• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高通量測序研究霉變黑毛茶的真菌多樣性

    2017-10-19 06:11:00胥偉姜依何吳丹趙仁亮朱旗
    茶葉科學 2017年5期
    關鍵詞:毛茶分類學高通量

    胥偉,姜依何,吳丹,趙仁亮,朱旗

    1. 湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室,湖南 長沙 410128;2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心,湖南 長沙 410128

    高通量測序研究霉變黑毛茶的真菌多樣性

    胥偉,姜依何,吳丹,趙仁亮,朱旗*

    1. 湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室,湖南 長沙 410128;2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心,湖南 長沙 410128

    為了解高濕條件下霉變黑毛茶的微生物情況,通過人工促霉培養(yǎng)和Illumina Miseq高通量測序技術研究了黑毛茶霉變過程的真菌多樣性,并探討了不同OTU(Operational Taxonomic Unit)閾值劃分對真菌多樣性生物信息學分析的影響。結果表明,高濕條件下霉變黑毛茶的真菌分類學地位集中于 2門(Ascomycot, Basidiomycota)6屬(Aspergillus, Galactomyces, Ogataea, Debaryomyces, Pichia和Cryptococcus),其中曲霉屬(Aspergillus)真菌相對豐度值最大,達 98%以上。不同 OTU閾值劃分水平導致了同一樣本的分類學地位、多樣性指數(shù)及群落結構組成的分析結果存在差異。相似性0.97水平下的OTU聚類真菌群落Shannon多樣性指數(shù)為 0.15~0.43,0.99水平下 Shannon多樣性指數(shù)為 0.28~0.58。曲霉屬(Aspergillus)真菌為高濕條件下導致倉儲黑毛茶霉變的優(yōu)勢真菌種群。

    黑毛茶;霉變;真菌多樣性

    茶樹鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、渥堆、干燥等 工序制得黑毛茶[1],渥堆是其品質形成的關鍵工序[2],渥堆過程中,受濕熱和微生物[3-8]的共同作用,茶葉內(nèi)含物質發(fā)生一系列轉化,形成黑毛茶獨有的品質特征。由黑毛茶精制而成的黑茶產(chǎn)品因其良好的減肥降脂及促消化功效[9-11]而深受消費者青睞,其年產(chǎn)量不斷增加而成為我國第二大茶類[12]。由于黑毛茶采摘較粗老,加工成的黑毛茶需在存放1~2年才進行精制,通過精制和拼配加工成各種黑茶成品。同時,銷售后的成品黑茶,民間也有通過存放以改善其粗澀口感的習俗。但在黑毛茶倉儲或成品黑茶存放過程中,由于環(huán)境條件的變化,特別是在南方的梅雨季節(jié),茶葉表面極易滋生霉菌,輕者有風霉味,重者失去飲用價值,甚至產(chǎn)生飲用安全問題。生產(chǎn)實踐中,在高濕條件下,黑毛茶極易因其多孔徑特點而吸濕回潮,導致微生物迅速繁殖而引起霉變[13-14]。為了解黑茶霉變的發(fā)生規(guī)律,在黑毛茶等溫吸濕模型建立的基礎上[15],人工設定溫、濕度環(huán)境促進霉菌在黑毛茶上的生長,通過對高濕條件下霉變黑毛茶真菌多樣性的研究,為倉儲中的黑毛茶安全評估提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    湖南內(nèi)銷黑毛茶(2016年 5月產(chǎn)于湖南省桃源縣,水分含量:(10.05±0.20)%;DNA抽提試劑盒(OMEGA-soil DNA Kit, Omega Bio-Tek, USA);2% agarose gels(biowest agArose, biowest, Espana);FastPfu Polymerase(FastPfu Polymerase, TransGen, China);AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Axygen, USA);Illumina MiSeq platform(TruSeq? DNA Sample Prep Kit, Illumina, USA)。

    1.2 儀器與設備

    GZ-150-HSII恒溫恒濕箱,韶關市廣智科技設備有限公司;KL300 LED體式顯微鏡,LEICA; Eppendorf N13462C 移 液 器 , Eppendorf;ABSON MiFly-6小型離心機,合肥艾本森科學儀器有限公司;Eppendorf 5430 R小型離心機,Eppendorf;Eppendorf 5424R高 速 臺 式 冷 凍 離 心 機 , Eppendorf;NanoDrop2000超微量分光光度計,Thermo Fisher Scientific;DYY-6C電泳儀,北京市六一儀器廠;ABI GeneAmp? 9700型PCR儀,ABI;Illumina Miseq測序儀,Illumina;Illumina hiseq測序儀,Illumina;BioTek ELx800酶標儀 , Biotek; TBS380 微 型 熒 光 計 ,TurnerBioSystems; Covaris M220, Gene Company Limited;QL-901旋渦混合器,海門其林貝爾儀器制造有限公司;TL-48R粉碎研磨儀,上海萬柏生物科技有限公司。

    1.3 促霉處理及保存

    稱取黑毛茶盛于培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿開口,每份培養(yǎng)皿15 g茶樣),分5層,每層15份放置于恒溫恒濕箱,溫度 25℃,相對濕度 RH 90%。人工培養(yǎng)經(jīng)體式顯微鏡鏡檢觀察到有霉菌菌絲存在時開始取樣,隔48 h取1次樣品,共獲得培養(yǎng)至第 3、5、7、9、11、13、15 d的樣品,分層取樣并迅速置于無菌袋中混合均勻密封保存(樣品編號分別為:1、2、3、4、5、6、7),-20℃凍存。

    1.4 基因組DNA提取

    參考葛英亮[16]的方法采用 E.Z.N.A. Soil DNA基因組提取試劑盒進行基因組 DNA的提取,-20℃凍存。電泳檢測參數(shù):瓊脂糖凝膠1%,電場強度:5 V·cm-1,時間30 min。

    1.5 18 S rDNA PCR擴增

    參考Wei Zhang[17]的方法進行18 S r DNA PCR擴增,參數(shù)調(diào)整如下。

    反 應 體 系 : 引 物 : SSU0817F: 5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3', 1196R: 5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3';5×FastPfu Buffer,4 μL;2.5 mmol·L-1dNTPs,2 μL;Forward Primer (5 mmol·L-1),0.8 μL; Reverse Primer (5 μmol·L-1),0.8 μL;FastPfu Polymerase,0.4 μL;BSA,0.2 μL;Template DNA,10 ng;ddH2O補至20 μL。反應參數(shù):95℃變性3 min;以95℃ 30 s,55℃,30 s,72℃,45 s擴增35個循環(huán);72~10℃,10 min。

    1.6 Miseq高通量測序

    Illumina MiSeq高通量基因測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

    1.7 測序數(shù)據(jù)優(yōu)化與統(tǒng)計

    Illumina高通量測序平臺測序得到的序列數(shù)據(jù),首先根據(jù)PE reads之間的overlap關系,將成對的reads拼接(merge)成1條序列,同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾,根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列,并校正序列方向。數(shù)據(jù)去雜方法和參數(shù):過濾read尾部質量值20以下的堿基,設置50 bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質量值低于 20,從窗口開始截去后端堿基,過濾質控后50 bp以下的read;根據(jù)PE reads之間的overlap關系,將成對reads拼接(merge)成 1條序列,最小 overlap長度為10 bp;拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為 0.2,篩選不符合序列;根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品,并調(diào)整序列方向,barcode允許的錯配數(shù)為 0,最大引物錯配數(shù)為2。軟件平臺:Trimmomatic、FLASH。該工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

    1.8 物種注釋

    采用RDP classifier貝葉斯算法[18]分別對97%和99%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析[19],并在各個分類學水平統(tǒng)計每個樣品的群落組成。軟件平臺:Qiime[20]。生物信息學分析工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

    1.9 多樣性指數(shù)計算

    霉變黑毛茶真菌多樣性指標:采用 Chao指數(shù)和 Ace指數(shù)計算菌群豐富度;采用Shannon指數(shù)和 Simpson指數(shù)計算菌群多樣性;采用 Coverage指數(shù)計算測序深度。軟件平臺:mothur version v.1.30.1[21]。

    2 結果與分析

    2.1 人工促霉培養(yǎng)黑毛茶茶樣鏡檢結果

    采用恒溫恒濕培養(yǎng)的方法模擬高濕條件下的黑毛茶倉儲進行促霉培養(yǎng),每隔24 h進行1次體式顯微觀察,培養(yǎng)至72 h時,黑毛茶表面在體式顯微鏡下可觀察到霉菌菌絲,表明高濕條件下霉菌菌絲開始在黑毛茶表面生長。體式顯微鏡可觀察到霉菌菌絲在茶葉表面交織生長,隨著培養(yǎng)時間的延長,霉菌菌絲開始特異化形成孢囊梗并產(chǎn)生產(chǎn)孢結構(圖1)。

    2.2 不同樣品優(yōu)化序列及OTU統(tǒng)計信息

    采用Illumina Miseq高通量測序技術檢測了黑毛茶霉變過程的真菌種群,通過對真菌18 S區(qū)進行測序,設置不同相似度水平值(0.97,0.99)進行歸類操作。去除嵌合體和沒有重復的單序列,0.97相似水平下7個樣品共獲得257 471條tags,被歸類于7個OTUs(圖2)。樣品tags數(shù)隨霉變時間的變化見圖3,平均 tags數(shù)為 36 782±3 858。0.99相似水平下 7個樣品共獲得 234 122條 tags,被歸類于25個OTUs(圖2),樣品tags數(shù)隨霉變時間的變化見圖 3,平均 tags數(shù)為 33 446 ±3 844。優(yōu)化后測序數(shù)據(jù)序列堿基長度401~420 bp的序列達262 107條,約占總序列的99.91%。

    2.3 霉變黑毛茶的OTU及分類學地位統(tǒng)計

    將通過Illumina Miseq高通量測序所得的序列優(yōu)化后比對至OTU代表序列,生成OTU表格,優(yōu)選 OTU 序列檢索數(shù)據(jù)庫https://unite.ut.ee/index.php進行分類學地位統(tǒng)計,分類學地位對比情況見表1。

    圖1 高濕條件下不同培養(yǎng)時間的黑毛茶體式顯微鏡檢圖Fig. 1 The Stereomicroscope examination of raw dark tea under high humidity during different culture times

    圖2 不同相似水平下不同霉變時間的OTUs值Fig. 2 The OTUs of different mildew time under different similarity levels

    圖3 不同霉變時間樣品的Tags值Fig. 3 The tags of different mildew times

    基于不同相似水平(0.97, 0.99)進行歸類操作形成的OTU單元存在較大差別,相似水平提高后獲得的總OTU值減少,但OTU種類數(shù)增加至3倍左右,有利于真菌種群的分析及多樣性計算。Illumina Miseq高通量測序技術基于 18 S rDNA測序數(shù)據(jù)檢索數(shù)據(jù)庫得出分類學地位及多樣性指數(shù),目前普遍認為該方法在 0.97的相似水平下得出的屬水平分類學地位較可靠[16,22-24]。從霉變過程取得的7個黑毛茶樣品真菌種群變化不大,基于 0.97相似水平得出的屬水平分類學地位有:曲霉屬(Aspergillus)、地霉屬(Galactomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、隱球菌屬(Cryptococcus)、德巴利酵母屬(Debaryomyces);基于0.99相似水平得出的屬水平分類學地位有:曲霉屬(Aspergillus)、甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)、畢赤酵母屬(Pichia)、地霉屬(Galactomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)。對比可發(fā)現(xiàn)提高相似水平值后新增加了甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)真菌。原因在于此屬物種序列與 0.97水平下注釋出的真菌種群中某個屬的序列水平相似度很高,不能被區(qū)分。黑毛茶的霉變過程真菌種群變化不大,并表現(xiàn)出越往后期種群數(shù)量越單一的規(guī)律,這可能與本研究設置的霉變條件有較大關系,該霉變條件下某類真菌較優(yōu)的適應了該環(huán)境而得到生長繁殖,在與其他物種競爭過程中取得了優(yōu)勢。

    表1 霉變黑毛茶的真菌多樣性分類學地位統(tǒng)計Table 1 Taxonomic status of the fungi diversity in mildew dark tea

    2.4 霉變黑毛茶的Alpha多樣性指數(shù)

    通過Alpha多樣性指數(shù)可以反映各樣品之間微生物群落的豐度和多樣性指數(shù)的差異。Alpha 多樣性指數(shù)的計算要求測序深度能夠覆蓋整個微生物群落。物種觀測稀釋性曲線[25]表明,觀測到OTU數(shù)量隨著隨機抽取的測序數(shù)量的增加而逐漸呈現(xiàn)水平趨勢(圖4),表明測序數(shù)據(jù)量合理,其數(shù)據(jù)可以反映樣本真實多樣性情況?;诓煌嗨扑剑?.97, 0.99)形成的歸類操作單元進行多樣性指數(shù)計算統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2。

    圖4 不同相似水平下觀測指數(shù)稀釋性曲線Fig. 4 The morphology microscopic observations of raw dark tea under different similarity levels

    表2 霉變黑毛茶真菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha community diversity index of gungus in mildew dark tea

    Alpha多樣性分析檢驗用來估計樣品微生物群落的物種豐富度和多樣性,包括 Ace、Chao、Coverage、Shannon、Simpson等統(tǒng)計學分析指數(shù)。Coverage值均高達0.999以上,表明本次測序對樣品中真菌的覆蓋率很高,證明選擇測序深度適合,可以滿足樣品中真菌多樣性分析的需要;Ace指數(shù)和Chao指數(shù)反應出霉變過程真菌群落豐富度較低,Shannon指數(shù)和 Simpson指數(shù)則表明黑毛茶霉變過程真菌多樣性程度較低;同時提高相似水平值后的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均有所提高,Shannon指數(shù)有所提高,Simpson指數(shù)有所降低。相似水平提高后進行歸類操作形成的 OTU統(tǒng)計分析得出的Alpha值與理論值相吻合。多樣性指數(shù)的統(tǒng)計結果與分類學地位的統(tǒng)計數(shù)據(jù)相匹配,表明黑毛茶在高濕條件下的霉變過程中真菌種群豐度和多樣性指數(shù)都有所降低,可為黑茶的霉變防范、預測及安全評價提供相關依據(jù)。

    2.5 霉變黑毛茶的真菌群落組成分析

    基于不同相似水平(0.97,0.99)形成的歸類操作單元進行群落組成分析、真菌群落相關性分析及樣本間相關性分析,具體統(tǒng)計見群落組成圖(圖5)、群落Heatmap圖(圖6),真菌群落組成分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表3(可注釋分類學地位)及表4(未注釋出分類學地位)。

    圖5 基于屬水平霉變黑毛茶不同相似水平真菌群落結構Fig. 5 Genus-level community structure of fungus in mildew raw dark tea based on different similar levels

    圖6 基于屬水平霉變黑毛茶不同相似水平真菌群落Heatmap圖Fig. 6 Genus-level community heatmap of fungus in mildew raw dark tea based on different similar levels

    不同相似度水平下的注釋結果均表明霉變過程的黑毛茶樣品真菌種群主要為曲霉屬(Aspergillus)真菌,占比達98%以上,其次為德巴利酵母屬(Debaryomyces)真菌(表3)。0.99相似度水平的物種注釋結果較 0.97水平下豐富(表3),新增甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)(表3)真菌注釋結果及未能清晰注釋的 Ascomycota unclassified、Eurotiales unclassified和Trichocomaceae unclassified(表4)等3個屬的真菌。從研究材料考慮,黑毛茶霉變過程以占絕對優(yōu)勢的曲霉屬(Aspergillus)真菌所表征,清晰闡述該屬真菌的具體種類及生物學特性是黑茶倉儲及安全評價亟待解決的問題。從研究方法考慮,基于0.97的相似度水平對于真菌18 S條帶的物種注釋存在一定的局限性,18 S r DNA為高度保守序列,在進化過程中變異程度低,較難區(qū)分注釋親緣關系較近的真菌種群分類學地位。

    表3 霉變黑毛茶的真菌群落組成(可注釋)Table 3 The fungal community composition in mildew dark tea (can be noted)

    表4 霉變黑毛茶的真菌群落組成(未能注釋)Table 4 The fungal community composition in mildew dark tea (can not be noted)

    黑毛茶霉變過程真菌多樣性及豐度變化見Heatmap圖(圖6),橫軸樣品為不同霉變時間的黑毛茶樣品,縱軸顯示各屬真菌種類,不同顏色表示各屬真菌在樣品中的豐度,圖上方進化樹表明樣品間的相似程度:0.99相似度水平下的進化樹聚類分析結果更能還原實際樣本情況,1號樣品為一類,2、3、4、5、6、7號樣品為一類,表明相似度水平越高,樣本間聚類分析結果更科學。該進化樹聚類分析表明黑毛茶霉變初期(1~3 d)真菌種群變化迅速,第5天開始種群多樣性變化速度減緩,多樣性呈逐漸下降趨勢,至第15天時最低,這與Alpha多樣性指數(shù)結果相一致。該結果表明隨著霉變時間的延長,適宜室溫高濕條件下的曲霉屬(Aspergillus)真菌得到生長繁殖,其他類真菌種群生長受到相對抑制。圖左側進化樹將曲霉屬(Aspergillus)真菌聚為一類,并與其他類真菌有較遠的遺傳距離,在霉變進程中屬于絕對優(yōu)勢真菌種群。在所檢樣品中,許多豐度極低的酵母屬真菌種群亦被檢出,表明高通量測序技術能檢測出樣本中含量極微的真菌種群信息,對分析種群多樣性有著傳統(tǒng)分析方法無法比擬的優(yōu)越性。

    3 討論

    黑茶微生物學的研究多基于微生物與其品質形成機理的相互關系開展微生物的種群鑒定及功能注釋等方面的研究[3-7],但鮮見黑茶生霉劣變過程中的真菌種群多樣性分析及物種注釋。采用高通量測序技術直接從樣本中提取微生物基因組總DNA,并對18 S條帶進行特異性擴增,解決了不可培養(yǎng)及低豐度真菌在傳統(tǒng)方法中無法檢出的局限。如形態(tài)學鑒定法對貯藏期的黑茶樣本進行研究僅發(fā)現(xiàn)黑曲霉(Aspergillus niger)、灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)、 產(chǎn) 黃 青 霉 ( Penicillium chrysogenum)、根霉屬(Rhizopus spp.)、木霉屬(Trichoderma spp.)、酵母(分類學地位未知)等真菌種群[26-28]。本方法基于Miseq平臺測序技術,研究了高濕條件下黑茶霉變的主要真菌種群結構和多樣性特性,不僅了解了黑毛茶霉變過程中主要真菌種群為曲霉屬(Aspergillus),而且解析出其豐度值高達98%以上,同時低豐度的甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)、畢赤酵母屬(Pichia)、地霉屬(Galactomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)等真菌亦有檢出,這與Abe M等[3]和Xu A等[5]采用DGGE技術鑒定貯藏期茯磚茶和普洱茶的結果較一致,但更加全面地揭示出低豐度地霉屬(Galactomyces)、甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)、隱球菌屬(Cryptococcus)等真菌種群,表明該研究方法具有傳統(tǒng)鑒定法無法比擬的優(yōu)勢,這與陳慶金等[29]的觀點一致。

    基于0.97的相似度水平下多樣性 Shannon指數(shù)為 0.15~0.43,Simpson 指數(shù) 0.7449~0.9492;基于 0.99的相似度水平下多樣性Shannon指數(shù)為0.28~0.58,Simpson指數(shù)0.7007~0.9032,該結果表明曲霉屬(Aspergillus)真菌是黑毛茶霉變過程中霉菌的優(yōu)勢菌群。陳建玲等[30]曾報道了普洱茶在高濕條件下的真菌毒素含量,從食品安全的角度而言,我們需要防范高濕條件下曲霉屬真菌可能產(chǎn)生的真菌毒素給消費者帶來的安全隱患。高濕條件下,曲霉屬真菌代謝繁殖,使之成為黑毛茶霉變過程的絕對優(yōu)勢真菌種群,并隨著霉變程度的增加使之在真菌菌群多樣性結構中的豐度進一步加大。而黑毛茶霉變過程中霉菌的具體種名及豐度動態(tài)變化需要進一步研究。

    需要留意的是,從我們已進行的感官審評和傳統(tǒng)形態(tài)分類學方面的鑒定工作來看,人工促霉的黑茶樣本和存放環(huán)境不當所導致的黑毛茶自然霉變樣本真菌種群存在差異,考慮霉變真菌種群受到樣本所處環(huán)境中的微生物菌群、環(huán)境基質及外界條件等共同影響,該部分內(nèi)容將在以后的工作中進行系統(tǒng)研究。

    基于高通量測序結果的物種注釋在 OTU閾值劃分時需要留意,不同的OTU閾值劃分對物種的分類學結果及多樣性指數(shù)會帶來一定的影響,特別是對豐度低的物種和樣本間聚類分析進行研究時建議提高相似度水平,有利于同源性高的物種和豐度低的物種注釋出分類學結果,也有利于樣本間相似度分析時的結果更科學。

    [1]齊桂年, 田鴻, 劉愛玲, 等. 四川黑茶品質化學成分的研究[J]. 茶葉科學, 2004, 24(4): 266-269.

    [2]安徽農(nóng)學院. 制茶學[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999: 227-230.

    [3]Abe M, Takaoka N, Idemoto Y, et al. Characteristic fungi observed in the fermentation process for Puer tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 124(2): 199-203.

    [4]Lyu C, Chen C, Ge F, et al. A preliminary metagenomic study of puer tea during pile fermentation [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(13): 3165-3174.

    [5]Xu A, Wang Y, Wen J, et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fuzhuan brick-tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 146(1): 14-22.

    [6]Zhao M, Xiao W, Ma Y, et al. Structure and dynamics of the bacterial communities in fermentation of the traditional Chinese post-fermented pu-erh tea revealed by 16S rRNA gene clone library [J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2013, 29(10): 1877-1884.

    [7]Zhao M, Zhang DL, Su XQ, et al. An integrated metagenomics/metaproteomics investigation of the microbial communities and enzymes in solid-state fermentation of Pu-erh tea [J]. Scientific Reports, 2015(5): 1-10.

    [8]陳棟, 李晶晶, 方祥, 等. 廣東陳香茶后發(fā)酵過程中主要微生物種群和酶類活性變化的研究[J]. 茶葉科學, 2010, 30(6): 429-434.

    [9]吳香蘭, 劉仲華, 曹丹, 等. 茯磚茶對小鼠腸道免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究[J]. 茶葉科學, 2013, 33(2): 125-130.

    [10]任洪濤, 周斌, 秦太峰, 等. 普洱茶揮發(fā)性成分抗氧化活性研究[J]. 茶葉科學, 2014, 34(3): 213-220.

    [11]滕翠琴, 劉仲華, 龔受基, 等. 六堡茶對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞糖脂代謝的影響[J]. 茶葉科學, 2014, 34(3): 230-238.

    [12]梅宇, 王智超, 林璇. 2015年中國茶葉產(chǎn)銷形勢分析[J]. 茶世界, 2015(4): 21-30.

    [13]HAAS D, PFEIFER B, Reiterich C, et al. Identification and quantification of fungi and mycotoxins from Pu-erh tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2013, 166(2): 316-322.

    [14]MO HZ, ZHANG H, WU QH, et al. Inhibitory effects of tea extract on aflatoxin production by Aspergillus flavus [J]. Letters in Applied Microbiology, 2013, 56(6): 462-466.

    [15]胥偉, 趙仁亮, 姜依何, 等. 湖南黑毛茶等溫吸濕模型建立及霉變安全性研究[J/OL]. 食品科學. http://www.cnki.net/ kcms/detail/11. 2206. TS.20170303. 1431.086.html.

    [16]葛英亮, 于水利, 時文歆, 等. 應用Illumina MiSeq高通量測序技術解析O3-BAC飲用水處理過程細菌多樣性變化[J].食品科學, 2016, 37(16): 223-228.

    [17]Wei Zhang, Ruijuan Yang, Wenjun Fang, et al. Characterization of thermophilic fungal community associated with pile fermentation of Pu-erh tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2016, 227: 29-33.

    [18]WANG Q, GARRITY G M, TIEDJE J M, et al. Naive bayesian classifier for rapid assignment of rrna sequences into the new bacterial taxonomy [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(16): 5261-5267.

    [19]Urmas K? ljalg, R Henrik Nilsson, Kessy Abarenkov, et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi [J]. Molecular Ecology, 2013, 22: 5271-5277.

    [20]Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data [J]. Nature Methods, 2010, 7(5): 335-336.

    [21]Schloss PD, Gevers D, Westcott SL. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies [J]. PLoS ONE, 2011, 6(12): e27310.

    [22]謝萍, 徐明生, 尹仲平, 等. Miseq測序研究散裝醬鹵鴨肉貯藏期間微生物群落多樣性[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(11): 120-126, 106.

    [23]徐帥, 林奕岑, 周夢佳, 等. 基于高通量測定肉雞回腸微生物多樣性及PICRUSt基因預測分析[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2016, 28(8): 2581-2588.

    [24]曹碧璇, 胡濱, 劉愛平. 利用16S rRNA基因克隆文庫分析東北自然發(fā)酵酸菜中細菌多樣性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(11): 76-80.

    [25]Katherine R Amato, Carl J Yeoman, Angela Kent, et al. Habitat degradation impacts black howler monkey (Alouatta pigra) gastrointestinal microbiomes [J]. The ISME Journal, 2013, 7(7): 1344-1353.

    [26]彭喜春, 于淼. 一款 10年陳熟普洱茶中可培養(yǎng)微生物的分離鑒定[J]. 食品科學, 2011, 32(15): 196-199.

    [27]方祥, 陳棟, 李晶晶, 等. 普洱茶不同貯藏時期微生物種群的鑒定[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(2): 105-108, 160.

    [28]鐘濤, 齊桂年, 胥偉, 等. 藏茶貯存過程中真菌種群的鑒定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(10): 101-103, 106.

    [29]陳慶金, 黃麗, 滕建文, 等. 基于 Miseq測序分析六堡茶陳化初期真菌多樣性[J]. 食品科技, 2015, 40(8): 67-71.

    [30]陳建玲, 李文學, 楊光宇, 等. 廣州某茶葉市場普洱茶中多種生物毒素污染現(xiàn)狀調(diào)查[J]. 癌變畸變突變, 2011, 23(1): 68-71.

    RNA Sequencing Analysis of Fungi Community Diversity in Mildew Raw Dark Tea

    XU Wei, JIANG Yihe, WU Dan, ZHAO Renliang, ZHU Qi*

    1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

    In order to understand the feature of microbe in the mildew dark tea under high humidity conditions, Illumina Miseq high-throughput sequencing was performed to study fungi diversity by artificial culture of certain fungi. The influence of the OTU (Operational Taxonomic Unit) threshold on the bioinformatic analysis results of fungal diversity was also discussed. The results showed that the mildew dark tea fungus under high humidity conditions were mainly classified into 2 phylum (Ascomycota, Basidiomycota) and 6 genera (Aspergillus, Galactomyces, Ogataea, Debaryomyces, Pichia and Cryptococcus), with the highest abundance value of Aspergillus (>98%). The different OTU thresholds resulted in the difference in the taxonomic status, diversity index and community structure in the same sample. The Shannon diversity index of OTU under the 0.97 was 0.15-0.43, and the Shannon diversity index under 0.99 was 0.28-0.58. Under high moisture conditions aspergillus was the major fungi causing dark tea mildew in storage.

    raw dark tea, mildew, fungi community diversity

    TS272.5+4;Q949.32

    A

    1000-369X(2017)05-483-10

    2017-02-28

    2017-05-04

    國家自然科學基金(31571802)、湖南省教育廳重點項目(14A066)、湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2016B283)

    胥偉,男,博士研究生,主要從事茶葉加工及功能成分化學研究。*通訊作者:1965994459@qq.com

    猜你喜歡
    毛茶分類學高通量
    劉嘉怡作品
    ——增城毛茶制作技藝插畫
    大觀(2023年8期)2023-09-25 06:21:14
    高通量衛(wèi)星網(wǎng)絡及網(wǎng)絡漫游關鍵技術
    國際太空(2023年1期)2023-02-27 09:03:42
    仁化紅山鎮(zhèn)白毛茶亮相央視《新聞直播間》
    源流(2022年5期)2022-06-30 01:31:44
    疫情背景下“布盧姆教育目標分類學”的應用
    高通量血液透析臨床研究進展
    Ka頻段高通量衛(wèi)星在鐵路通信中的應用探討
    湖南不同等級黑毛茶品質分析
    茶葉通訊(2018年3期)2018-11-08 07:01:56
    中國通信衛(wèi)星開啟高通量時代
    國家自然科學基金青年基金項目 后現(xiàn)代中國植物志的修訂——中國山礬科的分類學修訂
    直接民意、間接民意及司法應對——分類學視角下對司法與民意關系的再審視
    精品国产一区二区久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲av中文av极速乱| 91精品三级在线观看| 日日啪夜夜爽| 欧美xxxx性猛交bbbb| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 黄片无遮挡物在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 捣出白浆h1v1| 久热这里只有精品99| 国产淫语在线视频| 亚洲伊人色综图| 婷婷色av中文字幕| 狂野欧美激情性bbbbbb| 女性被躁到高潮视频| 午夜福利视频精品| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩av免费高清视频| 亚洲av.av天堂| 日本av免费视频播放| 国产福利在线免费观看视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久av网站| 精品人妻在线不人妻| 免费黄频网站在线观看国产| 老熟女久久久| 国产69精品久久久久777片| 9热在线视频观看99| av国产久精品久网站免费入址| 91久久精品国产一区二区三区| 国产成人91sexporn| 亚洲av成人精品一二三区| 男女边摸边吃奶| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产一区二区激情短视频 | 一级,二级,三级黄色视频| 99视频精品全部免费 在线| 捣出白浆h1v1| 成年人免费黄色播放视频| 少妇高潮的动态图| 九草在线视频观看| 午夜视频国产福利| 天天影视国产精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产日韩欧美视频二区| 九色亚洲精品在线播放| 9热在线视频观看99| 少妇 在线观看| 亚洲四区av| 午夜福利影视在线免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| 国产av国产精品国产| 激情五月婷婷亚洲| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 免费高清在线观看视频在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲av电影在线进入| 国产成人精品福利久久| 国产精品欧美亚洲77777| 超色免费av| av网站免费在线观看视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日本黄色日本黄色录像| 久久久欧美国产精品| 成年女人在线观看亚洲视频| av在线app专区| 国产精品久久久av美女十八| 久热久热在线精品观看| 久久久久精品性色| 美国免费a级毛片| 精品国产国语对白av| 国精品久久久久久国模美| 天美传媒精品一区二区| av又黄又爽大尺度在线免费看| www.色视频.com| www.熟女人妻精品国产 | 晚上一个人看的免费电影| 水蜜桃什么品种好| 我要看黄色一级片免费的| 性色avwww在线观看| 在线观看免费高清a一片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 美女国产视频在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 男人操女人黄网站| 两性夫妻黄色片 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产成人精品在线电影| 亚洲,欧美精品.| 免费在线观看完整版高清| 人妻一区二区av| a级片在线免费高清观看视频| 久久久欧美国产精品| 午夜福利,免费看| 五月开心婷婷网| 亚洲人成77777在线视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 满18在线观看网站| 日本免费在线观看一区| 色网站视频免费| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产成人精品久久久久久| 男女下面插进去视频免费观看 | av卡一久久| 国产精品久久久久久av不卡| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 最近中文字幕2019免费版| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一级片免费观看大全| 久久精品国产自在天天线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 一区二区三区乱码不卡18| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 少妇 在线观看| 欧美3d第一页| 老熟女久久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久久久久久精品精品| 好男人视频免费观看在线| 热99国产精品久久久久久7| 久久精品夜色国产| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲图色成人| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲国产日韩一区二区| av.在线天堂| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日本与韩国留学比较| 亚洲av成人精品一二三区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产高清国产精品国产三级| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲精品日本国产第一区| 最近的中文字幕免费完整| 999精品在线视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 美女中出高潮动态图| 精品一品国产午夜福利视频| 黄色一级大片看看| 国产探花极品一区二区| 国产一区二区激情短视频 | 我要看黄色一级片免费的| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲国产av新网站| 桃花免费在线播放| 777米奇影视久久| 精品久久国产蜜桃| 免费观看性生交大片5| 大片免费播放器 马上看| 亚洲综合精品二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 老熟女久久久| 高清视频免费观看一区二区| av.在线天堂| 免费在线观看黄色视频的| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲国产最新在线播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 久热这里只有精品99| 国产精品.久久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日韩精品有码人妻一区| 欧美精品av麻豆av| 欧美成人午夜精品| 精品视频人人做人人爽| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 免费人成在线观看视频色| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 中文字幕免费在线视频6| 久久婷婷青草| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲成国产人片在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久国产一区二区| 久久99热这里只频精品6学生| 水蜜桃什么品种好| 久久人人97超碰香蕉20202| 赤兔流量卡办理| 中文字幕人妻丝袜制服| 成人国产麻豆网| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜91福利影院| 晚上一个人看的免费电影| 赤兔流量卡办理| 插逼视频在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 在线 av 中文字幕| 中文字幕亚洲精品专区| 免费看不卡的av| 日本免费在线观看一区| 草草在线视频免费看| av天堂久久9| 日本欧美国产在线视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日韩欧美一区视频在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产麻豆69| 嫩草影院入口| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品国产av在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日韩制服骚丝袜av| 一区二区三区四区激情视频| 成人二区视频| 国产又色又爽无遮挡免| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品国产三级专区第一集| 桃花免费在线播放| 亚洲成人手机| 婷婷色av中文字幕| 熟女av电影| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品人妻久久久影院| 国产成人免费无遮挡视频| 国产亚洲一区二区精品| 午夜影院在线不卡| 欧美日本中文国产一区发布| 国产免费福利视频在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产乱来视频区| 久热这里只有精品99| 国产成人精品在线电影| 一区二区三区精品91| 国产精品三级大全| 曰老女人黄片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 黄片无遮挡物在线观看| 多毛熟女@视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| videos熟女内射| 老司机影院毛片| 精品国产乱码久久久久久小说| 天美传媒精品一区二区| 最近的中文字幕免费完整| 日本欧美视频一区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲成人一二三区av| 日韩成人伦理影院| 免费人妻精品一区二区三区视频| 多毛熟女@视频| 下体分泌物呈黄色| 久热这里只有精品99| 亚洲精品视频女| 国产精品欧美亚洲77777| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲国产精品专区欧美| 黄色怎么调成土黄色| 51国产日韩欧美| 夜夜爽夜夜爽视频| 日本黄大片高清| 日韩大片免费观看网站| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久国产欧美日韩av| 男女免费视频国产| 久久久久视频综合| 亚洲四区av| 青春草视频在线免费观看| 久久99一区二区三区| 久久久国产一区二区| 国产精品一区www在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 男女国产视频网站| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品一二三| 波多野结衣一区麻豆| 热re99久久国产66热| 乱码一卡2卡4卡精品| 90打野战视频偷拍视频| 一区二区av电影网| videossex国产| 十八禁高潮呻吟视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品一区www在线观看| 精品视频人人做人人爽| 亚洲中文av在线| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲内射少妇av| 老司机影院成人| 国产色爽女视频免费观看| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品偷伦视频观看了| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av天堂久久9| 欧美成人精品欧美一级黄| 岛国毛片在线播放| 久久精品国产自在天天线| 亚洲成人手机| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品久久久久久久电影| av片东京热男人的天堂| 婷婷色综合www| 亚洲三级黄色毛片| 一级,二级,三级黄色视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 婷婷色av中文字幕| 色94色欧美一区二区| 我的女老师完整版在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 日日啪夜夜爽| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩三级伦理在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| kizo精华| 成人黄色视频免费在线看| 男男h啪啪无遮挡| 99久久人妻综合| 精品熟女少妇av免费看| 久久人人爽人人爽人人片va| 黄色视频在线播放观看不卡| kizo精华| 日本午夜av视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 大陆偷拍与自拍| 国产亚洲欧美精品永久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲美女视频黄频| 最后的刺客免费高清国语| 国产色婷婷99| 婷婷色麻豆天堂久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久精品国产a三级三级三级| 久久97久久精品| √禁漫天堂资源中文www| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 亚洲国产av影院在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 久久婷婷青草| 男人操女人黄网站| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 精品国产一区二区久久| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品一国产av| 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品一区蜜桃| 边亲边吃奶的免费视频| 久久ye,这里只有精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 18禁国产床啪视频网站| av播播在线观看一区| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产成人精品在线电影| 亚洲精品视频女| av网站免费在线观看视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久久久久久久久成人| 亚洲国产毛片av蜜桃av| a级毛色黄片| 一二三四在线观看免费中文在 | 久久久久国产网址| 美女主播在线视频| 亚洲四区av| videos熟女内射| 一级,二级,三级黄色视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 涩涩av久久男人的天堂| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜福利视频在线观看免费| 国产黄色免费在线视频| 久久97久久精品| 国产高清三级在线| 男女边摸边吃奶| 国产1区2区3区精品| 十八禁高潮呻吟视频| 满18在线观看网站| 亚洲国产日韩一区二区| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品一区www在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲成人av在线免费| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久久久久久国产电影| 国产高清不卡午夜福利| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日本免费在线观看一区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品第一国产精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 美女福利国产在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品国产三级专区第一集| 热re99久久国产66热| 久久久精品免费免费高清| 欧美日韩精品成人综合77777| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 26uuu在线亚洲综合色| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美激情 高清一区二区三区| 26uuu在线亚洲综合色| 黄色视频在线播放观看不卡| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲内射少妇av| 久久久久久人人人人人| 精品熟女少妇av免费看| 国产综合精华液| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 老司机影院成人| 在线精品无人区一区二区三| 五月玫瑰六月丁香| 久久精品夜色国产| 岛国毛片在线播放| 国产男女内射视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩伦理黄色片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品酒店卫生间| 丰满乱子伦码专区| 丁香六月天网| 一区在线观看完整版| 九色亚洲精品在线播放| 插逼视频在线观看| 国产成人av激情在线播放| 久久久a久久爽久久v久久| 99香蕉大伊视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 涩涩av久久男人的天堂| 大香蕉久久成人网| 我要看黄色一级片免费的| 99国产精品免费福利视频| 一级片'在线观看视频| 18禁观看日本| 免费高清在线观看视频在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 日本黄色日本黄色录像| www.熟女人妻精品国产 | 亚洲av男天堂| 美女视频免费永久观看网站| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 人妻一区二区av| 多毛熟女@视频| 国产高清三级在线| 99热国产这里只有精品6| 久久人人爽人人片av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 男女国产视频网站| 91成人精品电影| 一区二区av电影网| 久久久精品区二区三区| 寂寞人妻少妇视频99o| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩成人伦理影院| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 三上悠亚av全集在线观看| 国产极品天堂在线| 久久久久精品性色| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 秋霞伦理黄片| 久久久久视频综合| 丁香六月天网| 最黄视频免费看| 欧美成人午夜精品| 精品熟女少妇av免费看| 91在线精品国自产拍蜜月| av视频免费观看在线观看| 精品久久蜜臀av无| 日韩一区二区三区影片| av网站免费在线观看视频| av电影中文网址| av有码第一页| 视频中文字幕在线观看| 久久这里有精品视频免费| 一级毛片 在线播放| 午夜精品国产一区二区电影| 91国产中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 永久网站在线| 男男h啪啪无遮挡| 日韩在线高清观看一区二区三区| 观看av在线不卡| 国产 精品1| 成人毛片60女人毛片免费| 热re99久久国产66热| 91精品三级在线观看| 在线观看国产h片| 精品视频人人做人人爽| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲国产精品国产精品| 看非洲黑人一级黄片| 丝袜在线中文字幕| 国产黄频视频在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 午夜老司机福利剧场| 国产一区二区激情短视频 | 免费高清在线观看日韩| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产深夜福利视频在线观看| 观看av在线不卡| 欧美亚洲日本最大视频资源| 大香蕉久久成人网| 日韩一区二区三区影片| 国产精品国产三级专区第一集| 99热6这里只有精品| 男的添女的下面高潮视频| 日韩免费高清中文字幕av| 大陆偷拍与自拍| 午夜老司机福利剧场| 九九在线视频观看精品| 久久韩国三级中文字幕| 岛国毛片在线播放| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产在线免费精品| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品.久久久| 久久 成人 亚洲| 欧美最新免费一区二区三区| 好男人视频免费观看在线| videosex国产| 99九九在线精品视频| 99国产综合亚洲精品| 人妻人人澡人人爽人人| 国产有黄有色有爽视频| 日韩免费高清中文字幕av| 精品国产露脸久久av麻豆| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲高清免费不卡视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久影院123| av视频免费观看在线观看| 一级a做视频免费观看| 赤兔流量卡办理| 在线观看国产h片| 深夜精品福利| 国产综合精华液| 精品少妇黑人巨大在线播放| 天堂8中文在线网| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲中文av在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品久久久精品久久久| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲欧美清纯卡通| 全区人妻精品视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看 | 欧美精品国产亚洲| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品欧美亚洲77777| 免费看不卡的av| 综合色丁香网| 另类亚洲欧美激情| 日韩精品有码人妻一区| av线在线观看网站| 久久久久视频综合| 日韩视频在线欧美| √禁漫天堂资源中文www| 久热这里只有精品99| 色吧在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品久久久久久电影网| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美日韩成人在线一区二区| 熟女人妻精品中文字幕| freevideosex欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲av成人精品一二三区| 新久久久久国产一级毛片| 一边亲一边摸免费视频| 国产精品不卡视频一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 岛国毛片在线播放| 午夜老司机福利剧场| 高清黄色对白视频在线免费看| 免费黄色在线免费观看| 国产精品无大码| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 999精品在线视频|