泛素E3連接酶TRIM10在心肌細(xì)胞肥大中的作用*

周春宇， 李南南， 王紅霞， 田 翠， 李匯華

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 北京 100069)

泛素E3連接酶TRIM10在心肌細(xì)胞肥大中的作用*

周春宇， 李南南， 王紅霞， 田 翠， 李匯華△

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 北京 100069)

目的探討泛素E3連接酶TRIM10在心肌細(xì)胞肥大中的作用及分子機(jī)制。方法培養(yǎng)原代的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，siRNA-TRIM10與siRNA對(duì)照(siRNA-control)或過表達(dá)腺病毒Ad-TRIM10與空載對(duì)照Ad-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，然后用苯腎上腺素(phenylephrine, PE)處理細(xì)胞24 h。Western blot檢測(cè)TRIM10、AKT和ERK1/2的蛋白水平；免疫熒光染色觀察心肌細(xì)胞的大小；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心房鈉尿肽(ANP) 和腦鈉尿肽(BNP)的mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，PE處理明顯上調(diào)心肌細(xì)胞中TRIM10蛋白的表達(dá)水平。siRNA-TRIM10敲低內(nèi)源性TRIM10表達(dá)后明顯減小PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積，抑制ANP和BNP的mRNA的表達(dá)以及降低AKT和ERK1/2的磷酸化水平；而過表達(dá)TRIM10則呈現(xiàn)出與siRNA-TRIM10完全相反的結(jié)果。結(jié)論TRIM10可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大，其作用可能與AKT和ERK信號(hào)相關(guān)。

泛素E3連接酶； TRIM10； 心肌細(xì)胞肥大

心肌肥厚是高血壓、瓣膜病和心肌梗塞等臨床常見疾病的一種并發(fā)癥，是心臟應(yīng)對(duì)血液動(dòng)力學(xué)負(fù)荷增加、體液激素改變、內(nèi)分泌激活及能量代謝障礙等發(fā)生的一種病理生理適應(yīng)過程，最終導(dǎo)致心力衰竭[1]。心肌肥厚的主要病理改變包括心肌細(xì)胞體積增大、間質(zhì)纖維化、肌小節(jié)排列紊亂、蛋白質(zhì)合成增多和胚胎基因表達(dá)增高[2]。目前發(fā)現(xiàn)有多條信號(hào)通路參與心肌肥厚的發(fā)生，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路、磷酯酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)-AKT通路、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC) 通路和鈣調(diào)磷酸酶通路等[3-6]。

心肌肥厚發(fā)生時(shí)表現(xiàn)為心肌蛋白質(zhì)的合成增加或降解減少，其中泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system, UPS)是生物體內(nèi)調(diào)控蛋白質(zhì)降解的主要途徑，其主要由泛素激活酶E1、泛素轉(zhuǎn)運(yùn)酶E2、泛素連接酶E3和26S蛋白酶體組成。近年，許多研究及我們前期研究均證實(shí)E3連接酶如 atrogin-1、MuRF1、Nrdp1 等在心肌肥厚的發(fā)生中具有重要的調(diào)節(jié)作用[7-9]。TRIM家族是E3連接酶中的新成員，具有泛素連接酶的結(jié)構(gòu)和功能，參與多種細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控和病毒應(yīng)答等[10]，目前發(fā)現(xiàn)該家族中多個(gè)成員與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。TRIM10是TRIM家族的成員之一，具有E3連接酶的功能，主要參與紅系細(xì)胞的終末分化，對(duì)造血功能、細(xì)胞凋亡均具有重要的調(diào)節(jié)作用[11-12]。但是，TRIM10在心肌肥厚中的作用不清楚。

本研究在培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染siRNA-TRIM10以及過表達(dá)腺病毒Ad-TRIM10敲低或過表達(dá)TRIM10，觀察其對(duì)心肌細(xì)胞的大小、肥大標(biāo)志物心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP) 和腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)的mRNA水平以及相關(guān)信號(hào)通路的影響，探討TRIM10在心肌肥厚發(fā)生中的作用及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

SD大鼠的新生乳鼠(出生后3 d內(nèi))購自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

2主要試劑及儀器

苯腎上腺素(phenylephrine，PE)和TRIM10兔源抗體購自Sigma；siRNA-TRIM10 和siRNA-control購自GE Healthcare；過表達(dá)腺病毒Ad-TRIM10 和Ad-GFP購自漢恒生物公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；兔抗ERK1/2、 p-ERK1/2、AKT、p-AKT、GAPDH抗體及兔源II抗購自Cell Signaling Technology。

Nikon Labophot 2 顯微鏡購自Nikon；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀購自Bio-Rad；Western blot顯影儀購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自Life Technologies；酶標(biāo)儀購自BioTek。

3主要方法

3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 原代心肌細(xì)胞貼壁20 h后，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染siRNA-TRIM10(50 nmol/L，1∶100)敲低TRIMIO表達(dá)或用腺病毒Ad-TRIM10(50 nmol/L，1∶100)感染過表達(dá)內(nèi)源性TRIM10；相應(yīng)的對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染siRNA-control和Ad-GFP。同時(shí)換無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，然后給予PE(30 μmol/L)處理24 h。收集細(xì)胞提取總RNA和蛋白等用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2細(xì)胞α-actinin熒光染色 用4%多聚甲醛固定心肌細(xì)胞15 min，然后用PBS清洗3 min、3次，洗完后再用10 g/L的血清白蛋白溶液室溫封閉30 min。PBS 清洗3 min、3次， I 抗4 ℃孵育過夜(α-actinin， 1∶2 000稀釋)后用PBS洗去(5 min、3次)。加入II抗室溫避光孵育1 h，然后用含有DAPI的防熒光淬滅劑封片，避光放置數(shù)分鐘之后即可在熒光顯微鏡下采集圖像。

3.3Western blot實(shí)驗(yàn) 用蛋白R(shí)IPA裂解液(80～100 μL)冰上裂解細(xì)胞15 min，然后用細(xì)胞刮子收集至1.5 mL EP管中。用細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞后離心(4 ℃、12 000 r/min)10 min，吸取上清。按照BCA法測(cè)蛋白濃度。取40～50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜。用5% 脫脂牛奶室溫封閉膜1 h， I 抗4 ℃孵育過夜，次日洗滌10 min、3 次。用 II 抗孵育膜1 h后，ECL顯影。

3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 用Trizol 裂解法提取心肌細(xì)胞總RNA。取1～2 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后取2 μL cDNA模板、上下游引物各1 μL、SYBR 10 μL，添加dd H2O 6 μL至總體積20 μL，進(jìn)行反應(yīng)。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測(cè)定心肌肥厚標(biāo)志物ANP和BNP的mRNA水平。引物購自上海生工生物技術(shù)有限公司，序列如表1所示。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的引物序列

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。每個(gè)指標(biāo)進(jìn)行3次以上獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，均數(shù)組間比較采用單因素方差分析方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1PE處理上調(diào)心肌細(xì)胞中TRIM10蛋白的表達(dá)

PE處理原代心肌細(xì)胞24 h后， Western blot檢測(cè)顯示TRIM10的蛋白水平比對(duì)照組明顯增高，見圖1。

2敲低TRIM10抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大

Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siRNA-TRIM10組的TRIM10蛋白水平比siRNA-control組明顯降低，DE可明顯增加TRIM10的蛋白水平，siRNA-TRIM10可顯著降低PE誘導(dǎo)的TRIM10表達(dá)；免疫熒光染色結(jié)果顯示，與siRNA-control組相比，siRNA-TRIM10轉(zhuǎn)染后可明顯抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積增大；RT-qPCR測(cè)定顯示，與siRNA-control組相比，siRNA-TRIM10轉(zhuǎn)染后可明顯抑制PE誘導(dǎo)的肥大標(biāo)志物ANP和BNP mRNA的表達(dá)，見圖2。

3過表達(dá)TRIM10促進(jìn)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大

Western blot 結(jié)果表明Ad-TRIM10感染后的TRIM10蛋白水平比Ad-GFP組明顯升高，PE處理的Ad-TRIM10感染細(xì)胞中TRIM10水平較PE處理空載組進(jìn)一步升高；免疫熒光染色顯示，與Ad-GFP組相比Ad-TRIM10轉(zhuǎn)染后可明顯增大PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞直徑；RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)與Ad-GFP組相比，Ad-TRIM10感染后可明顯促進(jìn)PE誘導(dǎo)的肥大標(biāo)志物ANP和BNP mRNA的表達(dá)，見圖3。

Figure 1. PE treatment up-regulated TRIM10 protein expression in the cardiomyocytes. The protein level of TRIM10 was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1PE處理上調(diào)心肌細(xì)胞中TRIM10的蛋白表達(dá)

Figure 2. siRNA-TRIM10 inhibited the cardiomyocyte size, the ANP and BNP mRNA expression induced by PE-treatment. The cardiomyocytes were transfected with siRNA-TRIM10 or siRNA-control for 24 h, and then treated with PE for 24 h. A: the protein level of TRIM10 was determined by Western blot; B: the cardiomyocyte size was measured by α-actinin staining (×200); C: the mRNA levels of cardiac hypertrophy markers ANP and BNP were detected by RT-qPCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vssiRNA-control (vehicle);#P<0.05vssiRNA-control (PE).

圖2敲低TRIM10抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積增大和肥大標(biāo)志物ANP和BNP的mRNA的表達(dá)

Figure 3. Ad-TRIM10 increased cardiomyocyte size, ANP and BNP mRNA expression induced by PE-treatment. The cardiomyocytes were infected with Ad-TRIM10 or Ad-GFP for 24 h, and then treated with PE for 24 h. A: the protein level of TRIM10 was determined by Western blot; B: the cardiomyocyte size was measured by α-actinin staining (×200); C: the mRNA levels of cardiac hypertrophy markers ANP and BNP were detected by RT-qPCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsAd-GFP (vehicle);#P<0.05vsAd-GFP (PE).

圖3過表達(dá)TRIM10促進(jìn)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積增大和肥大標(biāo)志物ANP和BNPmRNA的表達(dá)

4TRIM10參與調(diào)控AKT和ERK1/2信號(hào)通路

Western blot 結(jié)果顯示，PE可顯著升高心肌細(xì)胞中AKT和ERK1/2的磷酸化水平(P<0.05)，敲低TRIM10后，可明顯抑制PE誘導(dǎo)的AKT和ERK1/2的磷酸化水平。相反，過表達(dá)TRIM10后則進(jìn)一步升高PE誘導(dǎo)的AKT和ERK1/2的磷酸化水平，見圖4。

討 論

TRIM家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、個(gè)體發(fā)育、腫瘤及細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過程發(fā)揮重要的作用。比如TRIM45可與膜轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白SLC25A3以及熱休克家族蛋白DNAJB6發(fā)生相互作用，共同阻斷鈣調(diào)磷酸酶介導(dǎo)的心肌肥厚[13]；TRIM7可通過調(diào)節(jié)c-Jun/AP-1 復(fù)合物，激活Ras系統(tǒng)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，促進(jìn)肺癌的發(fā)生[14]。TRIM10具有TRIM家族所共有的結(jié)構(gòu)域，包括鋅指結(jié)構(gòu)域(RING finger)、1個(gè)B-box以及1個(gè)coiled-coil結(jié)構(gòu)域。研究表明TRIM10可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、紅系細(xì)胞生成以及成年小鼠的紅細(xì)胞分化與增殖[12]。

Figure 4. The effect of siRNA-TRIM10 and Ad-TRIM10 on the expression of p-ERK1/2 and p-AKT. A: the levels of p-ERK1/2 and p-AKT were determined by Western blot after transfected with siRNA-TRIM10 or siRNA-control; B: the levels of p-ERK1/2 and p-AKT were determined by Western blot after transfected with Ad-TRIM10 or Ad-GFP. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vssiRNA-control (vehicle);#P<0.05vssiRNA-control (PE)；△P<0.05vsAd-GFP (vehicle);$P<0.05vsAd-GFP (PE).

圖4siRNA-TRIM10和Ad-TRIM10對(duì)PE誘導(dǎo)的ERK1/2和AKT的磷酸化水平的影響

本研究結(jié)果顯示敲低TRIM10后可抑制PE誘導(dǎo)的細(xì)胞體積增大、降低肥大標(biāo)志物的表達(dá)，而過表達(dá)TRIM10則具有相反的效應(yīng)，說明TRIM10具有促進(jìn)心肌肥大的作用。AKT和ERK信號(hào)激活是導(dǎo)致心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加、細(xì)胞肥大的一個(gè)重要機(jī)制[15]，因此本研究進(jìn)一步探討了TRIM10對(duì)以上信號(hào)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低TRIM10 后可明顯降低AKT和ERK1/2 的磷酸化水平，過表達(dá)TRIM10則相反，提示TRIM10可能是通過激活A(yù)KT和ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的。

本研究為深入了解TRIM10的生物學(xué)功能提供了新的依據(jù)，但是仍需要在基因敲除和過表達(dá)小鼠模型中進(jìn)一步驗(yàn)證TRIM10的作用及其分子機(jī)制。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

DUSP9調(diào)控雌性小鼠多能干細(xì)胞的DNA低甲基化

囊胚來源的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)和性腺來源的胚胎生殖細(xì)胞(embryonic germ cells, EGCs)代表了多能干細(xì)胞系的兩個(gè)經(jīng)典類型，但它們的分子等價(jià)性仍未被完全了解。Choi等對(duì)遺傳背景相同的ESCs和EGCs細(xì)胞系之間的全基因組甲基化模式進(jìn)行比較，從而確定它們表觀遺傳的相似性和差異性。令人驚訝的是，他們發(fā)現(xiàn)真正驅(qū)動(dòng)ESCs和EGCs甲基化模式的是性別而非細(xì)胞類型。細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，X染色體與常染色體的比值決定了甲基化水平，雌性雜交細(xì)胞表現(xiàn)為低甲基化，而雄性雜交細(xì)胞表現(xiàn)為高甲基化。他們還發(fā)現(xiàn)，與雄性ESCs 相比，雌性ESCs中X連鎖的MAPK磷酸酶DUSP9上調(diào)，同時(shí)雌性ESCs中DUSP9的雜合性缺失導(dǎo)致了雄性樣甲基化水平。然而，雄性和雌性囊胚均有相似的低甲基化水平，表明在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了性別特異性甲基化差異?？偟膩碚f，該研究表明，相同性別的ESCs和EGCs具有表觀遺傳相似性，同時(shí)確認(rèn)了DUSP9是雌性特異性低甲基化的一個(gè)調(diào)控因子。

Cell Stem Cell, 2017, 20(5):706-719.e7(范沖竹)

RoleofubiquitinE3ligaseTRIM10inregulatingcardiomyocytehypertrophy

ZHOU Chun-yu, LI Nan-nan, WANG Hong-xia, TIAN Cui, LI Hui-hua

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China.E-mail:hhli1935@aliyun.com)

AIM: To explore the role of ubiquitin E3 ligase tripartite motif 10 (TRIM10) in the development of cardiomyocyte hypertrophy.METHODSPrimary cultured neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs) were infected with siRNA-TRIM10， siRNA-control， Ad-TRIM10 or Ad-GFP for 24 h respectively, and then stimulated with phenylephrine (PE) for additional 24 h. The protein levels of TRIM10, AKT and ERK1/2 were determined by Western blot. The size of the NRCMs was measured by immunofluorescence staining. The mRNA expression of atrial natriuretic peptide (ANP) and brain natriuretic peptide (BNP) was detected by RT-qPCR.RESULTSCompared with the control, PE treatment significantly increased the protein expression of TRIM10. Moreover, transfection of NRCMs with siRNA-TRIM10 markedly inhibited cardiomyocyte size, the mRNA expression of ANP and BNP, and the phosphorylation levels of AKT and ERK as compared with siRNA-control after PE treatment. In contrast, overexpression of TRIM10 significantly enhanced PE-induced hypertrophic effect on NRCMs above.CONCLUSIONTRIM10 regulates cardiomyocyte hypertrophy partially through AKT and ERK signaling pathways.

Ubiquitin E3 ligase; TRIM10; Cardiomyocyte hypertrophy

R54； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.009

1000- 4718(2017)10- 1788- 06

2017- 01- 20

2017- 05- 19

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 81330003)

△通訊作者 Tel: 010-83950092； E-mail: hhli1935@aliyun.com

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