酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液對(duì)鼠傷寒沙門菌的抑制作用及其對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠腸道分泌型免疫球蛋白A的影響

姜林娟，鄭 志,2，朱紹輝，樸丙熙

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.韓陵醫(yī)藥研究院有限公司，江蘇 南京 211100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科，河南 衛(wèi)輝 453100；4.喜靈生物科技有限公司，韓國首爾 04393)

鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium，S.typhimurium)屬于泛嗜性沙門菌，是一種重要的人畜共患病原菌,也是醫(yī)院較常見的致病菌，可引起各種家禽及人類交叉感染[1]。全世界每年約有2 000萬人感染鼠傷寒沙門菌，其中死于鼠沙門菌感染者15.5萬人。鼠傷寒沙門菌已成為在我國流行的沙門菌第二大血清型，2014年至2018年余姚市感染性腹瀉病原譜監(jiān)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，以鼠傷寒沙門菌為主的沙門菌占感染性腹瀉致病菌病原譜的61.50%[2-3]。鼠傷寒沙門菌的臨床感染部位為胃腸道，可引起嚴(yán)重的急性胃腸炎，出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、腹痛、腹瀉、厭食等癥狀，可導(dǎo)致營養(yǎng)失調(diào)。由于嬰幼兒免疫系統(tǒng)未成熟、抵抗力低下，鼠傷寒沙門菌感染更易造成嬰幼兒感染。應(yīng)用抗菌藥物是臨床上治療鼠傷寒沙門菌感染的重要措施，但目前抗菌藥物濫用導(dǎo)致鼠傷寒沙門菌對(duì)大多數(shù)藥物產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性。2018年在河南省內(nèi)發(fā)現(xiàn)的147株臨床鼠傷寒沙門菌對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、磺胺異惡唑的耐藥率均在89.8%以上，對(duì)其他抗菌藥物如環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、頭孢曲松、阿奇霉素、頭孢西丁的耐藥率分別為29.3%、17.0%、16.3%、10.2%、6.1%，給臨床治療帶來極大困難[4]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道常見的益生菌酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum,C.butyricum)是梭狀芽孢桿菌，具有平衡腸道菌群的功效[5]，同時(shí)可以釋放酪酸、醋酸、乳酸、丁酸和氫氣等酸性代謝產(chǎn)物[6]，抑制致病菌生長(zhǎng)[7]、促進(jìn)營養(yǎng)吸收[8]、提高免疫力[9-10]。截至目前，尚未見酪酸梭菌對(duì)鼠傷寒沙門菌感染干預(yù)作用的研究報(bào)道。為此，本研究旨在分析酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠體內(nèi)的抑菌作用和腸道分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)的影響，為探討多重耐藥鼠傷寒沙門菌感染的膳食干預(yù)方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、菌株、試劑及儀器60只雄性6周齡ICR小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量為(18±3)g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2)℃、濕度(52±5)%，光和暗周期為12 h。酪酸梭菌(IDCC 9207)由韓國喜靈生物科技有限公司贈(zèng)送，鼠傷寒沙門菌購自美國模式菌種收集中心，發(fā)酵用的糯米粒購自河南原陽農(nóng)家，四環(huán)素購自北京索萊寶科技有限公司，營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar，NA)、亮綠瓊脂(brilliant green agar，BG)、MRS瓊脂、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)均購自青島海博生物技術(shù)有限公司，小鼠sIgA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液、無細(xì)胞發(fā)酵液、糯米發(fā)酵液制備酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液制備：將保存于冰箱的酪酸梭菌菌落用無菌生理鹽水洗3次，再用生理鹽水調(diào)整至0.5麥?zhǔn)?1.5 × 1011CFU·L-1)后稀釋10倍,放入到100 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，并添加體積分?jǐn)?shù)5%的無菌糯米粉，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h；將發(fā)酵混合液放入到離心管中,4 ℃下10 000 r·min-1離心10 min，取上層液用2.5 mol·L-1的氫氧化鈉(NaOH)調(diào)整pH為7.0，用無菌生理鹽水調(diào)整活菌濃度至1×1012CFU·L-1，置于4 ℃冰箱中保存、備用。無細(xì)胞發(fā)酵液制備：將酪酸梭菌-糯米混合液在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，放入到離心管中，4 ℃下10 000 r·min-1離心10 min，去除酪酸梭菌，取上層液用2.5 mol·L-1NaOH調(diào)整pH為 7.0；然后，用0.2 μm針頭無菌過濾器過濾，取過濾液(無細(xì)胞發(fā)酵液)保存在4 ℃冰箱備用。糯米發(fā)酵液制備：將體積分?jǐn)?shù)5%無菌糯米粉加入到100 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，在37 ℃條件下放置48 h后備用。

1.2.2 酪酸梭菌懸液和酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液中酪酸梭菌的檢測(cè)將10 μL酪酸梭菌懸液[(1.0×109± 8.0×103)CFU·L-1]和10 μL酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液[(1.0×109±2.6×103)CFU·L-1]各自涂抹于NA培養(yǎng)基表面，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)10%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,采用顯微鏡平板菌落計(jì)數(shù)方法檢測(cè)酪酸梭菌菌落數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 瓊脂打孔體外抑菌試驗(yàn)檢測(cè)酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液體外抑菌效果將鼠傷寒沙門菌用無菌PBS(pH 7.4)配成活菌濃度為1×109CFU·L-1的菌體懸液，加入到半固體NA平板上，在室溫下水平放置，待其凝固后，用100 μL的無菌槍頭打孔，將孔中的培養(yǎng)基挑出，將100 μL酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液及其稀釋液(12、14、18、116)加入到各孔洞內(nèi)，在室溫下水平放置2 h后，再在37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)尺測(cè)量抑菌圈的直徑大小，抑菌圈的范圍越大，表示抑菌效果越明顯。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 不同發(fā)酵液及陰性、陽性對(duì)照體外抑菌效果檢測(cè)參考DENKOVA等[11]報(bào)道的體外抑菌試驗(yàn)方法，取含10 μL鼠傷寒沙門菌(1×109CFU·L-1)的NA培養(yǎng)基分為酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組、PBS陰性對(duì)照組、四環(huán)素陽性對(duì)照組，取酪酸梭菌懸液、無細(xì)胞發(fā)酵液、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液、糯米發(fā)酵液、1×PBS、體積分?jǐn)?shù)0.2%的四環(huán)素各10 μL，涂抹于各組培養(yǎng)基表面；將培養(yǎng)基置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)10%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，涂沙門菌顯色瓊脂平板，采用顯微鏡平板菌落計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)鼠傷寒沙門菌，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。無任何處理的鼠傷寒桿菌作為對(duì)照。

1.2.5 鼠傷寒沙門菌感染小鼠模型建立和分組將60只小鼠進(jìn)行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為酪酸梭菌懸液組、糯米發(fā)酵液組、無細(xì)胞糯米發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組、PBS陰性對(duì)照組、四環(huán)素陽性對(duì)照組，每組10只。使用200 μL鼠傷寒沙門菌懸液(1×1012CFU·L-1)對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，每日1次；連續(xù)灌胃7 d后，酪酸梭菌懸液組、糯米發(fā)酵液組、無細(xì)胞糯米發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組、PBS陰性對(duì)照組、四環(huán)素陽性對(duì)照組小鼠分別給予酪酸梭菌懸液、無細(xì)胞發(fā)酵液、含1×1012CFU·L-1酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液、糯米發(fā)酵液、PBS、體積分?jǐn)?shù)0.2%四環(huán)素各200 μL灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃21 d。觀察各組小鼠一般情況。各組小鼠于干預(yù)4 d后，記錄食物攝取量、體質(zhì)量增加量，計(jì)算體質(zhì)量增加率，體質(zhì)量增加率=體質(zhì)量增加量/g÷食物攝取量/g。

1.2.6 小鼠腸道內(nèi)鼠傷寒沙門菌的檢測(cè)分別于鼠傷寒沙門菌對(duì)小鼠感染后的第0、7、14、21、28天早上(8:00～9:00)收集各組小鼠糞便，將小鼠糞便用1× PBS充分稀釋，稀釋液涂抹在BG瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.7 ELISA法檢測(cè)小鼠腸道內(nèi)sIgA水平取實(shí)驗(yàn)第28天各組小鼠糞便，用1×PBS稀釋至20 g·L-1，在4 ℃下3 000 r·min-1離心10 min，取上層液置于離心管中，然后在4 ℃下14 000 r·min-1離心10 min，取上層液，用PBS稀釋10倍，備用。采用ELISA法檢測(cè)sIgA表達(dá)水平：將標(biāo)準(zhǔn)樣品和各組上層液各取100 μL滴加至96反應(yīng)孔內(nèi)，然后加入50 μL試劑盒的sIgA抗體，在37 ℃條件下反應(yīng)1 h。用移液管移除96孔內(nèi)液體，加入試劑盒內(nèi)的洗滌液洗液4次，加入50 μL底物，在37 ℃條件下避光反應(yīng)20 min,加50 μL試劑盒終止液，在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光值，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)sIgA對(duì)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各待測(cè)組的sIgA表達(dá)水平(ng·g-1糞便)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 酪酸梭菌懸液和酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液中酪酸梭菌比較結(jié)果見表1。培養(yǎng)0 h，酪酸梭菌懸液和酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液中酪酸梭菌菌落數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)24 h，酪酸梭菌懸液和酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液中酪酸梭菌菌落數(shù)顯著多于培養(yǎng)0 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)24 h，酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液中酪酸梭菌菌落數(shù)顯著多于酪酸梭菌懸液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 酪酸梭菌懸液和酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液中酪酸梭菌菌落數(shù)比較

2.2 酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液體外抑菌圈試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果結(jié)果見圖1。無稀釋和12、14、18、116稀釋的酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液的抑菌圈分別為(16.0±1.0)、(10.0±1.0)、(8.3±0.6)、(6.2±0.3)、(5.6±0.2)mm，隨著酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液稀釋倍數(shù)增加，抑菌圈顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：無稀釋的酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液；B：12稀釋的酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液；C：14稀釋的酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液；D：18稀釋的酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液；E：116稀釋的酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液。

2.3 不同發(fā)酵液及陰性、陽性對(duì)照體外抑菌效果比較酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組、四環(huán)素陽性對(duì)照組鼠傷寒桿菌菌落數(shù)均為(0.0±0.0)CFU·L-1，PBS陰性對(duì)照組和糯米發(fā)酵液組鼠傷寒桿菌菌落數(shù)分別為(1.0×1011± 2.6×105)、(1.0×1011±3.5×105)CFU·L-1，無任何處理的鼠傷寒桿菌對(duì)照組菌株數(shù)為(1.0×1011±2.7×105)CFU·L-1，3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 6組小鼠體內(nèi)傷寒沙門菌菌落數(shù)比較結(jié)果見表2。PBS陰性對(duì)照組和糯米發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌呈增高趨勢(shì)(P<0.05)；四環(huán)素陽性對(duì)照組小鼠第0、7、14天體內(nèi)鼠傷寒沙門菌呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.05)，第14、21、28天無明顯變化(P>0.05)；酪酸梭菌懸液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌第0、7、14、21天呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.05)，第28天體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)少于第21天，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。無細(xì)胞發(fā)酵液組小鼠第0、7、14、21天體內(nèi)鼠傷寒沙門菌增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.05)。酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)第7、14、21天顯著多于第0天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第7天、第14天、第21天小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第28天與第0天小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第0、7、14天，6組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.310、0.450、3.955，P>0.05)；第21天，四環(huán)素陽性對(duì)照組和酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)顯著少于PBS陰性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組、酪酸梭菌懸液組和無細(xì)胞發(fā)酵液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PBS陰性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組、酪酸梭菌懸液組和無細(xì)胞發(fā)酵液組兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四環(huán)素陽性對(duì)照組與酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第28天，四環(huán)素陽性對(duì)照組、酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)顯著少于PBS陰性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組，四環(huán)素陽性對(duì)照組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)顯著少于酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組，酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)顯著少于四環(huán)素陽性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 6組小鼠體內(nèi)傷寒沙門菌菌落數(shù)比較

2.5 6組小鼠腸道內(nèi)sIgA表達(dá)水平比較酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組、四環(huán)素陽性對(duì)照組、酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組、PBS陰性對(duì)照組小鼠腸道內(nèi)sIgA水平分別為(180±10)、(110±8)、(98±8)、(70±6)、(42±5)、(40±2)ng·g-1糞便。6組小鼠腸道內(nèi)sIgA水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=188.496，P=0.000)，酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠腸道內(nèi)sIgA水平顯著高于四環(huán)素陽性對(duì)照組、酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組、PBS陰性對(duì)照組，四環(huán)素陽性對(duì)照組小鼠腸道內(nèi)sIgA水平顯著高于酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組、PBS陰性對(duì)照組，酪酸梭菌懸液組小鼠腸道內(nèi)sIgA水平顯著高于無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組、PBS陰性對(duì)照組，無細(xì)胞發(fā)酵液組小鼠腸道內(nèi)sIgA水平顯著高于糯米發(fā)酵液組、PBS陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；糯米發(fā)酵液組與PBS陰性對(duì)照組小鼠腸道內(nèi)sIgA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 6組小鼠一般情況及食物攝取量、體質(zhì)量增加量和體質(zhì)量增加率比較結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)第28天，PBS陰性對(duì)照組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、弓背、反應(yīng)遲鈍、沉郁、嗜睡、體質(zhì)量不增加、體毛粗亂等臨床癥狀；無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌懸液組小鼠有輕微腹瀉癥狀，但體質(zhì)量增加、體毛等有改善；四環(huán)素陽性對(duì)照組小鼠仍有輕微腹瀉、毛發(fā)無光澤、反應(yīng)遲鈍等癥狀；酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體毛、活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，無腹瀉等癥狀。四環(huán)素陽性對(duì)照組和糯米發(fā)酵液組小鼠的食物攝取量高于酪酸梭菌懸液組、PBS陰性對(duì)照組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；四環(huán)素陽性對(duì)照組與糯米發(fā)酵液組小鼠的食物攝取量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，酪酸梭菌懸液組、PBS陰性對(duì)照組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。酪酸梭菌懸液組和酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加量高于PBS陰性對(duì)照組、四環(huán)素陽性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組，四環(huán)素陽性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加量高于PBS陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；酪酸梭菌懸液組與酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四環(huán)素陽性對(duì)照組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加量?jī)蓛杀容^差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。四環(huán)素陽性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組、酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加率高于PBS陰性對(duì)照組，酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加率高于四環(huán)素陽性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；四環(huán)素陽性對(duì)照組與糯米發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加率兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 6組小鼠食物攝取量、體質(zhì)量增加量及體質(zhì)量增加率比較

3 討論

鼠傷寒沙門菌是醫(yī)院較常見的致病菌，可引起各種家禽及人類交叉感染，尤其對(duì)人的健康造成很大的危害，常見于農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖業(yè)、社區(qū)食物中毒事件及醫(yī)院內(nèi)嬰幼兒感染。嬰幼兒因消化系統(tǒng)還未發(fā)育完全、腸道菌群尚未完全建立，機(jī)體對(duì)病原菌感染的防御功能差，尤其是同時(shí)患有其他疾病的嬰幼兒，易被鼠傷寒沙門菌為主的耐藥沙門菌群感染。該細(xì)菌可侵襲胃腸上皮細(xì)胞，破壞腸道菌群，影響營養(yǎng)吸收，繼而出現(xiàn)黏性血便、反復(fù)腹瀉和脫水等癥狀，影響營養(yǎng)吸收，導(dǎo)致體質(zhì)量下降，發(fā)育遲緩[12-13]。石國露[14]對(duì)重慶地區(qū)2009年至2018年兒童沙門菌感染的臨床特征及菌血癥危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，沙門菌感染患兒年齡范圍為19 d～13歲，其中19 d～0.5歲者57例(11.8%)，>0.5～1.0歲者182例(37.7%)，>1.0～2.0歲者155例(32.1%)，>2.0～5.0歲者66例(13.6%)，>5.0歲者23例(4.8%)；沙門菌13種血清型中鼠傷寒沙門菌231例(80.2%)，居首位。此外，有研究報(bào)道，多重耐藥沙門菌的進(jìn)化和區(qū)域性廣泛傳播形勢(shì)嚴(yán)峻[15-17]，故針對(duì)嬰幼兒等機(jī)體抵抗力弱的群體臨床用藥應(yīng)謹(jǐn)慎[18-19]。因此，探索一種既能抑制致病菌又能替代抗菌藥物的干預(yù)方案迫在眉睫。

研究顯示，酪酸梭菌對(duì)腸出血性大腸桿菌、痢疾志賀菌、霍亂沙門菌、霍亂弧菌等腸道致病菌具有顯著抑制作用[20-21]。抗氧化劑(如谷胱甘肽)聯(lián)合酪酸梭菌可增加新生兒血清膽紅素水平、提高免疫力[22],含酪酸梭菌的復(fù)合益生菌能治療小兒消化不良、腹瀉等消化系統(tǒng)疾病[23]，而且對(duì)2型糖尿病[24]和胃腸功能不良[25]也有改善作用。糯米是常見谷物，含有豐富的植物化學(xué)素、維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，可調(diào)節(jié)腸道的營養(yǎng)吸收能力，能通過膳食攝入適當(dāng)增加體質(zhì)量[26]。傳統(tǒng)食品工藝中以糯米為原料，通過復(fù)雜的發(fā)酵工序釀制成低度糯米酒，具有較高營養(yǎng)價(jià)值，有利于人體健康。本研究結(jié)合腸道益生菌和糯米發(fā)酵液，通過發(fā)酵工藝，首次制作酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液，并觀察其對(duì)鼠傷寒沙門菌感染的影響。

本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液中酪酸梭菌菌落數(shù)顯著多于酪酸梭菌懸液，說明酪酸梭菌在有糯米營養(yǎng)液條件下，更適宜滿足生長(zhǎng)和繁殖的條件，因此認(rèn)為糯米有助于酪酸梭菌的生長(zhǎng)。本研究體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液稀釋倍數(shù)增加，對(duì)鼠傷寒沙門菌抑菌圈顯著減小，說明酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液對(duì)鼠傷寒沙門菌的抑制作用具有明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。此外，本研究結(jié)果顯示，四環(huán)素陽性對(duì)照組、酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組鼠傷寒桿菌菌落數(shù)均為(0.0±0.0)CFU·L-1，PBS陰性對(duì)照組和糯米發(fā)酵液組鼠傷寒桿菌菌落數(shù)分別為(1.0×1011±2.6×105)、(1.0×1011±3.5×105)CFU·L-1，無任何處理的鼠傷寒桿菌對(duì)照組菌落數(shù)為(1.0×1011±2.7×105)CFU·L-1，說明四環(huán)素、酪酸梭菌、無細(xì)胞發(fā)酵液、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液對(duì)鼠傷寒沙門菌具有較好抑制作用，糯米發(fā)酵液和PBS對(duì)鼠傷寒沙門菌無抑菌作用。本研究體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，PBS陰性對(duì)照組和糯米發(fā)酵液組第0、7、14、21、28天小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌呈增高趨勢(shì)；四環(huán)素陽性對(duì)照組、酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)均出現(xiàn)先增高后降低趨勢(shì)，且酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)第28天與第0天比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第0、7、14天，6組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第21天，四環(huán)素陽性對(duì)照組和酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)顯著少于PBS陰性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組、酪酸梭菌懸液組和無細(xì)胞發(fā)酵液組；第28天，四環(huán)素陽性對(duì)照組、酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)顯著少于PBS陰性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組，四環(huán)素陽性對(duì)照組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)顯著少于酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組，酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門菌菌落數(shù)顯著少于四環(huán)素陽性對(duì)照組。這說明酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液對(duì)鼠傷寒沙門菌的抑制作用比四環(huán)素、酪酸梭菌、無細(xì)胞發(fā)酵液更強(qiáng)。推測(cè)其原因可能是糯米發(fā)酵液含有各種抗菌活性成分，能協(xié)助酪酸梭菌在腸內(nèi)正?；?，促成活菌在腸內(nèi)快速生長(zhǎng)，從而顯著抑制鼠傷寒沙門菌；無糯米發(fā)酵液的酪酸梭菌在鼠傷寒沙門菌感染腸道內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境未能完全穩(wěn)定，造成活菌(酪酸梭菌)正常生長(zhǎng)受影響導(dǎo)致其抑菌作用受限。

本研究結(jié)果顯示，酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠sIgA水平顯著高于四環(huán)素陽性對(duì)照組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組、酪酸梭菌懸液組和PBS陰性對(duì)照組，四環(huán)素陽性對(duì)照組小鼠sIgA水平顯著高于酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組和PBS陰性對(duì)照組，酪酸梭菌懸液組小鼠sIgA水平顯著高于無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組和PBS陰性對(duì)照組，無細(xì)胞發(fā)酵液組小鼠sIgA水平顯著高于糯米發(fā)酵液組和PBS陰性對(duì)照組，說明糯米發(fā)酵液通過協(xié)助作用，能促進(jìn)活菌(酪酸梭菌)在腸內(nèi)穩(wěn)定和生長(zhǎng)，加快益生活菌在腸內(nèi)正?；?，迅速調(diào)節(jié)腸道菌平衡，提高腸道免疫力，從而抑制腸道鼠傷寒沙門菌。本研究結(jié)果還顯示，四環(huán)素陽性對(duì)照組和糯米發(fā)酵液組小鼠的食物攝取量高于酪酸梭菌懸液組、PBS陰性對(duì)照組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組；酪酸梭菌懸液組和酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加量高于PBS陰性對(duì)照組、四環(huán)素陽性對(duì)照組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組，四環(huán)素陽性對(duì)照組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、糯米發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加量高于PBS陰性對(duì)照組；四環(huán)素陽性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組、酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加率高于PBS陰性對(duì)照組，酪酸梭菌懸液組、無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠的體質(zhì)量增加率高于四環(huán)素陽性對(duì)照組、糯米發(fā)酵液組；這一結(jié)果說明，酪酸梭菌作為腸道益生菌通過調(diào)節(jié)腸道菌平衡能促進(jìn)小腸營養(yǎng)吸收，而糯米發(fā)酵液的多種營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)機(jī)體的免疫力及體質(zhì)量增加起到協(xié)助作用。此外，本研究結(jié)果顯示，PBS陰性對(duì)照組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、反應(yīng)遲鈍、嗜睡、體質(zhì)量不增加、體毛粗亂等癥狀；無細(xì)胞發(fā)酵液組、酪酸梭菌懸液組小鼠有輕微腹瀉癥狀，但體質(zhì)量不增、體毛粗亂等明顯改善；四環(huán)素陽性對(duì)照組小鼠出現(xiàn)輕微腹瀉、毛發(fā)無光澤、反應(yīng)遲鈍等癥狀；酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液組小鼠體毛、活動(dòng)正常，無腹瀉等不良表現(xiàn)；說明酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠的改善效果最佳，因此，認(rèn)為該新型酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液對(duì)鼠傷寒沙門菌感染的嬰幼兒等抵抗力弱的群體具有良好應(yīng)用價(jià)值。

綜合上述，本研究通過發(fā)酵工藝首次制作酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液，酪酸梭菌-糯米復(fù)合發(fā)酵液比四環(huán)素對(duì)鼠傷寒桿菌的抑菌作用更強(qiáng)，且能顯著提高腸道免疫力，適當(dāng)增加體質(zhì)量，這為探索多重耐藥鼠傷寒沙門菌感染的膳食干預(yù)方案提供了新的研究思路和依據(jù)。