ELISA法在乙肝兩對半測定中的質(zhì)量控制分析

張艷秋

【摘要】 分析酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法檢測乙型肝炎（乙肝）兩對半的檢驗步驟， 總結(jié)檢測全程的相關(guān)影響因素。檢測前標本的準備、試劑盒的影響、檢驗人員的業(yè)務(wù)水平、檢測過程中的標準操作規(guī)程、檢測結(jié)果的解讀等是ELISA法檢測乙肝兩對半的相關(guān)影響因素。ELISA法是檢測乙肝兩對半的靈敏方法， 嚴格遵循操作規(guī)程， 加強質(zhì)量控制， 可有效排除相關(guān)影響因素的干擾， 為乙肝的臨床診療提供有力依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 乙肝兩對半；酶聯(lián)免疫吸附實驗；質(zhì)量控制

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.28.115

我國的乙肝病毒目前感染率大概占到總?cè)巳旱?0%～

70%， 這其中乙肝表面抗原攜帶人群占總?cè)丝诘?%左右， 以此計算， 全國約有9300萬人攜帶乙肝病毒， 其中慢性乙肝患者約2000萬例[1-3]。乙肝兩對半作為現(xiàn)階段臨床診斷、治療乙型病毒性肝炎及觀察療效的重要實驗室指標， 主要使用ELISA進行檢測， 其靈敏度高， 但在其檢測過程中影響因素較多， 易導致假陽性或假陰性結(jié)果[4]。因此在實際工作中， 臨床實驗診斷過程中需要加強實驗室的科學管理， 不斷強化檢測的標準流程， 加強實驗室診斷的質(zhì)量控制， 為患者提供準確的檢驗結(jié)果， 有利于疾病的早期診斷和治療， 同時減少醫(yī)患糾紛等問題。

1 檢測前的質(zhì)量控制

1. 1 標本的準備 檢測前應(yīng)該保證標本無溶血現(xiàn)象， 因為溶血導致紅細胞破裂后會將體內(nèi)過氧化物酶活性物質(zhì)釋放，這種過氧化物酶活性物質(zhì)會和顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)， 影響顯色比對；患者血塊完全收縮也可能致使待檢標本中的非特異性活性物質(zhì)出現(xiàn)部分或者完全失活的情況發(fā)生[1]， 尤其是在血液標本尚沒有完全凝固的狀態(tài)下， 若強行對血清進行分離處理會導致纖維蛋白塊形成， 極易導致檢測結(jié)果的假陽性。此外患者基本信息的核對也是標本準備質(zhì)量控制中至關(guān)重要的一步。

1. 2 試劑盒的影響 選擇的試劑盒， 其質(zhì)量是保證實驗診斷結(jié)果準確性、特異性的必要前提。但需要臨床檢驗人員注意的是， 目前市場上不同廠家的試劑盒在特異性、準確性、穩(wěn)定性以及特異性存在一定差異， 因此在實際操作過程中， 要求試劑盒保存在4℃左右的環(huán)境下， 并且需在測定前將試劑盒放置于室溫進行平衡處理約0.5～1.0 h[5]。此外檢測結(jié)果也會因方法學不同而有所差異。例如實際工作中常存在用ELISA法檢測乙肝表面抗原（HBsAg）結(jié)果為陰性， 而電化學發(fā)光法檢測結(jié)果為陽性。除方法學的靈敏度外，還存在使用單克隆或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型乙肝標志物檢測存在一定差異。

1. 3 檢驗人員的業(yè)務(wù)水平 檢驗人員的業(yè)務(wù)水平對檢測結(jié)果同樣會造成重大影響。實驗室檢驗人員需要掌握并嚴格執(zhí)行乙肝兩對半檢測過程中的室內(nèi)、室間質(zhì)量控制方法， 以及失控處理原則。檢驗人員同時還需要熟悉本實驗室實驗操作流程， 掌握乙肝兩對半各項指標的臨床意義[2]， 同時需要學會正確使用加樣器和測定儀器等。

2 檢測過程中的質(zhì)量控制

2. 1 加樣 加樣槍的準確性和吸頭清潔與否可以直接影響檢測結(jié)果， 所以檢測過程中必須嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行加樣。加樣器需經(jīng)常清洗， 定期校準。放置溫育箱前， 必須使用振蕩器將所加樣本震蕩混勻>30 s[6]。

2. 2 溫育 標本加入板孔后， 由于酶標板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同， 抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)都容易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)， 導致檢測孔周邊與內(nèi)部結(jié)果出現(xiàn)差異。尤其實驗室干育易出現(xiàn)周邊效應(yīng)， 反應(yīng)板周邊孔中間孔溫度出現(xiàn)差異， 這會使得檢測結(jié)果準確性直接受升溫速度影響[3]。因此為了使反應(yīng)孔底部均勻升溫， 實際操作過程中常使用水育的方法， 并且盡量保證整版溫度快速地達到平衡，以此減少相應(yīng)的誤差。

2. 3 洗板 洗板作為ELISA法操作過程中一個重要環(huán)節(jié)， 其目的是將未結(jié)合的抗原或抗體、酶標記物復合物中分離出來以保留抗原抗體復合物， 同時還能將非特異性吸附的纖維蛋白原、白蛋白、細菌中酶類物質(zhì)等干擾物除去。檢測中每一次均應(yīng)使用新鮮蒸餾水或去離子水來稀釋洗滌劑， 這樣可以防止因為洗滌液污染而出現(xiàn)結(jié)果誤差[7]。此外洗板機針小孔極易由于血清中殘留的纖維蛋白或洗滌液析出的結(jié)晶導致阻塞， 使得未結(jié)合標記酶不能徹底洗脫。所以在使用洗板機過程中需要定時觀察、檢查洗板機針孔通暢與否， 如出現(xiàn)堵塞時需及時糾正， 洗板機暫停工作時應(yīng)采用蒸餾水清冼數(shù)遍。

2. 4 顯色 顯色是采用ELISA法測定乙肝兩對半過程的最后一個步驟， 其原理是通過適當溫育使反應(yīng)孔內(nèi)酶標物質(zhì)催化底物生成有色產(chǎn)物， 以間接判定待測物含量。光線、溫度及溫育時間等均影響顯色效果。通常底物顯色在37℃、時間在10～40 min內(nèi)可以徹底完成[8]， 因為在光照條件下底物液會自行變色， 所以最后的顯色反應(yīng)該在避光狀態(tài)下進行。

3 檢測結(jié)果解讀的質(zhì)量控制

在終止液加入后10 min內(nèi)應(yīng)完成實驗結(jié)果判斷，以避免反應(yīng)孔出現(xiàn)結(jié)晶反應(yīng)而影響酶標儀檢測結(jié)果。臨床檢驗人員需要有極高的責任心和對工作負責的態(tài)度，保證檢測試劑質(zhì)量、效期。在整個實驗過程中， 外部質(zhì)控血清需要按照相關(guān)規(guī)定進行嚴格管理， 所有復檢標本均需詳細記錄復檢原因、時間、結(jié)果。

人體血清中含有非特異性干擾物質(zhì)，在不同程度地影響ELISA檢測結(jié)果， 如纖維蛋白原、補體、類風濕因子、嗜異性抗體等。此外某些藥物也會對結(jié)果判讀造成一定誤差， 如高效價乙肝免疫球蛋白， 這種物質(zhì)會與HBsAg形成抗原抗體復合物， 導致HBsAg的檢出誤差[9]。

4 臨床意義

①檢測結(jié)果提示HBsAg陽性， 提示該患者已經(jīng)感染乙肝病毒，但是這項結(jié)果并不反映病毒是否存在復制及病毒復制程度， 也無法提示是否存在傳染性。②乙肝病毒表面抗體 （HBsAb）是人體內(nèi)乙肝中和抗體的標志，其陽性提示患者對乙肝病毒存在抵抗， 可以防御乙肝感染。針對乙肝疫苗接種的檢查者，如果僅有HBsAb陽性，應(yīng)作為乙肝疫苗接種后出現(xiàn)的正?，F(xiàn)象。③乙肝病毒e抗原（HBeAg）是人體內(nèi)乙肝病毒復制的標志， 如果若HBeAg持續(xù)陽性>3個月， 則表示疾病可能有慢性化趨勢， 應(yīng)該及時治療。④乙肝病毒e抗體（HBeAb）是乙肝病毒在體內(nèi)復制停止的標志檢查，表示病毒復制在逐步減少，傳染性較弱。⑤乙肝病毒核心抗體（HBcAb），提示檢查者曾經(jīng)感染， 或正在感染乙肝病毒， 免疫球蛋白（Ig）M抗體， 提示患者新近感染或病毒正在復制，在患者感染后體內(nèi)就會產(chǎn)生，對于乙肝臨床診斷的輔助檢查有一定意義。

臨床經(jīng)常使用的術(shù)語：大三陽， 即：HBsAg、HBeAg、HBcAb出現(xiàn)陽性， 往往提示患者體內(nèi)乙肝病毒復制活躍、存在一定傳染性， 但“大三陽”是否會引起嚴重肝細胞損害， 還要視肝功能檢查、臨床體征而定， 諸多研究文獻都已經(jīng)證明“大三陽”并非表示疾病很嚴重， 只是HBsAg、HBeAg、HBcAb指標陽性體現(xiàn)乙肝病毒在機體內(nèi)即時的免疫狀態(tài)[10]。另外一個臨床術(shù)語：小三陽， 是指HBsAg、HBeAb、HBcAb出現(xiàn)陽性， 當出現(xiàn)“小三陽”時， 還需要結(jié)合乙肝病毒復制情況進行分析， 病毒陽性小三陽， 也會對肝細胞進行損傷， 也需要進行治療[11]。

乙肝是當前嚴重危害人們身心健康的常見傳染病之一， 也是醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的一項難題，血清兩對半檢測對乙肝的臨床診斷、治療方案選擇、康復監(jiān)測及療效判定均能起到一定指導作用， 目前乙肝兩對半的常用檢測方法為 ELISA法[4]。但在檢測過程中標本前處理、加樣、洗板及顯色等都可以影響ELISA法測定結(jié)果，如不注意， 極易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果， 影響患者疾病診斷和病情進展。因此在實際操作過程中， 檢驗人員應(yīng)嚴格按照操作程序，保證檢測系統(tǒng)在控， 以及實驗室濕度、溫度符合檢測要求， 設(shè)立陰陽對照及臨界值，以嚴謹、認真、負責的工作態(tài)度對待每一份標本，對檢測結(jié)果存有疑議的標本應(yīng)予以復查并做詳細記錄，杜絕假陽性及假陰性結(jié)果的產(chǎn)生， 保證檢測質(zhì)量，為患者提供準確的檢測結(jié)果。

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[收稿日期：2017-06-06]