固相萃取-高效液相色譜同時測定沼液中3種四環(huán)素類和6種磺胺類抗生素

賀南南， 管永祥， 梁永紅， 吳田鄉(xiāng)， 趙海燕*, 羅朝暉*， 顧祖麗, 吳 昊

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.江蘇省耕地質(zhì)量與農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)站，江蘇南京 210036；3.江蘇省互聯(lián)網(wǎng)農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，江蘇南京 2100361)

隨著集約化畜牧養(yǎng)殖業(yè)和生態(tài)農(nóng)業(yè)的持續(xù)性發(fā)展，人們對發(fā)展沼氣生態(tài)農(nóng)業(yè)的熱情越來越高。目前，主要以畜禽糞便作為發(fā)酵原料的沼液，因其含有植物生長的各種養(yǎng)分[1]，經(jīng)常被作為生物有機(jī)肥料施用到農(nóng)田中。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，由于抗生素具有能促進(jìn)動物生長、預(yù)防動物疾病、提高飼料利用率等特點(diǎn)，因而被長期廣泛使用，并且濫用情況十分嚴(yán)重[2]。然而，抗生素大多不能被動物完全吸收，主要以母體或代謝物的形式排出體外[3]，并隨畜禽糞便進(jìn)入沼氣發(fā)酵過程中，導(dǎo)致沼液中可能存在較高濃度的抗生素殘留。此類沼液一旦施用到農(nóng)田上，將會對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重威脅[4]。因此，沼液基質(zhì)中抗生素的研究逐漸成為了熱點(diǎn)。

目前，對抗生素的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)和高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)[5]。LC-MS法雖可提高定量分析的精密度、靈敏度，但操作復(fù)雜且檢測成本高[6]，HPLC技術(shù)與其相比具有低廉的檢測費(fèi)用、易于操作且檢測速度快的特點(diǎn)，已成功用于不同環(huán)境基質(zhì)中抗生素的定量分析[7 - 10]。然而，利用HPLC法分析沼液中的抗生素的報道較少。本研究中選用以往研究中檢出率和檢出濃度較高的3種四環(huán)素類(TCs)和6種磺胺類(SAs)抗生素作為目標(biāo)分析物，優(yōu)化了固相萃取凈化及HPLC法測定條件，建立了一種同時測定沼液中上述9種抗生素的方法。結(jié)果表明，該方法可成功應(yīng)用于實際沼液中目標(biāo)抗生素的測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1206高效液相色譜儀(美國，安捷倫公司)；真空泵、十二孔固相萃取裝置(東康科技有限公司)；超聲波清洗儀(昆山禾超聲儀器有限公司)；SAX 和HLB固相萃取柱(3 mL/60mg，月旭科技股份有限公司)；pH計(德國，Sartorius公司)；超聲清洗儀、超純水器(南京易普易達(dá)發(fā)展有限公司制造)；萬分之一天平(SHIMADAU公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國,BUCHI公司)。

鹽酸土霉素(OTC)、鹽酸四環(huán)素(TC)、鹽酸金霉素(CTC)、磺胺嘧啶(SDZ)，磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲基嘧啶(SDMD)、磺胺異惡唑(SMX)、磺胺吡啶(SPD)標(biāo)準(zhǔn)品，均購于上海瑞永生物科技有限公司，純度為98%。標(biāo)準(zhǔn)品貯備液：分別稱取0.0100 g 的OTC、TC、CTC、SDZ、SMZ、SPD、SMR、SDMD、SMX標(biāo)準(zhǔn)品，加入少量甲醇溶解，用超純水稀釋定容至100 mL棕色容量瓶，配制成100 mg·L-1的儲備液，置于4 ℃冰箱保存。使用時用超純水稀釋至所需濃度。甲醇、乙腈為色譜純(Merk公司)，甲酸、NaOH、檸檬酸、Na2HPO4、Na2EDTA、HCl等均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 樣品的采集與處理

沼液樣品采自于南京市郊區(qū)3個大中型沼氣工程。以牛糞為發(fā)酵原料的沼液采自南京市浦口區(qū)永寧鎮(zhèn)友聯(lián)村；以豬糞為發(fā)酵原料的沼液采自南京市浦口區(qū)大林養(yǎng)殖場；以雞糞為發(fā)酵原料的沼液采自南京市江寧區(qū)新洲蛋雞養(yǎng)殖場。多點(diǎn)收集新鮮沼液并混合均勻成為一個沼液樣品，避光密封，帶回實驗室在室溫條件下保存。

采集的沼液先通過濾紙過濾除去懸浮物，再通過0.7 μm玻璃纖維過濾后，準(zhǔn)確量取濾液50 mL到燒杯中，加入0.25 g的Na2EDTA，用HCl調(diào)節(jié)樣品pH=4左右。濾液經(jīng)過漩渦均質(zhì)后，以1 mL·min-1的速率通過Oasis HLB固相萃取柱(Oasis HLB固相萃取柱使用前，先后用6 mL甲醇、6 mL超純水、6 mL HCl(pH=4)進(jìn)行預(yù)處理)，進(jìn)行富集后，用6 mL超純水清洗固相萃取柱，并真空干燥30 min。最后用6 mL 甲醇緩慢洗脫到10 mL離心管中，將收集的洗脫液在40 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2 mL超純水復(fù)溶，超聲 5 min促溶。以上溶液均過0.22 μm水系濾膜后，置于棕色玻璃瓶中待測。

1.3 高效液相色譜檢測條件

色譜柱：Shim-PackVP-ODS柱(250×4.6 mm,5 μm)；流動相：0.1%甲酸-乙腈(81∶19，V/V)，流量1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 ℃；紫外檢測波長270 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1檢測波長的確定研究表明，TCs[11]與SAs[12]在270 nm波長附近具有強(qiáng)烈的紫外吸收。在本實驗中，以 270 nm為檢測波長對9種目標(biāo)抗生素同時進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，270 nm 時9種抗生素的響應(yīng)較強(qiáng)，且分布相對均勻。因而，本研究選擇以270 nm 作為檢測波長。

2.1.2流動相的選擇與配比據(jù)報道[13 - 15]，0.1%甲酸水溶液和乙腈的二元流動相體系可用于多種抗生素的同時檢測，但大部分都是梯度洗脫程序，過程繁瑣，而采用等度洗脫鮮有報道。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體積比為81∶19的0.1%甲酸水溶液和乙腈等度洗脫時分離效果最佳。

2.1.3柱溫的選擇研究發(fā)現(xiàn)柱溫會極大程度地影響待測組分的分離效果。實驗結(jié)果表明，柱溫25 ℃時，不僅使得3種TCs和6種SAs達(dá)到了最大程度的基線分離，而且對色譜柱和儀器會起到良好的保護(hù)作用。而當(dāng)柱溫低于或者高于25 ℃時，TC和OTC、SMZ和SPD均發(fā)生了部分信號重疊。

2.1.4流動相流速實驗發(fā)現(xiàn)流動相流速在0.5～1.2 mL·min-1范圍內(nèi)對于抗生素的分離效果影響不大，兼顧分離度、分離時間及柱效，本實驗選擇1.0 mL·min-1為最佳流速。

2.1.5色譜柱的選擇本研究分別對安捷倫公司的Agilent XDB-C18柱(250×4.6 mm,5 μm)和日本島津公司的Shim-PackVP-ODS柱(250×4.6 mm,5 μm)的分離效果進(jìn)行對比。結(jié)果表明，Agilent XDB-C18色譜柱只能分離出8種抗生素，色譜峰分布不均勻且嚴(yán)重偏離基線。而 Shim-PackVP-ODS色譜柱可成功分離9種抗生素，且峰形良好。

2.1.6方法線性范圍、定量下限及精密度在最佳實驗條件下，以質(zhì)量濃度(c)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積(S)為縱坐標(biāo)，得到了3種TCs和6種SAs的線性范圍，結(jié)果見表1。9種抗生素在0.02～10 mg·L-1范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0.999。以3倍信噪比(S/N=3)所對應(yīng)的濃度為方法檢出限，9種抗生素的檢出限范圍為2.8～21.0 μg·L-1。同已有其它基質(zhì)中TCs和SAs分析方法的檢出限[16 - 18]相比，本方法檢出限能滿足要求。選定某一濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，在最適宜條件下連續(xù)進(jìn)樣10次分離測定，9種抗生素的保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別不高于0.66%和4.3%。

表1 目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限及精密度(n=10)

2.2 SPE凈化過程的優(yōu)化

2.2.1固相萃取柱選擇本實驗將20 mL 2.0 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別選用 SAX和HLB聯(lián)用小柱和HLB小柱進(jìn)行過柱，結(jié)果顯示SAX和 HLB聯(lián)用小柱的9種目標(biāo)抗生素回收率在76.6%～89.6%范圍。 HLB小柱的回收率范圍為73.0%～92.7%。其中，OTC、CTC、SMZ、SDMD、SMX的回收率高于SAX和 HLB聯(lián)用小柱，這可能是由于SAX 柱持留了部分的目標(biāo)物，阻礙了抗生素的洗脫效率。故本實驗選擇HLB 小柱凈化樣品。

2.2.2洗脫溶劑和洗脫體積將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水稀釋，使各目標(biāo)物以 1 mg·L-1濃度過HLB柱，每個樣品重復(fù)3次，選用甲醇、乙腈做為洗脫劑。結(jié)果表明，甲醇洗脫時樣品9種目標(biāo)抗生素的回收率均高于乙腈洗脫時的回收率，所以在本研究中選用甲醇對沼液實際樣品進(jìn)行洗脫。試驗了甲醇洗脫體積對洗脫率的影響，當(dāng)甲醇洗脫量為6 mL時目標(biāo)物洗脫率達(dá)最高值，7 mL基本保持穩(wěn)定，所以確定最佳洗脫體積為 6 mL。

2.3 實際沼液中的條件優(yōu)化

圖1 目標(biāo)化合物在不同樣品pH下的回收率Fig.1 Recoveries of Analytes at different pH values

2.3.1樣品pH值實驗中將加標(biāo)濃度為0.1 mg·L-1沼液樣品50 mL用HCl調(diào)節(jié)pH至1～7范圍,比較不同pH下樣品的回收率情況。如圖1所示，pH為1～4時，樣品總體的回收率隨著pH升高而升高，沼液樣品在pH=4時，抗生素的回收率均達(dá)到最大值，除了SMZ和SMX，回收率范圍在84%～95%。而隨著pH的升高，部分或整體的抗生素的回收率呈現(xiàn)下降的趨勢。這可能是由于TCs和SAs屬于兩性化合物，與它們的pKa相關(guān)。因此，本研究中將沼液樣品pH調(diào)至4后再過固相萃取小柱富集。

2.3.2提取劑的選擇本研究將50 mL加標(biāo)水平為1、2 mg·L-1的沼液樣品調(diào)至pH=4，按照上述萃取過程萃取并測定，比較了Na2EDTA-McIlvaine 緩沖溶液(pH=4)和單獨(dú)使用Na2EDTA溶液提取沼液各目標(biāo)物的回收率，每個樣品重復(fù)測定3次，結(jié)果表明Na2EDTA 溶液提取OTC、SDZ、SMZ、SDMD比Na2EDTA-McIlvaine緩沖液提取效果好，可能是由于Na2EDTA-McIlvaine緩沖液易堵塞固相萃取裝置。經(jīng)綜合考慮本實驗使用Na2EDTA溶液作為沼液中3種TCs和6種SAs的提取劑。

2.4 方法精密度及加標(biāo)回收率

取實際沼液樣品，分別制得濃度為0.05、0.1、0.2、0.5 mg·L-1的加標(biāo)樣品，按照上述的提取方法和色譜條件進(jìn)行前處理和測定，外標(biāo)法定量，每個濃度水平重復(fù)測定3次。3種沼氣樣品液中各目標(biāo)物的平均回收率在74.2%～102.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于10%。表2為豬糞發(fā)酵沼液中各目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率；圖2為0.5 mg·L-1加標(biāo)水平樣品的色譜圖。由圖2可見，各目標(biāo)物的色譜峰得到良好的分離。

表2 目標(biāo)化合物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差精密度(n=3)

2.5 實際樣品的測定

將實際采集的以豬糞、雞糞和牛糞為發(fā)酵原料的沼液，照上述預(yù)處理方法和色譜條件進(jìn)行提取檢測分析，其中以雞糞為發(fā)酵原料的沼液的色譜圖見圖3。結(jié)果表明，以豬糞為發(fā)酵原料的沼液中檢出的SDZ、 SMZ 、SMR 3種抗生素，其含量范圍為34.9～118.5 μg·L-1；以牛糞為發(fā)酵原料的沼液中檢出的OTC、CTC、SPD、SMX 4種抗生素，其含量范圍為21.7～51.9 μg·L-1；以雞糞為發(fā)酵原料的沼液中檢出的OTC、TC、SDZ、SMZ、SMR、SMX 6種抗生素，其含量范圍為28.5～125.5 μg·L-1，其中SMZ的殘留量最高。

圖2 沼液加標(biāo)樣品(0.5 mg·L-1)中目標(biāo)化合物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of analytes in a spiked sample(0.5 mg·L-1) of biogas slurry

圖3 以雞糞為發(fā)酵原料的沼液中目標(biāo)化合物的色譜圖Fig.3 Chromatogram of analytes in biogas slurry samples fermented with chicken dung

3 結(jié)論

本研究建立了一種 SPE-HPLC 法同時測定沼液中3種四環(huán)素和6種磺胺類抗生素的方法，該方法的檢出限為2.8～21.0 μg·L-1。方法對實際沼液中目標(biāo)物的回收率范圍為74.2%～102.9%。經(jīng)過對南京以豬糞、牛糞、雞糞為發(fā)酵原料的3個沼氣工程的沼液樣品中3種TCs和6種SAs的殘留分析，發(fā)現(xiàn)這3種不同沼液環(huán)境中磺胺嘧啶和磺胺甲惡唑檢出頻率最高，而且磺胺甲惡唑在以豬糞、雞糞為發(fā)酵原料的沼液中檢出濃度最大。