鹽酸水蘇堿對實驗性急性腦梗死大鼠的治療作用*

梁華峰， 王 娟， 謝 靖， 余 鵑， 申 婧， 田 鳳， 劉春紅， 張惠麗

(新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 新疆 石河子 832000)

鹽酸水蘇堿對實驗性急性腦梗死大鼠的治療作用*

梁華峰△， 王 娟， 謝 靖， 余 鵑， 申 婧， 田 鳳， 劉春紅， 張惠麗

(新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 新疆 石河子 832000)

目的觀察鹽酸水蘇堿對實驗性急性腦梗死大鼠的治療效果，并探討其可能作用機制。方法將75只大鼠隨機分為5組：假手術(shù)組、腦梗死組及不同劑量鹽酸水蘇堿治療組，每組各15只。鹽酸水蘇堿治療組大鼠在造模完成后分別給予鹽酸水蘇堿10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg灌胃，每天1次，連續(xù)給藥14 d。給藥完成后，對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，計算腦梗塞體積，干濕重法檢測腦含水量，Western blot法檢測腦組織中β-catenin、cyclin D1、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)和p-GSK-3β的蛋白水平。結(jié)果與腦梗死組相比，鹽酸水蘇堿治療后大鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯降低，腦梗死體積與腦含水量明顯降低，β-catenin、cyclin D1和p-GSK-3β的蛋白水平明顯升高。結(jié)論鹽酸水蘇堿對實驗性大鼠急性腦梗死具有一定的療效，其機制可能與激活了Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

鹽酸水蘇堿； 急性腦梗死； Wnt/β-catenin信號通路

急性腦血管病是我國死亡率最高的三大疾病之一，其中以缺血性腦血管病最為常見，約占發(fā)病率的70%，致殘率占首位[1]。腦梗死(cerebral infarction，CI)是由于動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管內(nèi)腔日益狹窄，甚至完全閉塞而引起腦血管意外性疾病[2],其高復(fù)發(fā)率以及引起的癱瘓、失語和癡呆等后遺癥給患者及其家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前臨床上降低腦梗死致殘率與死亡率的關(guān)鍵是及早進行搶救措施，一方面采取溶栓措施，另一方面減輕缺血與缺血后再灌注引起的腦組織損害、減小梗死體積和緩解神經(jīng)功能缺失[3]。

水蘇堿(stachydrine，STA)是分布在唇形科、豆科、蕓香科和菊科等植物中，是中草藥益母草的最主要有效活性成分之一[4]，又稱為N,N-二甲基脯氨酸。研究發(fā)現(xiàn)大鼠靜脈注射水蘇堿后，超氧化物歧化酶活性明顯升高，損傷因子丙二醛的含量明顯減少，并具有一定的量效關(guān)系，在一定程度上增加血清與心肌中一氧化氮水平，提示水蘇堿對大鼠缺血再灌注損傷心肌具有保護作用，使心肌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞免受缺血的損傷[5]。我們通過建立急性腦梗死大鼠模型，觀察鹽酸水蘇堿的治療作用及初步的作用機制。

材 料 和 方 法

1實驗動物

健康SD大鼠75只，雌雄各半，SPF級，體質(zhì)量220～260 g，購于河南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)于恒溫恒濕環(huán)境中，自由飲水進食，進行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。

2主要試劑

鹽酸水蘇堿購自中國食品藥品檢定研究院(純度99.4%)；抗β-catenin、cyclin D1、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)、p-GSK-3β和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

3方法

3.1急性腦梗死大鼠模型的建立及分組處理 將大鼠隨機分成5組，假手術(shù)組(sham組)、CI組和不同劑量STA治療組，每組各15只。手術(shù)前12 h禁食，腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉大鼠，仰臥固定大鼠，頸部正中切口，暴露左側(cè)頸外動脈(external carotid artery，ECA)，電凝ECA分支，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端，動脈夾夾閉頸總動脈(clipping common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)和翼腭動脈(pterygopalatine artery，PA)，于ECA殘端作楔形切口，插入約18～22 mm栓線，通過分叉處插入至大腦動脈起點，于楔形切口下端結(jié)扎，除去動脈夾，逐層縫合，消毒皮膚，分籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不放入栓線結(jié)扎，其余操作相同。造模成功后，STA治療大鼠分別給予鹽酸水蘇堿10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg灌胃，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

3.2神經(jīng)功能缺損評分 采用改良的Bederson評分方法對大鼠的運動與行為缺陷進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無神經(jīng)功能缺失癥狀者；1分為提大鼠尾，見癱瘓側(cè)前肢回收屈曲不能正常伸向地面者；2分為除1分的體征外，向癱瘓側(cè)推時感阻力較對側(cè)明顯降低者；3分為除以上體征外，爬行時向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)者；4 分為伴有意識障礙者。

3.3腦梗死體積的測定 將SD大鼠迅速斷頭，取出腦組織于-20 ℃冰箱凍存約20 min，將腦組織矢狀面均切為片，每片約厚2 mm，放置于恒溫60 ℃的2% TTC溶液的染缸內(nèi)染色，約30 min，使均勻染色，染色完畢后將腦組織片用多聚甲醛固定24 h，拍照，觀察，白色為梗死區(qū)域，紅色為正常腦組織。根據(jù)Arshad的方法計算梗死體積[3]，V梗死體積=h×(A1+A2+A3+…+An)，V全腦體積= h×(B1+B2+B3+…+Bn)，h為切片厚度，A為每個切片兩面梗死體積平均值，B為每個切片兩面整體體積平均值，n為單個鼠腦的切片數(shù)量，腦梗死體積百分比為V梗死體積/V全腦體積。

3.4腦含水量(brain water content，BWC)的測定 給藥完成后，迅速斷頭取腦，快速去除軟腦膜和凝血塊，切左右2半，測量病灶側(cè)半球的重量，至于90 ℃烤箱中烘烤48 h至恒重，稱重，計算腦含水量，BWC=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.5Western blot實驗 給藥完成后，迅速取腦組織，于冰上剪碎，加入全細(xì)胞裂解液，冰浴中勻漿5 min，將勻漿液在冰上渦旋振蕩，4 ℃、15 000 r/min離心30 min，取上清液進行蛋白定量，上樣，進行電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)膜，加入封閉液封閉1 h，加入相應(yīng)的 I 抗，4 ℃孵育過夜，加入對應(yīng)的 II 抗，37 ℃孵育1 h，將膜取出后置于ECL試劑盒中反應(yīng)約1 min，然后放入凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)進行曝光拍照，采用數(shù)字圖像分析軟件對目的條帶和內(nèi)參照條帶進行分析。

4統(tǒng)計學(xué)處理

計量結(jié)果采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)均數(shù)比較采用單因素方差分析，各組間均數(shù)兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分

術(shù)后2～3 h各組大鼠均蘇醒，其中假手術(shù)組大鼠正?；顒?，無神經(jīng)功能缺損，腦梗死組與治療組均出現(xiàn)不同程度的偏癱，神經(jīng)功能缺損評分顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，給藥治療3 d與7 d后，治療各組的大鼠神經(jīng)功能缺損評分均有下降，低于腦梗死組(P<0.05)，見表1。

表1鹽酸水蘇堿對腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響

Table 1. Effects of stachydrine (STA) hydrochloride on the scores of neurological function impairment in cerebral infarction (CI) rats (Mean±SD.n=15)

Group1d3d7dSham000CI2．90±0．34?2．70±0．48?2．10±0．31?STA(10mg/kg)2．70±0．402．00±0．24#1．80±0．25#STA(20mg/kg)2．80±0．381．90±0．24#1．70±0．31#STA(40mg/kg)2．70±0．451．70±0．38#1．40±0．28#

*P<0.05vssham;#P<0.05vsCI.

2鹽酸水蘇堿對大鼠腦梗死體積和腦含水量的影響

TTC染色后，假手術(shù)組大鼠腦組織切片中未出現(xiàn)白色梗死區(qū)域，腦梗死組與各個治療組均出現(xiàn)不同程度的白色梗死區(qū)域，各個治療組的腦梗死區(qū)域小于腦梗死組，并隨藥物劑量增大有逐漸減小的趨勢，見圖1；與腦梗死組大鼠相比，各個治療組的腦梗死體積百分比明顯減少，見表2。

與假手術(shù)組相比，腦梗死組大鼠的腦含水量顯著上升(P<0.05)；與腦梗死組大鼠相比，各治療組大鼠的腦含水量明顯下降，有隨藥物劑量增大而減少的趨勢，見表2。

Figure 1. TTC staining for brain tissues of cerebral infarction (CI) rats in each group.

圖1各組腦梗死大鼠腦組織TTC染色結(jié)果

表2鹽酸水蘇堿對腦梗死體積百分比和腦含水量的影響

Table 2. Effects of stachydrine (STA) hydrochloride on cerebral infarction volume and brain water content (Mean±SD.n=6)

GroupVolumeofcerebralinfarction(%)Watercontent(%)Sham076．28±1．61CI25．67±1．68?79．94±1．24?STA(10mg/kg)20．14±1．28#78．61±1．43STA(20mg/kg)16．68±1．34#77．69±1．21#STA(40mg/kg)9．21±1．08#77．11±1．05#

*P<0.05vssham;#P<0.05vsCI.

3β-catenin和cyclinD1蛋白表達(dá)的變化

與假手術(shù)組相比，腦梗死組大鼠腦組織中β-catenin和cyclin D1的蛋白表達(dá)水平略上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；給予鹽酸水蘇堿干預(yù)后，大鼠腦組織中β-catenin和cyclin D1的蛋白表達(dá)水平明顯升高，并隨藥物劑量增大而呈上升趨勢，見圖2。

4GSK-3β和p-GSK-3β的蛋白表達(dá)變化

與假手術(shù)組相比，腦梗死組大鼠腦組織中p-GSK-3β蛋白水平略上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；給予鹽酸水蘇堿干預(yù)后，大鼠腦組織中p-GSK-3β的蛋白水平明顯升高，見圖3。

Figure 2. Effects of stachydrine (STA) hydrochloride on the protein expression of β-catenin and cyclin D1. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsCI.

圖2鹽酸水蘇堿對β-catenin和cyclinD1蛋白表達(dá)的影響

Figure 3. Effects of stachydrine (STA) hydrochloride on the protein levels of GSK-3β and p-GSK-3β. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsCI.

圖3鹽酸水蘇堿對GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

討 論

水蘇堿作為藥用植物益母草的主要活性成分之一，臨床上常用于女性的活血調(diào)經(jīng)，是傳統(tǒng)婦科用藥，但隨著對其不斷的研究與臨床驗證，逐漸發(fā)現(xiàn)在心腦血管、抗腫瘤、腎病等領(lǐng)域具有新的用途[6]。研究發(fā)現(xiàn)鹽酸水蘇堿能夠顯著降低急性血瘀大鼠的全血黏度和紅細(xì)胞比容[7]。我們推測鹽酸水蘇堿在抗血栓具有一定的療效。大腦中動脈是臨床上最容易發(fā)生梗死的部分，我們采用線栓法建立大鼠腦梗死模型，能夠較好地模擬人腦梗死的發(fā)病機制。

試驗中采用改良的Bederson評分方法對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損的評分，結(jié)果顯示鹽酸水蘇堿具有改善急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能方面的作用。通過TTC染色發(fā)現(xiàn)，以鹽酸水蘇堿灌胃確實能減小急性腦梗死大鼠的腦梗死體積，提示鹽酸水蘇堿對腦組織具有一定程度的保護作用。

Wnt信號通路是調(diào)控腦細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)通路之一，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸線的形成，海馬發(fā)育以及大腦皮質(zhì)模式形成具有非常重要的作用。在經(jīng)典Wnt途徑中β-catenin的胞漿水平對信號的傳導(dǎo)具有決定性作用。當(dāng)通路被激活，Wnt蛋白結(jié)合至Frizzled蛋白，使細(xì)胞內(nèi)的Dishevelled蛋白活化，進而抑制細(xì)胞質(zhì)中GSK-3β、活化蛋白C等組成的復(fù)合物活性，致使β-catenin在細(xì)胞中聚集轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，與轉(zhuǎn)錄因子TcF/LEF結(jié)合形成復(fù)合物，引起轉(zhuǎn)錄，進一步調(diào)控特定基因，如cyclin D1、c-Myc等因子的表達(dá)[8-9]。GSK-3β是Wnt/β-catenin通路中的關(guān)鍵因子，對胞漿中β-catenin蛋白的穩(wěn)定性具有調(diào)控作用。實驗表明，采用鹽酸水蘇堿干預(yù)后，大鼠腦組織中β-catenin和cyclin D1表達(dá)增加，推測鹽酸水蘇堿激活腦梗死大鼠腦組織的Wnt/β-catenin通路，通過抑制GSK-3β對β-catenin的磷酸化，使得β-catenin在胞漿內(nèi)的含量顯著升高，從而降低腦組織細(xì)胞的凋亡，起到對損傷腦組織的保護作用。有研究發(fā)現(xiàn)抑制β-catenin或TCF對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控能使神經(jīng)元對凋亡的敏感性增加，而抑制Wnt信號通路可能使 P53激活的經(jīng)典的凋亡途徑活化，從而使神經(jīng)元發(fā)生死亡[10]。

綜上所述，鹽酸水蘇堿對急性腦梗死大鼠的腦組織具有保護作用，推測是通過激活Wnt/β-catenin通路，降低腦組織細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮其功效。進一步的具體機制還需進一步的深入研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

海馬-內(nèi)嗅區(qū)神經(jīng)環(huán)路的非空間維度功能測定

在空間導(dǎo)航任務(wù)中，海馬及內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層(medial entorhinal cortex, MEC)的神經(jīng)活動被認(rèn)為與位置、頭端朝向、速度及邊界識別等航行變量有關(guān)。這種活動模式被認(rèn)為是提供了對實體空間的地圖樣表述。然而，海馬-內(nèi)嗅區(qū)環(huán)路不僅與空間導(dǎo)航有關(guān)，而且與多種記憶導(dǎo)向行為(memory-guided behaviors)密切相關(guān)。這些一般功能與特異性空間活動模式之間的關(guān)系目前尚不明確。一個概念性的框架使這些關(guān)系得以協(xié)調(diào)，即空間描述僅僅是編碼連續(xù)及任務(wù)相關(guān)變量的一般機制的一個特例。Aronov等在大鼠使用操縱桿沿連續(xù)頻率軸操縱聲音的任務(wù)期間，記錄海馬和內(nèi)嗅區(qū)神經(jīng)元的活動，從而來測試這個想法。他們發(fā)現(xiàn)了整個行為任務(wù)的神經(jīng)活動，包括在特定聲音頻率處形成離散放電區(qū)域(discrete firing fields)的活動。參與這種活動的神經(jīng)元與神經(jīng)環(huán)路中已知的空間細(xì)胞類型重疊，例如位置細(xì)胞(place cells)和網(wǎng)格細(xì)胞(grid cells)。這些結(jié)果表明，海馬-內(nèi)嗅區(qū)系統(tǒng)的一般環(huán)路機制可用于解釋多種行為任務(wù)，從而可能支持空間導(dǎo)航之外的認(rèn)知過程。

Neuron, 2017, 543(7647):719-722(李 偉)

Effectsofstachydrinehydrochlorideonexperimentalacutecerebralinfarctioninrats

LIANG Hua-feng, WANG Juan, XIE Jing, YU Juan, SHEN Jing, TIAN Feng, LIU Chun-hong, ZHANG Hui-li

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofMedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China.E-mail:xiehuafengmed@126.com)

AIM: To observe the therapeutic effect of stachydrine hydrochloride on experimental acute cerebral infarction in rats and to explore the underlying mechanisms.METHODSSD rats (n=75) were randomly divided into 5 groups: sham group, cerebral infarction model group, and stachydrine hydrochloride (10 mg/kg, 20 mg/kg and 40 mg/kg) treatment groups. After the establishment of cerebral infarction model, the rats were given stachydrine hydrochloride at dose of 10 mg/kg, 20 mg/kg or 40 mg/kg by gavage daily for 14 d. The impairment of neurological function in each group was scored. The cerebral infarction volume and brain water content were measured. Moreover, the protein levels of β-catenin, cyclin D1, glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) and p-GSK-3β in the brain tissues were detected by Western blot.RESULTSCompared with cerebral infarction group, the score of neurological function impairment, cerebral infarction volume and brain water content were significantly decreased in stachydrine hydrochloride treatment groups. In addition, the protein levels of β-catenin, cyclin D1 and p-GSK-3β were markedly increased after stachydrine hydrochloride treatment.CONCLUSIONStachydrine hydrochloride protects against experimental acute cerebral infarction through activation of Wnt/β-catenin signaling pathway.

Stachydrine hydrochloride; Acute cerebral infarction; Wnt/β-catenin signaling pathway

R363.2+1； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.006

1000- 4718(2017)10- 1768- 05

2017- 02- 08

2017- 04- 13

兵團應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃(No. 2015AG014)

△通訊作者 Tel： 0993-2850373； E-mail： xiehuafengmed@126.com

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