閆瑞芳， 李 琴， 苗江歡， 章竹君

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；3.陜西師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安 710062)

林可霉素(Lincomycin)又名潔霉素，是一種林可胺類堿性抗生素，主要用于葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌引起的呼吸道感染、骨髓炎、關(guān)節(jié)和軟組織感染、膽道感染和敗血癥，對某些厭氧菌感染也可應(yīng)用[1]。但若使用不當(dāng)可引起消化道反應(yīng)、過敏反應(yīng)、轉(zhuǎn)氨酶升高、黃疸等，偶爾會有耳鳴、眩暈等不良反應(yīng)。目前常見的測定林可霉素的方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色譜法[3]、毛細(xì)管電泳[4]和化學(xué)發(fā)光分析法[5]?？敲顾?Kanamicina)屬于氨基糖苷類(AGs)抗生素，是由氨基環(huán)醇和氨基糖通過氧橋連接而成的苷類化合物，抗菌譜與慶大霉素相似，對金葡菌、綠膿桿菌、大腸桿菌及變形桿菌等均有效[6]。若使用不當(dāng)可導(dǎo)致一定程度的耳、腎功能損害。常見的卡那霉素的檢測方法有熒光法[7]、分光光度法[8]、方波伏安法[9]和高效液相色譜法[10]。臨床上，林可霉素和卡那霉素可以同時使用，但是鑒于它們各自的副作用，因此必須加強其血藥濃度的監(jiān)測。目前，未見同時測定林可霉素和卡那霉素的相關(guān)報道。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

YN-FGⅠ型化學(xué)發(fā)光分析儀(河南農(nóng)大迅捷測試技術(shù)有限公司);TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);F-4600熒光分光光度計(日本,日立公司)。

卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-3g/mL)：準(zhǔn)確稱取硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)50 mg，溶于水中，定容至50 mL，備用，使用時稀釋到所需濃度。林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-4g/mL)：準(zhǔn)確稱取鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品鑒定所)10 mg，溶于水中，定容至100 mL，備用，使用時稀釋至所需的濃度。魯米諾溶液(1.0×10-2mol/ L)：準(zhǔn)確稱取1.77 g魯米諾(陜西師范大學(xué)分析科學(xué)研究所合成)，用10 mL 1.0 mol/L的NaOH溶液溶解，加水定容于1 000 mL容量瓶中，室溫下放置7 d后使用。PMS溶液(8.0×10-3mol/L)：準(zhǔn)確稱取PMS(K2SO4·KHSO4·2KHSO5，Alfa)0.3078 g,溶解定容至100 mL容量瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用。實驗所需試劑除魯米諾外均為分析純，水為二次去離子水。

1.2 實驗方法

測量前儀器先預(yù)熱20 min。將2.0 mL 8.0×10-3mol/L PMS溶液和2.0 mL 2.5×10-5mol/L魯米諾溶液混合后，直接加入測量池，然后將含有林可霉素和卡那霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液通過自動開關(guān)加入到測量池中，加入的同時，反應(yīng)池與光電倍增管的連接開關(guān)已被打開。數(shù)據(jù)處理儀記錄化學(xué)發(fā)光的動力學(xué)曲線。根據(jù)峰高和峰面積分別對林可霉素和卡那霉素進(jìn)行定量測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 林可霉素和卡那霉素的后化學(xué)發(fā)光行為及反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)

圖1 化學(xué)發(fā)光強度-時間曲線Fig.1 The CL intensity-time curve1.2.0 mL 8.0×10-3 mol/L PMS solution was injected into 2.0 mL 2.5×10-5mol/L Luminol solution(in Na2CO3-NaHCO3， pH=11.25);2.the solution containing 8.0×10-6 g/mL kanamicina and 8.0×10-8 g/mL lincomycin was injected into the above reaction mixture(a.the optical signal of lincomycin reaction， b.the optical signal of kanamicina reaction).

如圖1所示，PMS溶液加入到魯米諾溶液中后立即發(fā)生化學(xué)反應(yīng)(峰1)，大約1 s后反應(yīng)結(jié)束，化學(xué)發(fā)光信號衰減并逐漸回落到基線。此時，將含有林可霉素和卡那霉素的溶液加入到上述反應(yīng)混合液中，又立即引發(fā)一快一慢的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。林可霉素的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(峰a)很快，大約0.8 s達(dá)到峰值，1.2 s后化學(xué)發(fā)光信號回到基線。而卡那霉素的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(峰b)較慢，化學(xué)發(fā)光信號大約54.8 s后達(dá)到峰值，該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)持續(xù)10 min才回到基線。把含有林可霉素和卡那霉素的溶液單獨加入到PMS溶液或魯米諾溶液中均無化學(xué)發(fā)光信號產(chǎn)生。在同樣條件下，用空白溶液代替含有林可霉素和卡那霉素的溶液進(jìn)行實驗，卻未檢測到化學(xué)發(fā)光信號。

林可霉素和卡那霉素的濃度比在一定范圍內(nèi)，他們的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)各自獨立進(jìn)行，互不干擾，其動力學(xué)曲線呈現(xiàn)出隨時間分開的兩個獨立的發(fā)光峰。根據(jù)峰高和峰面積分別對溶液中林可霉素和卡那霉素進(jìn)行定量。為減小誤差，我們僅選擇一定區(qū)間范圍的峰面積進(jìn)行積分定量分析，如30～80 s。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1魯米諾溶液濃度的影響魯米諾溶液的濃度對化學(xué)發(fā)光信號的影響較大。在5.0×10-6～2.5×10-4mol/L范圍內(nèi)，考察了魯米諾溶液的濃度對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)魯米諾溶液的濃度為2.5×10-5mol/L時，化學(xué)發(fā)光信號強度最大，故選用魯米諾溶液的濃度為2.5×10-5mol/L。

2.2.2PMS溶液濃度的影響在6.0×10-4～6.0×10-2mol/L范圍內(nèi)，考察了PMS溶液的濃度對測定結(jié)果的影響。當(dāng)PMS溶液濃度為8.0×10-3mol/L時，化學(xué)發(fā)光信號強度最大，故選用PMS溶液的濃度為8.0×10-3mol/L。

2.2.3緩沖介質(zhì)及其pH值的影響研究了不同緩沖介質(zhì)對化學(xué)發(fā)光強度的影響。如NaOH、Na2CO3、Na2CO3-NaHCO3、NaHCO3-NaOH、Na2B4O7、NaH2PO4-NaOH等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)緩沖介質(zhì)為NaHCO3-NaOH時，化學(xué)發(fā)光信號強度最大。故選擇緩沖介質(zhì)為NaHCO3-NaOH。用NaHCO3-NaOH緩沖溶液配制魯米諾工作液。在pH值10.5～12.0的范圍內(nèi)考察緩沖溶液pH對化學(xué)發(fā)光信號的影響，結(jié)果表明當(dāng)緩沖溶液的pH值為11.25時最合適，此時，可得到最大的化學(xué)發(fā)光信號。

2.3 分析性能

在最佳實驗條件下，根據(jù)1.2節(jié)的操作步驟，考察了林可霉素和卡那霉素濃度與其后化學(xué)發(fā)光強度的關(guān)系。結(jié)果表明，林可霉素和卡那霉素濃度分別在4.0×10-9～8.0×10-7g/mL和4.0×10-7～8.0×10-5g/mL范圍內(nèi)與其后化學(xué)發(fā)光強度呈良好的線性關(guān)系。林可霉素、卡那霉素的線性回歸方程分別為：y=0.2701c+1.670(r=0.9924)，y=0.0545c+1.9094(r=0.9942)。對濃度為8.0×10-8g/mL的林可霉素溶液11次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.6%，對濃度為8.0×10-6g/mL的卡那霉素溶液11次平行測定的RSD為3.3%。按照IUPAC建議，該方法測定林可霉素和卡那霉素兩種物質(zhì)的檢出限分別為1.0×10-9g/mL和1.0×10-7g/mL。

2.4 本方法與其他分析方法的比較

與文獻(xiàn)報道的測定林可霉素和卡那霉素的方法其他相比，本方法測定卡那霉素的線性范圍和靈敏度相當(dāng)，但測定林可霉素的靈敏度要高，檢出限低，見表1。

表1 本方法與文獻(xiàn)報道分析方法的比較

2.5 干擾實驗

在選定的實驗條件下，用8.0×10-6g/mL卡那霉素和8.0×10-8g/mL林可霉素進(jìn)行干擾試驗，允許相對誤差在±5%。結(jié)果表明，血液樣品經(jīng)高速離心后，樣品中蛋白質(zhì)的干擾可以忽略不計。血清中的其他物質(zhì)如鹽、脂質(zhì)、氨基酸等對同時測定卡那霉素和林可霉素?zé)o干擾。對于樣品來說，主要的干擾來自抗壞血酸和一些重金屬離子，如：Co2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Cu2+。重金屬離子的干擾可以通過EDTA 掩蔽后消除。溶液稀釋40倍后，不干擾測定。

2.6 樣品分析

取0.5～1.0 mL健康人體血漿樣品(陜西師范大學(xué)校醫(yī)院)，加入一定量林可霉素和卡那霉素的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，混勻，4 ℃、10 000 r/min超濾膜過濾離心10 min，以除去蛋白質(zhì)。取無蛋白的上清液50 μL 稀釋40倍，按照1.2所述的操作方法測定林可霉素和卡那霉素的含量，以未加林可霉素和卡那霉素的去蛋白血清同倍稀釋溶液做空白。測定結(jié)果列于表2。

2.7 化學(xué)發(fā)光機理探討

在改裝的970-CRT熒光分光光度計上分別繪制了PMS -魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，以及含有林可霉素和卡那霉素溶液在PMS -魯米諾體系中引發(fā)的后化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光光譜(圖2)。從圖中可以看出，兩個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的最大發(fā)射波長均為425 nm，這說明后化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與PMS -魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有相同的發(fā)光體。眾所周知，魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光體是激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子(3-AP*)。從而可以確定所研究的后化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光體是3-AP*。

表2 人血清樣品中林可霉素和卡那霉素的測定結(jié)果(n=3)

在TU-1901紫外-可見分光光度計上分別掃描了(林可霉素+卡那霉素)溶液(a)、PMS -(林可霉素+卡那霉素)混合溶液(b)的紫外-可見吸收光譜(圖3)。(林可霉素+卡那霉素)溶液的紫外-可見吸收光譜在波長198 nm處有吸收峰。結(jié)果表明，在b的紫外-可見吸收光譜圖上，(林可霉素+卡那霉素)在波長198 nm處的特征吸收峰消失了。

圖3 紫外吸收光譜Fig.3 UV-Vis spectraa.the mixed solution of kanamicina(8.0×10-6 g/mL) and lincomycin(8.0×10-8 g/mL);b.PMS -the solution containing kanamicina(8.0×10-6 g/mL) and lincomycin(8.0×10-8 g/mL).

根據(jù)以上結(jié)果，我們推測含有林可霉素和卡那霉素的溶液在PMS -魯米諾體系中后化學(xué)反應(yīng)的機理可能是：堿性條件下，PMS氧化魯米諾，生成3-AP*，3-AP*回到基態(tài)時，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光?；氐交鶓B(tài)的3-AP存留于反應(yīng)后的溶液之中，可以吸收能量再次被激發(fā)。當(dāng)含有林可霉素和卡那霉素溶液加入到此反應(yīng)后的溶液之中時，PMS氧化(林可霉素+卡那霉素)并釋放出一定的能量，溶液中存留的3-AP吸收了該反應(yīng)釋放的能量而再次被激發(fā)。激發(fā)態(tài)3-AP回到基態(tài)時產(chǎn)生了后化學(xué)發(fā)光。

此機理可以簡單地表示如下：

3 結(jié)論

在PMS -魯米諾體系中，林可霉素的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)較快，而卡那霉素的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)較慢，基于林可霉素和卡那霉素的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)不同，建立了同時測定林可霉素和卡那霉素的時間分辨后化學(xué)發(fā)光的新的分析方法。該方法與以前報道的方法相比，具有很好的選擇性和靈敏度。