^(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。在常規(guī)抗體孵育清洗后，進(jìn)行DAB復(fù)染。用IPP 6.0軟件進(jìn)行圖像半定量分析，每張切片選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，測(cè)定各組小鼠胃黏膜Bax和Bcl-2陽(yáng)性目標(biāo)積分吸光度(A)值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SigmaPlot作圖分析，SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，方差齊性則采用Bonferroni法，方差不齊者用Dunnett’s T3法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1丁酸和氫氣對(duì)乙醇灼燒型胃潰瘍的胃黏膜大體形態(tài)的影響

為分析丁酸和氫氣的效果，我們觀察胃黏膜出血損傷程度，并通過(guò)IPP 6.0軟件計(jì)算潰瘍抑制率。乙醇造模后，小鼠胃黏膜呈現(xiàn)大面積的出血，并以沿血管分布為特征。有些胃壁有皺縮，出現(xiàn)條索狀變化，嚴(yán)重的出血位置甚至呈現(xiàn)黑色或暗紅色。丁酸明顯減輕了潰瘍出血損傷，潰瘍抑制率也顯著的提高，但是氫氣并未減輕胃黏膜的損傷，見圖1。

Figure 1. Macroscopic appearance of the gastric mucosa. A: normal group; B: model group; C: butyrate group; D: hydrogen group. Mean±SD.n=4.△△P<0.01vsnormal group;**P<0.01vsmodel group.

圖1各組小鼠胃黏膜掃描圖片

2丁酸對(duì)胃潰瘍病理變化的影響

從HE染色結(jié)果可以看出正常組的胃壁結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞形態(tài)正常；而模型組則出現(xiàn)了明顯的胃黏膜病理?yè)p傷，壞死的黏膜大量脫落，部分胃黏膜上皮出現(xiàn)缺損，腺體被破壞，腺腔內(nèi)出現(xiàn)了脫落的上皮細(xì)胞碎片，還出現(xiàn)了炎細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象；在使用丁酸后，胃黏膜損傷程度較模型組明顯縮小，黏膜上皮較完整連續(xù)，腺體的排列較整齊，未見明顯損傷，見圖2。

Figure 2. Histological assessment of acute gastric mucosal injury induced by ethanol (HE staining). A: normal group; B: model group; C: butyrate group.

圖2各組小鼠胃黏膜病理圖片

3丁酸對(duì)胃黏膜組織內(nèi)炎癥因子的影響

對(duì)胃黏膜組織進(jìn)行Rt-q RCR檢測(cè)炎癥因子表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組的白細(xì)胞介素12(interleukin 12，IL-12)、Ras相關(guān)核蛋白1(Ras-related nuclear protein 1, RAN1)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等多種炎癥細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)量均有顯著提高。而丁酸處理組的各炎癥細(xì)胞因子與模型組相比，其相對(duì)表達(dá)量則均有顯著降低(P<0.01)，見圖3。

4丁酸對(duì)胃組織Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，正常組 Bax 表達(dá)為弱陽(yáng)性，定位在胞漿，主要集中分布在黏膜層；模型組Bax的表達(dá)量為強(qiáng)陽(yáng)性，積分吸光度明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而丁酸組Bax的表達(dá)量明顯低于模型組，其Bax的積分吸光度值顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。并且我們發(fā)現(xiàn)丁酸能夠顯著上調(diào)Bcl-2的表達(dá)(P<0.01),見圖4。

Figure 3. The relative mRNA expression of inflammatory factors in different groups. A: normal group; B: model group; C: butyrate group. Mean±SD.n=6.△△P<0.01vsnormal group;**P<0.01vsmodel group.

圖3各組小鼠胃組織IL-12、RAN1和MCP-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量

Figure 4. The expression of Bax and Bcl-2 in different groups. A: normal group; B: model group; C: butyrate group. Mean±SD.n=4.△△P<0.01vsnormal group;**P<0.01vsmodel group.

圖4各組小鼠胃黏膜組織Bax和Bcl-2的表達(dá)情況

討 論

乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷，能夠復(fù)制較為典型的人類胃黏膜損傷的臨床表現(xiàn)，如胃黏膜的出血糜爛等，并且飲酒過(guò)多也是造成胃黏膜損傷的重要原因。因此，該模型常用于篩選胃黏膜保護(hù)作用物質(zhì)。我們前期的工作已證實(shí)酪酸梭菌對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用，本研究則進(jìn)一步探索該菌的具體效應(yīng)物質(zhì)。酪酸梭菌是益生菌，能夠產(chǎn)生氫氣、丁酸、維生素B、乳酸等多種對(duì)人體有益物質(zhì)，而其中產(chǎn)量最多生物效應(yīng)最為突出的是氫氣[6]和丁酸[7]。本文對(duì)氫氣和丁酸的胃黏膜保護(hù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

但我們發(fā)現(xiàn)氫氣組的胃組織損傷程度與模型組并無(wú)明顯差異，而丁酸組保護(hù)效應(yīng)卻非常顯著。因此，判斷酪酸梭菌的主要效應(yīng)產(chǎn)物可能不是氫氣而是丁酸。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)氫氣在大鼠應(yīng)激型胃潰瘍中對(duì)胃黏膜有明顯的效應(yīng)[8]，而且他們的給氫途徑是采用靜脈注射。我們認(rèn)為結(jié)果的差異可能與給氫的劑量、途徑、所采用的動(dòng)物種屬以及潰瘍模型不同等因素有關(guān)。關(guān)于氫氣對(duì)胃黏膜損傷的效應(yīng)仍有待進(jìn)一步深入研究。

丁酸對(duì)機(jī)體的影響可分為對(duì)腸內(nèi)的作用和對(duì)腸外的作用。對(duì)腸內(nèi)的作用包括：調(diào)節(jié)跨膜運(yùn)輸、改善炎癥和氧化狀態(tài)的腸黏膜、增強(qiáng)黏膜屏障、調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性和蠕動(dòng)，以及預(yù)防和抑制結(jié)腸癌[9]。腸外效果包括減輕血紅蛋白病[10-12]、高膽固醇血癥[13-14]、胰島素抵抗[15-16]及膿毒癥[17-18]等。而本研究中，我們發(fā)現(xiàn)丁酸能夠顯著減輕乙醇造成的胃黏膜損傷。

IL-12促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能力，具有免疫刺激作用，可調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞的天然免疫和輔助型T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答[19-20]，是重要的細(xì)胞因子。眾多研究表明，IL-12與RAN1參與炎癥反應(yīng)，可引起胃黏膜大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及免疫反應(yīng)，同時(shí)通過(guò)正反饋使炎癥反應(yīng)不斷增強(qiáng)，干擾胃黏膜生理功能，造成局部損傷，引發(fā)后繼慢性炎癥與免疫相關(guān)疾病等。有研究證實(shí)，在急性胃黏膜損傷中，IL-12及RAN1表達(dá)顯著增加[21]，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。MCP-1屬趨化因子CC亞家族中一員，可由多種細(xì)胞分泌，募集單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞至炎癥部位，經(jīng)歷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在炎癥過(guò)程中起促進(jìn)作用[22]。已有大量相關(guān)研究表明，在相關(guān)急慢性胃炎及胃癌中，MCP-1表達(dá)水平也顯著提升[23]。在使用丁酸處理后，上述炎癥介子則有顯著下降，這提示丁酸具有抗炎作用，與其它研究的結(jié)論相一致[17]。以往研究已證實(shí)丁酸能夠抑制NF-κB，從而降低TNFα、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12等多種炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[24]。丁酸作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑，能夠調(diào)控基因的表達(dá)，也是其發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵[25]。新近的研究認(rèn)為丁酸可以通過(guò)其特異性受體GPR109a介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)[26]。丁酸在乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜炎癥中通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮抗炎作用是我們下一步的需要探討的關(guān)鍵。

為評(píng)價(jià)丁酸對(duì)胃黏膜損傷的保護(hù)作用，我們測(cè)定了凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2。這2個(gè)蛋白在凋亡過(guò)程中至關(guān)重要。當(dāng)Bax表達(dá)量增加時(shí)，促進(jìn)凋亡的發(fā)生，Bcl-2表達(dá)量增加時(shí)則具有抗凋亡作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在乙醇模型組Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl-2的表達(dá)量基本不變。丁酸組Bax的表達(dá)量較模型組明顯減少，而Bcl-2的表達(dá)量顯著增加，這些數(shù)據(jù)提示丁酸可通過(guò)下調(diào)Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，抗凋亡實(shí)現(xiàn)對(duì)胃黏膜上皮的保護(hù)作用。但丁酸如何調(diào)控這2種蛋白，尚需深入研究。

總之，本文已證實(shí)丁酸是酪酸梭菌的胃黏膜保護(hù)效應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物，能夠減輕胃部炎癥反應(yīng)，下調(diào)Bax/Bcl-2的表達(dá)比例，防止乙醇介導(dǎo)的胃黏膜的損傷，為更為深入的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

EffectofmetabolitesofClostridiumbutyricum,butyricacidandhydrogen，onacutegastricmucosallesion

WANG Jin-dan1, QIAO Wan-ning2, ZHU Jing2, FU Yao-yang2, HU Wan-li1, DONG Ren-jie2, HONG Kai-rui2, ZHANG Jia-li2, WANG Fang-yan2

(1SchoolofMedicalLaboratoryScienceandLifeScience,2DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicineScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:wzyxywfy@126.com)

AIM: To observe the antiulcer effect of butyric acid and hydrogen， the main metabolites ofClostridiumbutyricum(C.butyricum), and to explore the underlying mechanism.METHODSThe mouse model of acute gastric mucosal lesion was prepared by gavage with ethanol. The mice were randomly divided into 4 groups: normal group, model group, butyric acid group and hydrogen group. The mice in butyric acid group and hydrogen group were given butyrate and hydrogen prior to model establishment， respectively. Macroscopic observation of the pathological changes in gastric tissues was performed to evaluate the effect of the 2 metabolites ofC.butyricum. Meanwhile, the mRNA expression levels of inflammatory factors, such as IL-12, RAN1 and MCP-1, were determined by RT-qPCR. The expression levels of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemical staining.RESULTSThe macroscopic observation found that butyrate, not hydrogen, protected gastric mucosa. HE staining also showed that butyrate significantly attenuated the pathological damage of the gastric mucosa induced by ethanol. Compared with model group, the mRNA levels of inflammatory factors IL-12, RAN1 and MCP-1 in butyrate group significantly decreased (P<0.01). In butyrate group, the protein level of Bax was obviously decreased compared with model group (P<0.01), while the protein level of Bcl-2 was significantly increased (P<0.01).CONCLUSIONThe gastric mucosa protective metabolite ofC.butyricummay be butyric acid, not hydrogen. Butyric acid protects the gastric mucosa against ethanol-induced lesion by inhibiting the inflammation and reducing the expression ratio of Bax/Bcl-2.

Butyric acid; Hydrogen; Acute gastric mucosal lesion; Inflammation; Apoptosis

R573.3； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.029

1000- 4718(2017)10- 1906- 06

2017- 04- 05

2017- 05- 31

浙江省科技廳項(xiàng)目(No. 2017C33068)；浙江省新苗人才計(jì)劃(No. 2017R413042)；溫州市科技局項(xiàng)目(No. y20150009)

△通訊作者 Tel: 0577-86689817; E-mail: wzyxywfy@126.com

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