• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    邢臺(tái)地區(qū)275株結(jié)核分枝桿菌VNTR基因分型及表型耐藥研究

    2017-10-19 06:38:17張志李雅楠高會(huì)霞許怡戴二黑
    臨床肺科雜志 2017年10期
    關(guān)鍵詞:結(jié)核分型結(jié)核病

    張志 李雅楠 高會(huì)霞 許怡 戴二黑

    邢臺(tái)地區(qū)275株結(jié)核分枝桿菌VNTR基因分型及表型耐藥研究

    張志 李雅楠 高會(huì)霞 許怡 戴二黑

    目的初步了解邢臺(tái)地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的基因型多態(tài)性及表型耐藥特征,探討各基因型與表型耐藥之間的相關(guān)性。方法收集2014年1月至2014年10月期間在邢臺(tái)市傳染病醫(yī)院就診的結(jié)核病患者經(jīng)臨床分離培養(yǎng)得到的結(jié)核分枝桿菌菌株及相應(yīng)病例背景資料,采用15位點(diǎn)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分析(VNTR)進(jìn)行基因分型研究,采用比例法進(jìn)行一線抗結(jié)核藥的藥物敏感性試驗(yàn)。運(yùn)用BioNumerics 5.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析,運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果該地區(qū)的總耐藥率為31.6%,初始耐藥率為24.2%,獲得性耐藥率為56.3%。復(fù)治患者的耐藥率顯著高于初治患者耐藥率。275株結(jié)核分枝桿菌可分為145種VNTR基因型,其中165株菌被聚類(lèi)為35個(gè)簇,110株菌的基因型為獨(dú)特基因型。VNTR對(duì)所有菌株的HGDI值為0.9838。成簇型菌株與獨(dú)特型菌株在患者年齡、性別、職業(yè)、地勢(shì)、治療史、吸煙史、糖尿病史等的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。成簇型菌株與獨(dú)特型菌株的單耐藥水平和耐多藥水平也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論邢臺(tái)地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株呈現(xiàn)明顯的基因多態(tài)性。本研究尚未發(fā)現(xiàn)VNTR基因分型與表型耐藥的相關(guān)性。

    結(jié)核分枝桿菌;基因分型;多位點(diǎn)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的呼吸道傳染性疾病。隨著京津冀一體化加速,人口流動(dòng)性增加,艾滋病廣泛傳播,結(jié)核病疫情不斷加劇。分子流行病學(xué)研究能夠從病原分子水平監(jiān)測(cè)傳染病的暴發(fā)、追蹤傳染源并揭示感染傳播機(jī)制。但是,目前尚無(wú)邢臺(tái)地區(qū)結(jié)核分枝桿菌分子流行病學(xué)研究的報(bào)道。本研究擬通過(guò)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分析(VNTR)對(duì)邢臺(tái)地區(qū)MTB臨床分離株進(jìn)行基因分型研究,以初步了解該地區(qū)MTB的基因分型特征,并采用比例法進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn),探討各基因型與表型耐藥之間的相關(guān)性。

    資料與方法

    一、菌株來(lái)源

    在2014年1月至2014年10月共收集到結(jié)核分枝桿菌臨床分離株275株。所有菌株均在邢臺(tái)市傳染病醫(yī)院就診的結(jié)核病患者的痰標(biāo)本,經(jīng)臨床分離培養(yǎng)獲得,并經(jīng)PNB/TCH鑒別培養(yǎng)基鑒定的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株,-80℃保存。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室提供。

    二、病例信息

    男性患者181例,女性患者94例。初治211例,復(fù)治64例。93名患者有吸煙史,36名患者合并糖尿病。患者以農(nóng)民、學(xué)生、工人為主,其中農(nóng)民有151例,占總數(shù)的54.9%。

    三、主要試劑

    異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素含藥培養(yǎng)基,購(gòu)自武漢貝索生物技術(shù)有限公司。DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司,2×Taq MasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物公司合成。

    四、藥敏試驗(yàn)

    采用比例法藥敏試驗(yàn),按照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》的固體培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟進(jìn)行[1]。取適量菌懸液采用濃度梯度稀釋法制備濃度分別為10-2mg/mL和10-4mg/mL的菌懸液,分別接種于4種含藥培養(yǎng)基(異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇)和陰性對(duì)照培養(yǎng)基斜面上,每批實(shí)驗(yàn)以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照。接種后的培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng),每周觀察一次,28后記錄結(jié)果。耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)/陰性對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù))×100%。若耐藥百分比>1%,認(rèn)為該菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥;若耐藥百分比≤1%,認(rèn)為是敏感菌。

    五、DNA提取

    將菌落從羅氏培養(yǎng)基上刮下,置于200μL 細(xì)菌裂解液中,置于渦流機(jī)充分震蕩。金屬浴100℃,10min后拿出,置于室溫2min。13,000g離心5min。取上清液移至1.5mL離心管中。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    六、VNTR檢測(cè)

    1 采用15位點(diǎn)VNTR對(duì)菌株進(jìn)行基因分型研究[2-3]。采用Hunter-Gaston分辨指數(shù)(Hunter- Gaston discriminatory Index,HGDI)來(lái)評(píng)價(jià)各位點(diǎn)對(duì)菌株的分辨能力,即等位基因多態(tài)性。采用成簇率評(píng)價(jià)該地區(qū)菌株的近期傳播情況。計(jì)算公式:

    (其中N代表菌株總數(shù),s代表總的基因型數(shù),nj代表屬于j基因型的菌株數(shù))

    2 PCR反應(yīng)體系(20μL):上、下游引物(10μM)各1μL,DNA模板1μL,2×Taq Master Mix 10μL,ddH2O 7μL;陽(yáng)性對(duì)照為結(jié)核分枝桿菌H37Rv,陰性對(duì)照為ddH2O。

    3 PCR反應(yīng)條件:94℃ 5min(預(yù)變性),94℃ 30s(變性),60℃ 30s(退火),72℃ 45s(延伸),35個(gè)循環(huán);72℃ 10min(充分延伸)。

    4 檢測(cè)和分析:配置濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠(其中加入0.4μg/mL的DNA染料GoldView),上樣量為3 μL,電泳電壓采用10 V/cm,當(dāng)指示劑距下一排上樣孔2cm時(shí),停止電泳。采用BIO-RAD凝膠成像儀進(jìn)行凝膠成像,以標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv作為對(duì)照,用100 bp DNA Marker來(lái)確定相對(duì)分子質(zhì)量的大小,將指紋圖譜數(shù)字化,再用BioNumerics 5.0軟件(Applied Maths,比利時(shí))進(jìn)行聚類(lèi)分析。

    七、統(tǒng)計(jì)分析

    計(jì)數(shù)資料之間的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)。所有假設(shè)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),P值小于0.05時(shí),認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、藥敏結(jié)果

    188株MTB菌株對(duì)四種一線抗結(jié)核藥(異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇)均敏感,87株至少對(duì)一種藥物耐藥。其中,17株單耐鏈霉素,6株單耐異煙肼,3株單耐利福平,1株單耐乙胺丁醇,3株對(duì)鏈霉素和異煙肼同時(shí)耐藥,5株對(duì)異煙肼和利福平同時(shí)耐藥,3株對(duì)鏈霉素和利福平同時(shí)耐藥,1株對(duì)鏈霉素和乙胺丁醇同時(shí)耐藥,20株對(duì)鏈霉素、異煙肼和利福平同時(shí)耐藥,5株對(duì)異煙肼、利福平和乙胺丁醇同時(shí)耐藥,23株對(duì)四種藥均耐藥。耐兩種以上藥物的菌株有60株,占所有菌株的21.8%,占耐藥株的69.0%。復(fù)治患者的耐藥率為56.3%(36/64),初治患者的耐藥率為24.2%(51/211),復(fù)治患者的耐藥率顯著高于初治患者的耐藥率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。此外,分析了敏感菌株和耐藥菌株與患者背景資料之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示,敏感菌株和耐藥菌株在患者年齡、性別、職業(yè)、生活地勢(shì)、吸煙史、糖尿病史以及治療史等方面的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,(見(jiàn)表1)。

    二、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分析

    本研究選取了15個(gè)VNTR基因位點(diǎn)對(duì)275株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行基因分型,結(jié)果顯示不同菌株的DNA指紋圖譜在某些位點(diǎn)呈現(xiàn)多態(tài)性,在某些位點(diǎn)呈現(xiàn)一致性,聚類(lèi)分析結(jié)果(見(jiàn)圖1)。經(jīng)BioNumerics軟件聚類(lèi)分析,275株結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)145種基因型,其中110株菌為單一菌株類(lèi)型,呈現(xiàn)獨(dú)特的基因型,占所有菌株的40.0%;165株菌可被聚類(lèi)為35個(gè)簇,占所有菌株的60.0%。最大的一簇包含28株(10.18%)菌株,在15個(gè)VNTR位點(diǎn)的擴(kuò)增片段拷貝數(shù)依次為:4 2 4 3 5 3 3 5 7 3 3 3 5 4 4。成簇型和獨(dú)特型在患者的年齡、職業(yè)、地勢(shì)、性別、吸煙史、糖尿病及結(jié)核病治療史等之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。(見(jiàn)表2)。

    三、成簇型和獨(dú)特型結(jié)核分枝桿菌與表型耐藥的相關(guān)性分析

    本研究將275株結(jié)核分枝桿菌分為成簇型和獨(dú)特型,分別為165株(60.0%,165/275)和110株(40.0%,110/275)。其中任意耐藥成簇型菌株為46株(27.9%,46/165),任意耐藥獨(dú)特型菌株為31株(28.2%,31/110)。經(jīng)卡方檢驗(yàn),成簇型菌株和獨(dú)特型菌株的任意耐藥率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,各藥的單耐藥率由于菌株數(shù)量太少,無(wú)法統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)表3)。

    圖1 VNTR聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

    特征分類(lèi)所有菌株(n=275)耐藥菌株(n=87)OR值(95%CI)χ2值P值年齡 <2025(9.1%)10(40.0%)1.0 20-129(46.9%)42(32.6%)0.7241(0.300-1.748)0.51860.4715 40-81(29.5%)26(32.1%)0.7091(0.281-1.791)0.53180.4659 ≥6040(14.5%)9(22.5%)0.4355(0.146-1.297)2.2780.1313職業(yè) 工人31(11.3%)8(25.8%)1.0 農(nóng)民151(54.9%)39(25.8%)1.001(0.414-2.422)0.0000.9980 學(xué)生37(13.5%)14(37.8%)1.750(0.616-4.969)1.1160.2909 其他56(20.4%)26(46.4%)2.429(0.953-6.514)3.5640.0590地勢(shì) 山區(qū)65(23.6%)23(35.4%)1.00.55290.4571 平原210(76.4%)64(30.5%)0.801(0.445-1.440)性別 女性94(34.2%)28(29.8%)1.00.22580.6347 男性181(65.8%)59(32.6%)1.140(0.664-1.957)吸煙史 無(wú)182(66.2%)56(30.8%)1.00.18710.6653 有93(33.8%)31(33.3%)1.125(0.660-1.919)糖尿病 無(wú)239(86.9%)75(31.4%)1.00.05520.8143 有36(13.1%)12(33.3%)1.093(0.519-2.303)治療史 初治211(76.7%)51(24.2%)1.023.37<0.0001 復(fù)治64(23.3%)36(56.3%)4.034(2.245-7.248)

    OR: Odds ratio,相對(duì)危險(xiǎn)度,以耐藥菌株計(jì)算。CI:Confidence interval,可信區(qū)間。

    四、VNTR多態(tài)性檢測(cè)

    本次共選取了15個(gè)特異性較好的VNTR位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果顯示邢臺(tái)地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的不同位點(diǎn)的多態(tài)性,即漢高指數(shù)(Hunter-Gaston discriminatory index, HGDI)具有較大差異,HGDI值越大表示該位點(diǎn)的多態(tài)性越好。一般來(lái)說(shuō),HGDI>0.60表示分辨能力較高,多態(tài)性較好;0.3

    討 論

    本研究對(duì)275株分離自邢臺(tái)地區(qū)結(jié)核病患者痰標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行了基因分型和表型耐藥檢測(cè),結(jié)果顯示該地區(qū)結(jié)核分枝桿菌菌株的總耐藥率為31.6%(87/275),略低于2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果(36.8%)[4]。耐兩種及兩種以上抗結(jié)核藥物的菌株有60株,占所有菌株的21.8%(60/275),主要集中在復(fù)治患者中,由此分析,長(zhǎng)期不規(guī)律應(yīng)用抗生素是造成菌株耐藥的一個(gè)重要因素。因此臨床上應(yīng)規(guī)范使用抗結(jié)核藥物,根據(jù)藥敏結(jié)果及時(shí)調(diào)整治療方案,同時(shí)應(yīng)提高病人用藥的依從性,從源頭上降低耐藥性的產(chǎn)生。

    表2 VNTR結(jié)果與患者臨床資料之間的相關(guān)性

    OR: Odds ratio,相對(duì)危險(xiǎn)度。CI:Confidence interval,可信區(qū)間。

    表3 成簇型和獨(dú)特型與表型耐藥的相關(guān)性分析

    注:表中括號(hào)外數(shù)值為各類(lèi)耐藥的菌株數(shù),括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“耐藥率(%)”;“-”表示菌株數(shù)量太少無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

    表4 各VNTR位點(diǎn)的等位基因多態(tài)性

    本研究發(fā)現(xiàn),邢臺(tái)地區(qū)結(jié)核病患者的男女比例為1.93:1(181:94),各年齡段均有發(fā)病,20-30歲患病人數(shù)最多,占總數(shù)的46.9%,其次是40-50歲,占29.5%。男性患者的菌株耐藥率和VNTR成簇率均高于女性患者的菌株耐藥率和VNTR成簇率,但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。劉泓等[5]分析了肺結(jié)核患者產(chǎn)生耐藥的危險(xiǎn)因素,結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥性的產(chǎn)生與性別、年齡、職業(yè)、吸煙史等無(wú)關(guān),與治療史有關(guān),復(fù)治患者產(chǎn)生耐藥的危險(xiǎn)性是初治患者的3.324倍,與本文的分析結(jié)果一致。

    本文通過(guò)VNTR基因分型研究發(fā)現(xiàn),邢臺(tái)地區(qū)結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)明顯的基因型多態(tài)性。HGDI值顯示,本研究所采用的15位點(diǎn)VNTR分型技術(shù)適合用于邢臺(tái)地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因分型研究。275株結(jié)核分枝桿菌通過(guò)VNTR可分為成簇型和獨(dú)特型,成簇率為60.0%(165/275)。有文獻(xiàn)報(bào)道[6]樣本的成簇率是評(píng)價(jià)基因分型技術(shù)功效的重要指標(biāo)。本研究所得數(shù)值略低于金標(biāo)法IS6110-RFLP(79%)的結(jié)果,而高于Spoligotyping分型的成簇率55%[7]。成簇的例數(shù)高達(dá)60%以上,提示結(jié)核病主要是由于近期感染所致[8],本研究顯示,邢臺(tái)地區(qū)結(jié)核病疫情近期感染較為嚴(yán)重。根據(jù)山東[9]、四川[10]報(bào)道成簇型菌株的耐藥率顯著高于獨(dú)特型菌株的耐藥率,而本研究發(fā)現(xiàn)邢臺(tái)地區(qū)成簇型和獨(dú)特型菌株在單耐藥水平和耐多藥水平上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示近期傳播致病在全敏感菌株和耐藥菌株的發(fā)生機(jī)制中的作用相當(dāng)。由于本文所收集的菌株數(shù)量不夠大,且時(shí)間相對(duì)集中,因此不能全面準(zhǔn)確反映邢臺(tái)地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因型分布狀況以及基因型的臨床意義,需要今后收集更多菌株進(jìn)行深入研究。

    近年來(lái),由于結(jié)核分枝桿菌耐藥株的廣泛傳播使得全球結(jié)核病再度肆虐,主要原因之一就是結(jié)核分枝桿菌的變異。因此從分子水平研究結(jié)核分枝桿菌的基因特征并進(jìn)行分型鑒定,明確主要流行菌型,對(duì)結(jié)核病的有效防治有重要意義。

    [1] 趙雁林,王黎霞,成詩(shī)明,等.結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:1-40.

    [2] 劉敬華,萬(wàn)康林,劉志廣,等.5個(gè)VNTR位點(diǎn)用于我國(guó)三省65株結(jié)核分枝桿菌菌株基因分型的研究[J].中國(guó)人獸共患病雜志,2004,20(8):653-657.

    [3] 曹曉慧,蔣毅,張媛媛.13個(gè)VNTR位點(diǎn)用于113株結(jié)核分枝桿菌的基因分型研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2006,27(8):705-708.

    [4] 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)防癆雜志,2012,34(8):485-508.

    [5] 劉泓,芮寶玲,陳陽(yáng)貴,等.烏魯木齊市耐藥肺結(jié)核患者危險(xiǎn)因素分析[J].職業(yè)與健康,2016,32(19):2658-2660.

    [6] Supply P,Magdalena J,Himpens S,et al.Identification of novel intergenic repetitive units in a mycobacterial two-component system operon[J].Mol Microbiol,1997,26(5):991-1003.

    [7] Tsolaki AG,Gagneux S,Pym AS,et al.Genomic deletions classify the Beijing/W strains as a distinct genetic lineage of Mycobacterium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2005,43(7):3185-3191.

    [8] Rad ME,Bifani P,Martin C,et al.Mutations in putative mutator genes of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing family[J].Emerg Infect Dis,2003,9(7):838-845.

    [9] 鄧云峰,張延安,鄭建禮,等.山東地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床菌株基因型特征研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2010,31(3):321-323.

    [10] 陳建,萬(wàn)康林,楊筠,等.結(jié)核分枝桿菌基因分型及其耐藥性分析[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,3(1):10-15.

    StudyonVNTRgenotypesanddrugresistancephenotypesof275mycobacteriumtuberculosisclinicalisolatesfromXingtaiarea

    ZHANG Zhi, LI Ya-nan, GAO Hui-xia, XUYi, DAI Er-hei

    the Fifth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang, Hebei 050021, China

    ObjectiveTo understand the characteristics of genotypes and drug resistance phenotypes of mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Xingtai and to explore the association of genotypes and drug resistance phenotypes.MethodsThe mycobacterium tuberculosis clinical strains isolated from TB patients in the Fifth Hospital of Xingtai and the corresponding clinical information of the patients were collected from January 2014 to October 2014. The 15-locus variable number tandem repeats (VNTR) was used to genotype the strains, and the first-line anti-TB drug susceptibility testing was performed using the proportion method. Clustering analysis was done by BioNumerics 5.0 software and statistical analysis was done by SPSS 16.0 software.ResultsThe total drug resistance rate of MTB in this district was 31.6%, the initial drug resistance rate was 24.2%, and the acquired drug resistance rate was 56.3%. The drug resistance level of re-treatment was significantly higher than that of new cases. The 275 MTB strains were divided into 145 VNTR genotypes, of which 165 strains were clustered into 35 groups and 110 strains were individual types. The HGDI value of VNTR was 0.9838. There was no significant difference in age, gender, occupation, geographical location, treatment history, smoking history or diabetes history, and no statistical difference was observed between the clustered genotypes and individual genotypes in mono-drug resistance rate and multi-drug resistance rate.ConclusionThe mycobacterium tuberculosis isolates from Xingtai exhibit high genetic diversity. No correlation is observed between VNTR genotypes and drug resistance phenotypes in this study.

    mycobacterium tuberculosis; genotype; variable number tandem repeats

    10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.037

    河北省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(No 20150155)

    050021 河北 石家莊,石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科

    戴二黑,E-mail:daieh2008@126.com

    2017-02-17]

    猜你喜歡
    結(jié)核分型結(jié)核病
    世界防治結(jié)核病日
    警惕卷土重來(lái)的結(jié)核病
    失眠可調(diào)養(yǎng),食補(bǔ)需分型
    便秘有多種 治療須分型
    一度浪漫的結(jié)核
    特別健康(2018年4期)2018-07-03 00:38:26
    層次分析模型在結(jié)核疾病預(yù)防控制系統(tǒng)中的應(yīng)用
    算好結(jié)核病防治經(jīng)濟(jì)賬
    基于分型線驅(qū)動(dòng)的分型面設(shè)計(jì)研究
    中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核感染的中醫(yī)辨治思路
    IL-17在結(jié)核病免疫應(yīng)答中的作用
    国产精品国产三级专区第一集| 午夜福利乱码中文字幕| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美日韩福利视频一区二区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲欧美色中文字幕在线| 两个人看的免费小视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 99国产精品免费福利视频| 男人添女人高潮全过程视频| 九九爱精品视频在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品嫩草影院av在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 大香蕉久久成人网| 大香蕉久久网| 如何舔出高潮| 欧美乱码精品一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 免费高清在线观看日韩| 日本91视频免费播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 男女之事视频高清在线观看 | 亚洲成人av在线免费| 精品人妻一区二区三区麻豆| 99久久综合免费| 91老司机精品| 亚洲熟女精品中文字幕| av在线老鸭窝| 9热在线视频观看99| 一级片'在线观看视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 久久久久久人妻| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精品,欧美精品| 天天添夜夜摸| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 一级黄片播放器| 亚洲一区中文字幕在线| svipshipincom国产片| 国产毛片在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲精品av麻豆狂野| 这个男人来自地球电影免费观看 | www.精华液| 国产麻豆69| 国产成人精品在线电影| 成年av动漫网址| 一二三四在线观看免费中文在| av在线播放精品| 久久鲁丝午夜福利片| 男人添女人高潮全过程视频| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美久久黑人一区二区| 男的添女的下面高潮视频| www.av在线官网国产| 少妇被粗大的猛进出69影院| 男女午夜视频在线观看| 欧美日韩精品网址| 老司机影院成人| 亚洲国产最新在线播放| 午夜免费鲁丝| 一级毛片电影观看| 国产成人91sexporn| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成人午夜精彩视频在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲成人一二三区av| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久 | 男女边吃奶边做爰视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 纯流量卡能插随身wifi吗| 中文字幕制服av| 99热全是精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲综合色网址| 欧美日韩一级在线毛片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 青青草视频在线视频观看| 亚洲国产欧美在线一区| 成人国产av品久久久| 久久av网站| 国产色婷婷99| 搡老岳熟女国产| 国产成人欧美| 最近2019中文字幕mv第一页| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 男男h啪啪无遮挡| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久久精品免费免费高清| 中文字幕亚洲精品专区| 一本大道久久a久久精品| 亚洲欧美一区二区三区久久| 高清不卡的av网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产精品无大码| 成人午夜精彩视频在线观看| 999久久久国产精品视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品熟女久久久久浪| 男女高潮啪啪啪动态图| 一级片免费观看大全| 90打野战视频偷拍视频| 精品亚洲成国产av| 亚洲专区中文字幕在线 | 捣出白浆h1v1| 成年动漫av网址| 波多野结衣av一区二区av| 久久久久久久大尺度免费视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲精品av麻豆狂野| 交换朋友夫妻互换小说| 国产日韩欧美亚洲二区| 嫩草影视91久久| 热re99久久国产66热| 成人三级做爰电影| 国产熟女午夜一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 岛国毛片在线播放| 亚洲四区av| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 一级片免费观看大全| 国产高清不卡午夜福利| 精品国产露脸久久av麻豆| 99国产综合亚洲精品| 久久久欧美国产精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 午夜91福利影院| www.精华液| 美女主播在线视频| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品一国产av| 老鸭窝网址在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久亚洲精品成人影院| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 美女高潮到喷水免费观看| 90打野战视频偷拍视频| 国产毛片在线视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 1024香蕉在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 一个人免费看片子| 新久久久久国产一级毛片| 男女午夜视频在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 蜜桃在线观看..| 久久av网站| 国产免费现黄频在线看| 最近中文字幕2019免费版| 国产伦人伦偷精品视频| 香蕉丝袜av| 精品福利永久在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久久精品性色| 欧美精品亚洲一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲欧美一区二区三区久久| 丝袜美足系列| av国产精品久久久久影院| 日本爱情动作片www.在线观看| 午夜激情久久久久久久| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲中文av在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 免费黄色在线免费观看| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久久久人妻| 久久婷婷青草| 人妻 亚洲 视频| 亚洲国产精品999| 亚洲第一青青草原| 午夜精品国产一区二区电影| 十八禁高潮呻吟视频| 少妇精品久久久久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久热爱精品视频在线9| 中文字幕精品免费在线观看视频| 精品国产国语对白av| 观看av在线不卡| 波野结衣二区三区在线| 亚洲久久久国产精品| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩 亚洲 欧美在线| 9热在线视频观看99| 国产乱来视频区| 亚洲五月色婷婷综合| 老汉色∧v一级毛片| 久久久久久人妻| 91成人精品电影| 亚洲图色成人| 国产av一区二区精品久久| a级片在线免费高清观看视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 九草在线视频观看| kizo精华| 1024香蕉在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产成人91sexporn| 成人黄色视频免费在线看| 欧美日韩视频精品一区| 久久久久精品久久久久真实原创| 精品人妻在线不人妻| 男女床上黄色一级片免费看| videosex国产| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av电影在线进入| 色网站视频免费| 国产又色又爽无遮挡免| 最新的欧美精品一区二区| 国产成人精品久久久久久| 男女之事视频高清在线观看 | 高清在线视频一区二区三区| 亚洲图色成人| 晚上一个人看的免费电影| 国产av国产精品国产| 高清不卡的av网站| 精品一区二区三区av网在线观看 | 五月开心婷婷网| 免费高清在线观看日韩| 男女边摸边吃奶| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久影院123| 欧美另类一区| av国产久精品久网站免费入址| 一级毛片电影观看| 欧美久久黑人一区二区| 99久久综合免费| 日本色播在线视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 中国三级夫妇交换| 久久 成人 亚洲| 久久人人爽人人片av| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产一级毛片在线| 在线观看一区二区三区激情| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| av在线老鸭窝| 国产在线视频一区二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲久久久国产精品| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品偷伦视频观看了| 中国三级夫妇交换| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产亚洲av高清不卡| 国产野战对白在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 美女大奶头黄色视频| 少妇的丰满在线观看| 9色porny在线观看| 永久免费av网站大全| 香蕉丝袜av| bbb黄色大片| 一级,二级,三级黄色视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产高清国产精品国产三级| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久精品国产综合久久久| 亚洲精品在线美女| 国产成人系列免费观看| 天天添夜夜摸| 男女之事视频高清在线观看 | 欧美人与性动交α欧美软件| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 我的亚洲天堂| 99久国产av精品国产电影| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲,欧美精品.| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 制服丝袜香蕉在线| 久久久久视频综合| 国产精品女同一区二区软件| 久久久久精品性色| 国产又爽黄色视频| 五月开心婷婷网| 亚洲天堂av无毛| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲免费av在线视频| www.精华液| 久久韩国三级中文字幕| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 五月天丁香电影| 亚洲成人一二三区av| av视频免费观看在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 久久久久久久久免费视频了| 久久 成人 亚洲| 国产成人a∨麻豆精品| 热re99久久精品国产66热6| 国产乱人偷精品视频| 秋霞伦理黄片| 亚洲精品视频女| 国产精品人妻久久久影院| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 超碰成人久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 丝瓜视频免费看黄片| 免费高清在线观看视频在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲av中文av极速乱| 少妇的丰满在线观看| 大片免费播放器 马上看| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 熟女av电影| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产熟女午夜一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产xxxxx性猛交| 成年动漫av网址| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲av男天堂| 国产av国产精品国产| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品欧美亚洲77777| 97精品久久久久久久久久精品| 乱人伦中国视频| 男人添女人高潮全过程视频| 人成视频在线观看免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 交换朋友夫妻互换小说| 多毛熟女@视频| 国产日韩欧美视频二区| 午夜福利一区二区在线看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产1区2区3区精品| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 久久毛片免费看一区二区三区| 最新的欧美精品一区二区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产成人欧美| 欧美日韩综合久久久久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 美女中出高潮动态图| 麻豆av在线久日| 国产精品免费大片| 亚洲精品在线美女| 精品酒店卫生间| 日韩精品有码人妻一区| 久久精品久久精品一区二区三区| 我的亚洲天堂| 日韩 亚洲 欧美在线| 我的亚洲天堂| 美女视频免费永久观看网站| 美女中出高潮动态图| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲在久久综合| 国产精品av久久久久免费| 日本午夜av视频| 日韩av免费高清视频| 久久久国产一区二区| 我要看黄色一级片免费的| 欧美精品av麻豆av| 久久99热这里只频精品6学生| 一二三四在线观看免费中文在| 丝袜喷水一区| 免费高清在线观看日韩| 免费观看a级毛片全部| 亚洲国产精品一区三区| 婷婷色综合www| 97在线人人人人妻| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲成色77777| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久综合国产亚洲精品| 免费日韩欧美在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美97在线视频| 女人久久www免费人成看片| 亚洲美女黄色视频免费看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 免费观看人在逋| 黄频高清免费视频| 亚洲美女视频黄频| 国产av国产精品国产| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 午夜福利,免费看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| √禁漫天堂资源中文www| www日本在线高清视频| 亚洲av综合色区一区| 亚洲少妇的诱惑av| 久久久精品免费免费高清| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 操出白浆在线播放| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 激情视频va一区二区三区| 久久婷婷青草| a级毛片在线看网站| 高清不卡的av网站| 欧美成人午夜精品| 国产色婷婷99| 老鸭窝网址在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 韩国高清视频一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 久久久久精品人妻al黑| 日韩大片免费观看网站| 热99国产精品久久久久久7| 搡老岳熟女国产| av.在线天堂| 亚洲欧美激情在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩一区二区三区影片| 久久久精品免费免费高清| 18在线观看网站| 中文字幕高清在线视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 视频区图区小说| 国产男人的电影天堂91| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲男人天堂网一区| 黄片无遮挡物在线观看| 精品一区在线观看国产| 九九爱精品视频在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 日本一区二区免费在线视频| 观看美女的网站| 美女国产高潮福利片在线看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美精品一区二区免费开放| 夫妻午夜视频| 国产乱来视频区| 欧美xxⅹ黑人| 大片电影免费在线观看免费| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产在线免费精品| 99热网站在线观看| 激情视频va一区二区三区| 人妻一区二区av| 婷婷色综合大香蕉| 丝袜脚勾引网站| 宅男免费午夜| 日韩伦理黄色片| 国产精品99久久99久久久不卡 | 天天添夜夜摸| 国产片内射在线| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品.久久久| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 99热全是精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产男女超爽视频在线观看| 精品一区在线观看国产| 一区二区三区激情视频| 五月开心婷婷网| 久久久精品94久久精品| 国产乱来视频区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 观看美女的网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产一区二区三区av在线| 久久人人爽人人片av| 国产免费现黄频在线看| 99热国产这里只有精品6| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久av网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 秋霞在线观看毛片| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品乱久久久久久| 美女视频免费永久观看网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 成年女人毛片免费观看观看9 | 91精品国产国语对白视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美xxⅹ黑人| 多毛熟女@视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 高清不卡的av网站| 国产精品久久久av美女十八| av网站免费在线观看视频| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美精品一区二区大全| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 日本wwww免费看| 免费日韩欧美在线观看| 国产精品国产av在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 下体分泌物呈黄色| 伦理电影大哥的女人| 色综合欧美亚洲国产小说| 韩国高清视频一区二区三区| www.av在线官网国产| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 国产成人91sexporn| 少妇人妻精品综合一区二区| 女人久久www免费人成看片| 精品一区二区免费观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 男女下面插进去视频免费观看| 一本久久精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲成人手机| 波野结衣二区三区在线| 99久久综合免费| 宅男免费午夜| svipshipincom国产片| 晚上一个人看的免费电影| 久久免费观看电影| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| av免费观看日本| 国产老妇伦熟女老妇高清| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品欧美亚洲77777| 国产又爽黄色视频| 美女主播在线视频| 久久久久网色| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲av男天堂| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲中文av在线| 操出白浆在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品福利永久在线观看| 久久97久久精品| 考比视频在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 韩国精品一区二区三区| 男的添女的下面高潮视频| 男男h啪啪无遮挡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品人妻久久久影院| 秋霞在线观看毛片| 亚洲成人国产一区在线观看 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美在线黄色| 亚洲美女黄色视频免费看| av电影中文网址| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 少妇人妻久久综合中文| 激情视频va一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 欧美精品av麻豆av| 美女中出高潮动态图| 桃花免费在线播放| 亚洲欧美一区二区三区国产| 免费观看人在逋| www日本在线高清视频| 国产成人精品福利久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 18禁国产床啪视频网站| 美女扒开内裤让男人捅视频| 蜜桃在线观看..| www.精华液| 宅男免费午夜| 午夜激情久久久久久久| videos熟女内射| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一本大道久久a久久精品| 国产欧美亚洲国产| 久久国产亚洲av麻豆专区| 十八禁高潮呻吟视频| 国产 一区精品| 久久精品国产a三级三级三级| av免费观看日本| 麻豆乱淫一区二区| 永久免费av网站大全|