穩(wěn)定過表達成纖維細胞激活蛋白的口腔鱗狀細胞癌細胞株的構(gòu)建

趙萌 邵婷如 黃佳欣 陳躍川 呂曉智

穩(wěn)定過表達成纖維細胞激活蛋白的口腔鱗狀細胞癌細胞株的構(gòu)建

趙萌 邵婷如 黃佳欣 陳躍川 呂曉智

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院口腔-頭頸外科，南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，廣州 510515

目的 構(gòu)建人成纖維細胞激活蛋白（FAP）過表達慢病毒載體，轉(zhuǎn)染口腔鱗狀細胞癌（OSCC）細胞株SCC9，構(gòu)建穩(wěn)定過表達FAP的OSCC細胞株。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)獲得FAP片段，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建過表達FAP的慢病毒載體，包埋病毒并收集上清液感染SCC9細胞株，通過流式細胞熒光分選技術(shù)（FACS）進行篩選，獲得穩(wěn)定過表達FAP的SCC9細胞株。結(jié)果 對陽性克隆進行酶切鑒定和基因測序證明FAP的慢病毒載體構(gòu)建成功，實時熒光定量PCR和Western blot檢測結(jié)果證明成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達FAP的SCC9細胞株。結(jié)論 本研究有助于獲得純化FAP蛋白，為進一步研究FAP在OSCC發(fā)生發(fā)展過程中的機制奠定基礎(chǔ)。

成纖維細胞激活蛋白； 慢病毒載體； 過表達； 口腔鱗狀細胞癌

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，約占頜面部惡性腫瘤的90%[1]，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，危及患者生命。然而，以手術(shù)、放療和化療為主的傳統(tǒng)療法治療OSCC的效果尚不能令人滿意，需要尋找新的治療方法和手段[2]。人類成纖維細胞激活蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）是一種絲氨酸蛋白酶，為細胞表面Ⅱ型跨膜糖蛋白。作為腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer associated fibroblast，CAF）的表面標記蛋白之一，F(xiàn)AP已證實與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。

本課題組前期實驗證實，F(xiàn)AP不僅在OSCC組織中高表達，在OSCC細胞中的表達水平也明顯增高，且FAP表達水平與OSCC患者的預(yù)后負相關(guān)，F(xiàn)AP能促進OSCC細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4-5]。然而，F(xiàn)AP促進OSCC發(fā)生發(fā)展過程中的確切機制尚不清楚。本實驗構(gòu)建了野生型pCDH-FAP，并進一步包埋病毒，感染OSCC細胞，獲得穩(wěn)定過表達FAP的SCC9細胞株，為進一步研究FAP在OSCC中的作用及其機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞株、質(zhì)粒、菌種及主要試劑

從南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院口腔-頭頸外科獲取新鮮OSCC組織樣本；293T細胞、舌鱗狀細胞癌細胞株SCC9、慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和病毒輔助載體psPAX2、pMD2.G由南方醫(yī)科大學細胞生物教研室提供。

RNA保存液和混合蛋白酶抑制劑（北京康為世紀生物科技有限公司）；感受態(tài)大腸桿菌DH5α（廣州慧研生物科技有限公司）；Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司，日本）；Pfu酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、聚合酶鏈反應(yīng)（ploymerase chain reaction，PCR）回收試劑、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Thermo Scientific公司，美國）；質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Hilymax（日本同仁公司）；實時熒光定量PCR劑盒（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）；His抗體（CST公司，美國）；FAP抗體（Santa公司，美國）；RIPA（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 引物

FAP序列引物根據(jù)基因庫NM_001291807.1（Homo sapiens fibroblast activation protein，alpha，transcript variant 2，mRNA，complete cds）信息，利用Primer Premier 6.0和Gene Codes軟件設(shè)計，在上下游分別加入NheⅠ和BamHⅠ酶切位點，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。FAP上游引物為：GCTAGCGCCACCATGAAGACTTGGGTAAAAATCGTA，帶His-6標簽的下游引物為：CGCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTCTGACAAAGAGAAACACTGC。

1.3 擴增目的編碼區(qū)

Trizol法提取OSCC組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用高保真Pfu酶構(gòu)成的PCR體系50 μL擴增目的編碼區(qū)。PCR程序為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。反應(yīng)后取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得野生型FAP序列。

1.4 重組載體pCDH-FAP的構(gòu)建與鑒定

利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒得到純化FAP序列，將純化產(chǎn)物以及病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP進行NheⅠ和BamHⅠ雙酶切后回收。按照載體和目的基因摩爾比1∶8的比例經(jīng)T4連接酶16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)大腸桿菌，涂板后37 ℃孵箱過夜后挑取單克隆菌落，抽提質(zhì)粒后進行雙酶切驗證，將含有插入基因的陽性克隆送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

1.5 慢病毒的包裝與病毒上清液收集

選擇生長狀態(tài)良好的293T細胞，收集并計數(shù)后按照每孔5×105個細胞接種于6孔板，37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后，細胞匯合度達70%～80%可進行轉(zhuǎn)染。采用Hilymax試劑為介導的瞬時轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染工具細胞293T，轉(zhuǎn)染比例：DNA載體總量（μg）和Hilymax體積（μL）比例為1∶3，以35 mm 6孔細胞培養(yǎng)板為例，總的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量需小于4 μg，其中重組病毒載體pCDH-FAP為1 μg，輔助載體psPAX2和pMD2.G分別為2 μg和0.5 μg[6]。轉(zhuǎn)染后8 h換液，以含有1%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每天換液收集病毒上清，4 ℃，2 500 g離心10 min，再通過0.45 μm濾器過濾掉細胞碎片，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 病毒上清液感染SCC9細胞及穩(wěn)定細胞株的篩選

選擇生長狀態(tài)良好的SCC9細胞，收集并計數(shù)后按照每孔5×105個細胞接種于6孔板，24 h后取病毒上清液與F12培養(yǎng)基（10%FBS）（比例為1∶1），加2 mL培養(yǎng)基到6孔板。37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，次日去除1 mL培養(yǎng)基之后添加1 mL病毒上清，連續(xù)培養(yǎng)，備用。

擴大培養(yǎng)細胞到107個，然后通過流式細胞熒光分選技術(shù)（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）進行篩選。用胰酶將細胞消化，制備細胞懸液，PBS清洗2遍之后，輕柔吹打細胞至單細胞懸液。流式細胞儀篩選得到綠色熒光陽性的細胞，F(xiàn)12培養(yǎng)基（10%FBS，3%雙抗），逐漸降低雙抗?jié)舛?，擴大培養(yǎng)。

1.7 實時熒光定量PCR檢測FAP在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中的表達

Trizol法提取細胞總RNA，按照試劑盒說明行mRNA逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)genestar試劑盒說明配制實時熒光定量PCR體系，將混合好的反應(yīng)液加入96孔板中，封膜、離心并上機，然后進行實時熒光定量PCR檢測。

1.8 Western blot檢測FAP在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中的表達情況

采用RIPA裂解法（1∶100加入混合蛋白酶抑制劑）提取空白對照組和FAP過表達組的細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白進行Western blot檢測。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析，組間比較采用student-t檢驗，P＜0.05為組間比較具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 FAP基因片段克隆以及pCDH-FAP的構(gòu)建和雙酶切驗證

通過提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄和PCR獲得的FAP片段，瓊脂糖凝膠電泳可見明亮的條帶，目的基因長度與預(yù)期長度一致（圖1）。對固體LB培養(yǎng)皿上的單克隆進行質(zhì)粒提取和雙酶切驗證，瓊脂糖凝膠電泳得到預(yù)期條帶（圖2）。將陽性重組克隆菌落挑于液體LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行測序分析，對比得到完全一致結(jié)果。陽性菌擴增并保存。

2.2 慢病毒的包裝與病毒感染并篩選穩(wěn)定過表達FAP的SCC9細胞株

2.2.1 慢病毒包裝 利用Hilymax包裝病毒的方法轉(zhuǎn)染工具細胞293T，獲得過表達FAP的293T細胞（圖3）。

2.2.2 病毒上清液感染SCC9細胞 收集上清液感染SCC9細胞，擴大培養(yǎng)，獲得綠色熒光陽性SCC9細胞（圖4）。

2.2.3 FACS篩選綠色熒光陽性細胞 通過流式細胞儀的分選獲得綠色熒光陽性標記的SCC9細胞，接種于24孔板中，F(xiàn)12（10%FBS，3%雙抗）繼續(xù)擴大培養(yǎng)（圖5）。

圖1 PCR擴增FAP片段Fig 1 The FAP fragment was amplified by PCR

圖2 FAP過表達重組病毒載體的鑒定Fig 2 Confirmation of the pCDH-FAP clones by enzyme

圖3 包裝重組病毒載體到工具細胞Fig 3 Packaging the recombinant viral vector into the tool cells

圖4 病毒上清感染SCC9細胞的熒光表達Fig 4 Fluorescent expression was detected after infected SCC9 cell line with virus supernatant

圖5 FACS后細胞的熒光表達Fig 5 Fluorescent expression was detected after FACS

2.3 實時熒光定量PCR和Western blot檢測FAP在穩(wěn)定細胞株中的表達

實時熒光定量PCR和Western blot檢測SCC9細胞株中FAP的表達情況見圖6、7。實時熒光定量PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，穩(wěn)定過表達FAP的SCC9細胞系中FAP的表達量明顯增高，二組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖6 實時熒光定量PCR檢測SCC9細胞株中FAP的表達水平Fig 6 The expression of FAP in SCC9 cell line detected by realtime PCR

圖7 Western blot檢測SCC9細胞株中FAP的表達水平Fig 7 The expression of FAP in SCC9 cell line detected by Western blot

3 討論

FAP是廣泛存在于CAF表面的標記蛋白，屬絲氨酸蛋白酶家族。FAP在超過90%的乳腺癌、結(jié)腸癌、肺腺瘤的腫瘤基質(zhì)中高表達[7]，并且FAP的高表達與多種腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。Lee等[8]證實，過表達FAP的成纖維細胞能產(chǎn)生一種基質(zhì)，能增強胰腺癌細胞的侵襲能力，而腫瘤間質(zhì)高表達FAP的結(jié)腸癌患者更容易出現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的可能性[9]，且FAP高表達與非小細胞肺癌患者預(yù)后負相關(guān)[10]。前期研究[5]證實FAP在OSCC過表達，并與OSCC患者的預(yù)后負相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP不僅高表達于上皮腫瘤反應(yīng)性成纖維細胞中，在胰腺癌細胞[8]、乳腺癌細胞[11]、胃癌細胞[12]、宮頸癌細胞[13]、卵巢癌細胞[14]以及OSCC[5]等上皮來源的惡性腫瘤細胞中同樣高表達。研究[5]證實，抑制FAP表達可通過磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸激酶信號通路抑制OSCC的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。這些研究提示FAP可能是OSCC預(yù)后判斷的重要指標以及OSCC治療的靶點。進一步研究FAP在OSCC發(fā)生發(fā)展過程的作用機制，將為OSCC的發(fā)病機制提供新的思路，為靶向FAP治療OSCC提供理論依據(jù)。

既往關(guān)于FAP的研究較難模擬FAP在真核細胞中的真正代謝；同樣瞬時轉(zhuǎn)染過表達FAP，在細胞中作用時間過短，無法更好地研究FAP的互作蛋白。因此，本實驗選擇病毒表達載體pCDH-CMVMCS-EF1-copGFP，利用病毒更易整合到基因組上的特質(zhì)，進行FAP過表達的SCC9穩(wěn)定株的構(gòu)建。其中，SCC9細胞株為舌鱗狀細胞癌細胞株，是適合轉(zhuǎn)染的OSCC宿主細胞；而pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP是以CMV為啟動子的慢病毒表達載體，可在真核細胞中進行高拷貝和過表達，并且copGFP作為改造過的綠色熒光蛋白，亮度是增強綠色熒光蛋白亮度的1.3倍以上，有利于更好觀察其熒光。同時，在重組質(zhì)粒中設(shè)計了His-6標簽，有利于下一步進行免疫共沉淀等實驗，以探尋FAP互作蛋白。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了野生型pCDHFAP，并獲得穩(wěn)定過表達FAP的SCC9細胞株，有助于獲得純化FAP蛋白，為進一步研究FAP在OSCC發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制奠定基礎(chǔ)。

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（本文編輯 杜冰）

Construction of a eukaryotic expression vector of fibroblast activation protein and establishment of its stable over- expression in the oral squamous cell carcino

Zhao Meng, Shao Tingru, Huang Jiaxin, Chen Yuechuan, Lü Xiaozhi.
(Dept. of Head and Neck Oncology, Nanfang Hospital, Southern Medical University; College of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)
Supported by: National Natural Science Foundation of China (81472536); Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (2014A020212440). Correspondence: Lü Xiaozhi, E-mail: lxzsurgeon@126.com.

Objective This study aimed at constructing fibroblast activation protein (FAP) over-expression lentivinus vectors to investigate transfection in SCC9 cell lines and establish a stable FAP over-expression oral squamous cell line.Methods The cDNA of FAP gene from an oral squamous cell carcinoma (OSCC) tissue was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and subcloned into eukaryotic expression vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP. The recombinant plasmid was sequenced and then transfected into an SCC9 cell line. Subsequently, the SCC9 cell line that over-expressed FAP stably was established by fluorescence activated cell sorting (FACS). The expression of green fluorescent protein (GFP) was detected with fluorescence microscopy, and the over-expression of FAP was identified by real-time PCR and Western blot. Results The FAP gene was amplified by PCR and then cloned into the vector, whose sequence was identical to that in the GenBank.GFP was expressed in the transfected cells. Furthermore, FAP over-expression in the transfected cells was detected by realtime PCR and Western blot. Conclusion The recombinant eukaryotic expression vector pCDH-FAP was constructed successfully. This result provides a foundation for further studies on the function of FAP in vitro.

fibroblast activation protein; lentivinus vectors; over-expression; oral squamous cell carcinoma

Q 78

A

10.7518/hxkq.2017.05.004

2017-04-23；

2017-07-12

國家自然科學基金（81472536）；廣東省科技計劃項目（2014A020212440）

趙萌，碩士，E-mail：zhuanzhuanquanen@sina.com

呂曉智，主任醫(yī)師，博士，E-mail：lxzsurgeon@126.com