• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高通量測序研究霉變黑毛茶的真菌多樣性

    2017-10-19 06:11:00胥偉姜依何吳丹趙仁亮朱旗
    茶葉科學 2017年5期
    關鍵詞:毛茶分類學高通量

    胥偉,姜依何,吳丹,趙仁亮,朱旗

    1. 湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室,湖南 長沙 410128;2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心,湖南 長沙 410128

    高通量測序研究霉變黑毛茶的真菌多樣性

    胥偉,姜依何,吳丹,趙仁亮,朱旗*

    1. 湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室,湖南 長沙 410128;2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心,湖南 長沙 410128

    為了解高濕條件下霉變黑毛茶的微生物情況,通過人工促霉培養(yǎng)和Illumina Miseq高通量測序技術研究了黑毛茶霉變過程的真菌多樣性,并探討了不同OTU(Operational Taxonomic Unit)閾值劃分對真菌多樣性生物信息學分析的影響。結果表明,高濕條件下霉變黑毛茶的真菌分類學地位集中于 2門(Ascomycot, Basidiomycota)6屬(Aspergillus, Galactomyces, Ogataea, Debaryomyces, Pichia和Cryptococcus),其中曲霉屬(Aspergillus)真菌相對豐度值最大,達 98%以上。不同 OTU閾值劃分水平導致了同一樣本的分類學地位、多樣性指數(shù)及群落結構組成的分析結果存在差異。相似性0.97水平下的OTU聚類真菌群落Shannon多樣性指數(shù)為 0.15~0.43,0.99水平下 Shannon多樣性指數(shù)為 0.28~0.58。曲霉屬(Aspergillus)真菌為高濕條件下導致倉儲黑毛茶霉變的優(yōu)勢真菌種群。

    黑毛茶;霉變;真菌多樣性

    茶樹鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、渥堆、干燥等 工序制得黑毛茶[1],渥堆是其品質形成的關鍵工序[2],渥堆過程中,受濕熱和微生物[3-8]的共同作用,茶葉內(nèi)含物質發(fā)生一系列轉化,形成黑毛茶獨有的品質特征。由黑毛茶精制而成的黑茶產(chǎn)品因其良好的減肥降脂及促消化功效[9-11]而深受消費者青睞,其年產(chǎn)量不斷增加而成為我國第二大茶類[12]。由于黑毛茶采摘較粗老,加工成的黑毛茶需在存放1~2年才進行精制,通過精制和拼配加工成各種黑茶成品。同時,銷售后的成品黑茶,民間也有通過存放以改善其粗澀口感的習俗。但在黑毛茶倉儲或成品黑茶存放過程中,由于環(huán)境條件的變化,特別是在南方的梅雨季節(jié),茶葉表面極易滋生霉菌,輕者有風霉味,重者失去飲用價值,甚至產(chǎn)生飲用安全問題。生產(chǎn)實踐中,在高濕條件下,黑毛茶極易因其多孔徑特點而吸濕回潮,導致微生物迅速繁殖而引起霉變[13-14]。為了解黑茶霉變的發(fā)生規(guī)律,在黑毛茶等溫吸濕模型建立的基礎上[15],人工設定溫、濕度環(huán)境促進霉菌在黑毛茶上的生長,通過對高濕條件下霉變黑毛茶真菌多樣性的研究,為倉儲中的黑毛茶安全評估提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    湖南內(nèi)銷黑毛茶(2016年 5月產(chǎn)于湖南省桃源縣,水分含量:(10.05±0.20)%;DNA抽提試劑盒(OMEGA-soil DNA Kit, Omega Bio-Tek, USA);2% agarose gels(biowest agArose, biowest, Espana);FastPfu Polymerase(FastPfu Polymerase, TransGen, China);AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Axygen, USA);Illumina MiSeq platform(TruSeq? DNA Sample Prep Kit, Illumina, USA)。

    1.2 儀器與設備

    GZ-150-HSII恒溫恒濕箱,韶關市廣智科技設備有限公司;KL300 LED體式顯微鏡,LEICA; Eppendorf N13462C 移 液 器 , Eppendorf;ABSON MiFly-6小型離心機,合肥艾本森科學儀器有限公司;Eppendorf 5430 R小型離心機,Eppendorf;Eppendorf 5424R高 速 臺 式 冷 凍 離 心 機 , Eppendorf;NanoDrop2000超微量分光光度計,Thermo Fisher Scientific;DYY-6C電泳儀,北京市六一儀器廠;ABI GeneAmp? 9700型PCR儀,ABI;Illumina Miseq測序儀,Illumina;Illumina hiseq測序儀,Illumina;BioTek ELx800酶標儀 , Biotek; TBS380 微 型 熒 光 計 ,TurnerBioSystems; Covaris M220, Gene Company Limited;QL-901旋渦混合器,海門其林貝爾儀器制造有限公司;TL-48R粉碎研磨儀,上海萬柏生物科技有限公司。

    1.3 促霉處理及保存

    稱取黑毛茶盛于培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿開口,每份培養(yǎng)皿15 g茶樣),分5層,每層15份放置于恒溫恒濕箱,溫度 25℃,相對濕度 RH 90%。人工培養(yǎng)經(jīng)體式顯微鏡鏡檢觀察到有霉菌菌絲存在時開始取樣,隔48 h取1次樣品,共獲得培養(yǎng)至第 3、5、7、9、11、13、15 d的樣品,分層取樣并迅速置于無菌袋中混合均勻密封保存(樣品編號分別為:1、2、3、4、5、6、7),-20℃凍存。

    1.4 基因組DNA提取

    參考葛英亮[16]的方法采用 E.Z.N.A. Soil DNA基因組提取試劑盒進行基因組 DNA的提取,-20℃凍存。電泳檢測參數(shù):瓊脂糖凝膠1%,電場強度:5 V·cm-1,時間30 min。

    1.5 18 S rDNA PCR擴增

    參考Wei Zhang[17]的方法進行18 S r DNA PCR擴增,參數(shù)調(diào)整如下。

    反 應 體 系 : 引 物 : SSU0817F: 5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3', 1196R: 5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3';5×FastPfu Buffer,4 μL;2.5 mmol·L-1dNTPs,2 μL;Forward Primer (5 mmol·L-1),0.8 μL; Reverse Primer (5 μmol·L-1),0.8 μL;FastPfu Polymerase,0.4 μL;BSA,0.2 μL;Template DNA,10 ng;ddH2O補至20 μL。反應參數(shù):95℃變性3 min;以95℃ 30 s,55℃,30 s,72℃,45 s擴增35個循環(huán);72~10℃,10 min。

    1.6 Miseq高通量測序

    Illumina MiSeq高通量基因測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

    1.7 測序數(shù)據(jù)優(yōu)化與統(tǒng)計

    Illumina高通量測序平臺測序得到的序列數(shù)據(jù),首先根據(jù)PE reads之間的overlap關系,將成對的reads拼接(merge)成1條序列,同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾,根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列,并校正序列方向。數(shù)據(jù)去雜方法和參數(shù):過濾read尾部質量值20以下的堿基,設置50 bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質量值低于 20,從窗口開始截去后端堿基,過濾質控后50 bp以下的read;根據(jù)PE reads之間的overlap關系,將成對reads拼接(merge)成 1條序列,最小 overlap長度為10 bp;拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為 0.2,篩選不符合序列;根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品,并調(diào)整序列方向,barcode允許的錯配數(shù)為 0,最大引物錯配數(shù)為2。軟件平臺:Trimmomatic、FLASH。該工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

    1.8 物種注釋

    采用RDP classifier貝葉斯算法[18]分別對97%和99%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析[19],并在各個分類學水平統(tǒng)計每個樣品的群落組成。軟件平臺:Qiime[20]。生物信息學分析工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

    1.9 多樣性指數(shù)計算

    霉變黑毛茶真菌多樣性指標:采用 Chao指數(shù)和 Ace指數(shù)計算菌群豐富度;采用Shannon指數(shù)和 Simpson指數(shù)計算菌群多樣性;采用 Coverage指數(shù)計算測序深度。軟件平臺:mothur version v.1.30.1[21]。

    2 結果與分析

    2.1 人工促霉培養(yǎng)黑毛茶茶樣鏡檢結果

    采用恒溫恒濕培養(yǎng)的方法模擬高濕條件下的黑毛茶倉儲進行促霉培養(yǎng),每隔24 h進行1次體式顯微觀察,培養(yǎng)至72 h時,黑毛茶表面在體式顯微鏡下可觀察到霉菌菌絲,表明高濕條件下霉菌菌絲開始在黑毛茶表面生長。體式顯微鏡可觀察到霉菌菌絲在茶葉表面交織生長,隨著培養(yǎng)時間的延長,霉菌菌絲開始特異化形成孢囊梗并產(chǎn)生產(chǎn)孢結構(圖1)。

    2.2 不同樣品優(yōu)化序列及OTU統(tǒng)計信息

    采用Illumina Miseq高通量測序技術檢測了黑毛茶霉變過程的真菌種群,通過對真菌18 S區(qū)進行測序,設置不同相似度水平值(0.97,0.99)進行歸類操作。去除嵌合體和沒有重復的單序列,0.97相似水平下7個樣品共獲得257 471條tags,被歸類于7個OTUs(圖2)。樣品tags數(shù)隨霉變時間的變化見圖3,平均 tags數(shù)為 36 782±3 858。0.99相似水平下 7個樣品共獲得 234 122條 tags,被歸類于25個OTUs(圖2),樣品tags數(shù)隨霉變時間的變化見圖 3,平均 tags數(shù)為 33 446 ±3 844。優(yōu)化后測序數(shù)據(jù)序列堿基長度401~420 bp的序列達262 107條,約占總序列的99.91%。

    2.3 霉變黑毛茶的OTU及分類學地位統(tǒng)計

    將通過Illumina Miseq高通量測序所得的序列優(yōu)化后比對至OTU代表序列,生成OTU表格,優(yōu)選 OTU 序列檢索數(shù)據(jù)庫https://unite.ut.ee/index.php進行分類學地位統(tǒng)計,分類學地位對比情況見表1。

    圖1 高濕條件下不同培養(yǎng)時間的黑毛茶體式顯微鏡檢圖Fig. 1 The Stereomicroscope examination of raw dark tea under high humidity during different culture times

    圖2 不同相似水平下不同霉變時間的OTUs值Fig. 2 The OTUs of different mildew time under different similarity levels

    圖3 不同霉變時間樣品的Tags值Fig. 3 The tags of different mildew times

    基于不同相似水平(0.97, 0.99)進行歸類操作形成的OTU單元存在較大差別,相似水平提高后獲得的總OTU值減少,但OTU種類數(shù)增加至3倍左右,有利于真菌種群的分析及多樣性計算。Illumina Miseq高通量測序技術基于 18 S rDNA測序數(shù)據(jù)檢索數(shù)據(jù)庫得出分類學地位及多樣性指數(shù),目前普遍認為該方法在 0.97的相似水平下得出的屬水平分類學地位較可靠[16,22-24]。從霉變過程取得的7個黑毛茶樣品真菌種群變化不大,基于 0.97相似水平得出的屬水平分類學地位有:曲霉屬(Aspergillus)、地霉屬(Galactomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、隱球菌屬(Cryptococcus)、德巴利酵母屬(Debaryomyces);基于0.99相似水平得出的屬水平分類學地位有:曲霉屬(Aspergillus)、甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)、畢赤酵母屬(Pichia)、地霉屬(Galactomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)。對比可發(fā)現(xiàn)提高相似水平值后新增加了甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)真菌。原因在于此屬物種序列與 0.97水平下注釋出的真菌種群中某個屬的序列水平相似度很高,不能被區(qū)分。黑毛茶的霉變過程真菌種群變化不大,并表現(xiàn)出越往后期種群數(shù)量越單一的規(guī)律,這可能與本研究設置的霉變條件有較大關系,該霉變條件下某類真菌較優(yōu)的適應了該環(huán)境而得到生長繁殖,在與其他物種競爭過程中取得了優(yōu)勢。

    表1 霉變黑毛茶的真菌多樣性分類學地位統(tǒng)計Table 1 Taxonomic status of the fungi diversity in mildew dark tea

    2.4 霉變黑毛茶的Alpha多樣性指數(shù)

    通過Alpha多樣性指數(shù)可以反映各樣品之間微生物群落的豐度和多樣性指數(shù)的差異。Alpha 多樣性指數(shù)的計算要求測序深度能夠覆蓋整個微生物群落。物種觀測稀釋性曲線[25]表明,觀測到OTU數(shù)量隨著隨機抽取的測序數(shù)量的增加而逐漸呈現(xiàn)水平趨勢(圖4),表明測序數(shù)據(jù)量合理,其數(shù)據(jù)可以反映樣本真實多樣性情況?;诓煌嗨扑剑?.97, 0.99)形成的歸類操作單元進行多樣性指數(shù)計算統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2。

    圖4 不同相似水平下觀測指數(shù)稀釋性曲線Fig. 4 The morphology microscopic observations of raw dark tea under different similarity levels

    表2 霉變黑毛茶真菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha community diversity index of gungus in mildew dark tea

    Alpha多樣性分析檢驗用來估計樣品微生物群落的物種豐富度和多樣性,包括 Ace、Chao、Coverage、Shannon、Simpson等統(tǒng)計學分析指數(shù)。Coverage值均高達0.999以上,表明本次測序對樣品中真菌的覆蓋率很高,證明選擇測序深度適合,可以滿足樣品中真菌多樣性分析的需要;Ace指數(shù)和Chao指數(shù)反應出霉變過程真菌群落豐富度較低,Shannon指數(shù)和 Simpson指數(shù)則表明黑毛茶霉變過程真菌多樣性程度較低;同時提高相似水平值后的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均有所提高,Shannon指數(shù)有所提高,Simpson指數(shù)有所降低。相似水平提高后進行歸類操作形成的 OTU統(tǒng)計分析得出的Alpha值與理論值相吻合。多樣性指數(shù)的統(tǒng)計結果與分類學地位的統(tǒng)計數(shù)據(jù)相匹配,表明黑毛茶在高濕條件下的霉變過程中真菌種群豐度和多樣性指數(shù)都有所降低,可為黑茶的霉變防范、預測及安全評價提供相關依據(jù)。

    2.5 霉變黑毛茶的真菌群落組成分析

    基于不同相似水平(0.97,0.99)形成的歸類操作單元進行群落組成分析、真菌群落相關性分析及樣本間相關性分析,具體統(tǒng)計見群落組成圖(圖5)、群落Heatmap圖(圖6),真菌群落組成分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表3(可注釋分類學地位)及表4(未注釋出分類學地位)。

    圖5 基于屬水平霉變黑毛茶不同相似水平真菌群落結構Fig. 5 Genus-level community structure of fungus in mildew raw dark tea based on different similar levels

    圖6 基于屬水平霉變黑毛茶不同相似水平真菌群落Heatmap圖Fig. 6 Genus-level community heatmap of fungus in mildew raw dark tea based on different similar levels

    不同相似度水平下的注釋結果均表明霉變過程的黑毛茶樣品真菌種群主要為曲霉屬(Aspergillus)真菌,占比達98%以上,其次為德巴利酵母屬(Debaryomyces)真菌(表3)。0.99相似度水平的物種注釋結果較 0.97水平下豐富(表3),新增甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)(表3)真菌注釋結果及未能清晰注釋的 Ascomycota unclassified、Eurotiales unclassified和Trichocomaceae unclassified(表4)等3個屬的真菌。從研究材料考慮,黑毛茶霉變過程以占絕對優(yōu)勢的曲霉屬(Aspergillus)真菌所表征,清晰闡述該屬真菌的具體種類及生物學特性是黑茶倉儲及安全評價亟待解決的問題。從研究方法考慮,基于0.97的相似度水平對于真菌18 S條帶的物種注釋存在一定的局限性,18 S r DNA為高度保守序列,在進化過程中變異程度低,較難區(qū)分注釋親緣關系較近的真菌種群分類學地位。

    表3 霉變黑毛茶的真菌群落組成(可注釋)Table 3 The fungal community composition in mildew dark tea (can be noted)

    表4 霉變黑毛茶的真菌群落組成(未能注釋)Table 4 The fungal community composition in mildew dark tea (can not be noted)

    黑毛茶霉變過程真菌多樣性及豐度變化見Heatmap圖(圖6),橫軸樣品為不同霉變時間的黑毛茶樣品,縱軸顯示各屬真菌種類,不同顏色表示各屬真菌在樣品中的豐度,圖上方進化樹表明樣品間的相似程度:0.99相似度水平下的進化樹聚類分析結果更能還原實際樣本情況,1號樣品為一類,2、3、4、5、6、7號樣品為一類,表明相似度水平越高,樣本間聚類分析結果更科學。該進化樹聚類分析表明黑毛茶霉變初期(1~3 d)真菌種群變化迅速,第5天開始種群多樣性變化速度減緩,多樣性呈逐漸下降趨勢,至第15天時最低,這與Alpha多樣性指數(shù)結果相一致。該結果表明隨著霉變時間的延長,適宜室溫高濕條件下的曲霉屬(Aspergillus)真菌得到生長繁殖,其他類真菌種群生長受到相對抑制。圖左側進化樹將曲霉屬(Aspergillus)真菌聚為一類,并與其他類真菌有較遠的遺傳距離,在霉變進程中屬于絕對優(yōu)勢真菌種群。在所檢樣品中,許多豐度極低的酵母屬真菌種群亦被檢出,表明高通量測序技術能檢測出樣本中含量極微的真菌種群信息,對分析種群多樣性有著傳統(tǒng)分析方法無法比擬的優(yōu)越性。

    3 討論

    黑茶微生物學的研究多基于微生物與其品質形成機理的相互關系開展微生物的種群鑒定及功能注釋等方面的研究[3-7],但鮮見黑茶生霉劣變過程中的真菌種群多樣性分析及物種注釋。采用高通量測序技術直接從樣本中提取微生物基因組總DNA,并對18 S條帶進行特異性擴增,解決了不可培養(yǎng)及低豐度真菌在傳統(tǒng)方法中無法檢出的局限。如形態(tài)學鑒定法對貯藏期的黑茶樣本進行研究僅發(fā)現(xiàn)黑曲霉(Aspergillus niger)、灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)、 產(chǎn) 黃 青 霉 ( Penicillium chrysogenum)、根霉屬(Rhizopus spp.)、木霉屬(Trichoderma spp.)、酵母(分類學地位未知)等真菌種群[26-28]。本方法基于Miseq平臺測序技術,研究了高濕條件下黑茶霉變的主要真菌種群結構和多樣性特性,不僅了解了黑毛茶霉變過程中主要真菌種群為曲霉屬(Aspergillus),而且解析出其豐度值高達98%以上,同時低豐度的甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)、畢赤酵母屬(Pichia)、地霉屬(Galactomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)等真菌亦有檢出,這與Abe M等[3]和Xu A等[5]采用DGGE技術鑒定貯藏期茯磚茶和普洱茶的結果較一致,但更加全面地揭示出低豐度地霉屬(Galactomyces)、甲醇誘導型酵母屬(Ogataea)、隱球菌屬(Cryptococcus)等真菌種群,表明該研究方法具有傳統(tǒng)鑒定法無法比擬的優(yōu)勢,這與陳慶金等[29]的觀點一致。

    基于0.97的相似度水平下多樣性 Shannon指數(shù)為 0.15~0.43,Simpson 指數(shù) 0.7449~0.9492;基于 0.99的相似度水平下多樣性Shannon指數(shù)為0.28~0.58,Simpson指數(shù)0.7007~0.9032,該結果表明曲霉屬(Aspergillus)真菌是黑毛茶霉變過程中霉菌的優(yōu)勢菌群。陳建玲等[30]曾報道了普洱茶在高濕條件下的真菌毒素含量,從食品安全的角度而言,我們需要防范高濕條件下曲霉屬真菌可能產(chǎn)生的真菌毒素給消費者帶來的安全隱患。高濕條件下,曲霉屬真菌代謝繁殖,使之成為黑毛茶霉變過程的絕對優(yōu)勢真菌種群,并隨著霉變程度的增加使之在真菌菌群多樣性結構中的豐度進一步加大。而黑毛茶霉變過程中霉菌的具體種名及豐度動態(tài)變化需要進一步研究。

    需要留意的是,從我們已進行的感官審評和傳統(tǒng)形態(tài)分類學方面的鑒定工作來看,人工促霉的黑茶樣本和存放環(huán)境不當所導致的黑毛茶自然霉變樣本真菌種群存在差異,考慮霉變真菌種群受到樣本所處環(huán)境中的微生物菌群、環(huán)境基質及外界條件等共同影響,該部分內(nèi)容將在以后的工作中進行系統(tǒng)研究。

    基于高通量測序結果的物種注釋在 OTU閾值劃分時需要留意,不同的OTU閾值劃分對物種的分類學結果及多樣性指數(shù)會帶來一定的影響,特別是對豐度低的物種和樣本間聚類分析進行研究時建議提高相似度水平,有利于同源性高的物種和豐度低的物種注釋出分類學結果,也有利于樣本間相似度分析時的結果更科學。

    [1]齊桂年, 田鴻, 劉愛玲, 等. 四川黑茶品質化學成分的研究[J]. 茶葉科學, 2004, 24(4): 266-269.

    [2]安徽農(nóng)學院. 制茶學[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999: 227-230.

    [3]Abe M, Takaoka N, Idemoto Y, et al. Characteristic fungi observed in the fermentation process for Puer tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 124(2): 199-203.

    [4]Lyu C, Chen C, Ge F, et al. A preliminary metagenomic study of puer tea during pile fermentation [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(13): 3165-3174.

    [5]Xu A, Wang Y, Wen J, et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fuzhuan brick-tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 146(1): 14-22.

    [6]Zhao M, Xiao W, Ma Y, et al. Structure and dynamics of the bacterial communities in fermentation of the traditional Chinese post-fermented pu-erh tea revealed by 16S rRNA gene clone library [J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2013, 29(10): 1877-1884.

    [7]Zhao M, Zhang DL, Su XQ, et al. An integrated metagenomics/metaproteomics investigation of the microbial communities and enzymes in solid-state fermentation of Pu-erh tea [J]. Scientific Reports, 2015(5): 1-10.

    [8]陳棟, 李晶晶, 方祥, 等. 廣東陳香茶后發(fā)酵過程中主要微生物種群和酶類活性變化的研究[J]. 茶葉科學, 2010, 30(6): 429-434.

    [9]吳香蘭, 劉仲華, 曹丹, 等. 茯磚茶對小鼠腸道免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究[J]. 茶葉科學, 2013, 33(2): 125-130.

    [10]任洪濤, 周斌, 秦太峰, 等. 普洱茶揮發(fā)性成分抗氧化活性研究[J]. 茶葉科學, 2014, 34(3): 213-220.

    [11]滕翠琴, 劉仲華, 龔受基, 等. 六堡茶對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞糖脂代謝的影響[J]. 茶葉科學, 2014, 34(3): 230-238.

    [12]梅宇, 王智超, 林璇. 2015年中國茶葉產(chǎn)銷形勢分析[J]. 茶世界, 2015(4): 21-30.

    [13]HAAS D, PFEIFER B, Reiterich C, et al. Identification and quantification of fungi and mycotoxins from Pu-erh tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2013, 166(2): 316-322.

    [14]MO HZ, ZHANG H, WU QH, et al. Inhibitory effects of tea extract on aflatoxin production by Aspergillus flavus [J]. Letters in Applied Microbiology, 2013, 56(6): 462-466.

    [15]胥偉, 趙仁亮, 姜依何, 等. 湖南黑毛茶等溫吸濕模型建立及霉變安全性研究[J/OL]. 食品科學. http://www.cnki.net/ kcms/detail/11. 2206. TS.20170303. 1431.086.html.

    [16]葛英亮, 于水利, 時文歆, 等. 應用Illumina MiSeq高通量測序技術解析O3-BAC飲用水處理過程細菌多樣性變化[J].食品科學, 2016, 37(16): 223-228.

    [17]Wei Zhang, Ruijuan Yang, Wenjun Fang, et al. Characterization of thermophilic fungal community associated with pile fermentation of Pu-erh tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2016, 227: 29-33.

    [18]WANG Q, GARRITY G M, TIEDJE J M, et al. Naive bayesian classifier for rapid assignment of rrna sequences into the new bacterial taxonomy [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(16): 5261-5267.

    [19]Urmas K? ljalg, R Henrik Nilsson, Kessy Abarenkov, et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi [J]. Molecular Ecology, 2013, 22: 5271-5277.

    [20]Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data [J]. Nature Methods, 2010, 7(5): 335-336.

    [21]Schloss PD, Gevers D, Westcott SL. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies [J]. PLoS ONE, 2011, 6(12): e27310.

    [22]謝萍, 徐明生, 尹仲平, 等. Miseq測序研究散裝醬鹵鴨肉貯藏期間微生物群落多樣性[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(11): 120-126, 106.

    [23]徐帥, 林奕岑, 周夢佳, 等. 基于高通量測定肉雞回腸微生物多樣性及PICRUSt基因預測分析[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2016, 28(8): 2581-2588.

    [24]曹碧璇, 胡濱, 劉愛平. 利用16S rRNA基因克隆文庫分析東北自然發(fā)酵酸菜中細菌多樣性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(11): 76-80.

    [25]Katherine R Amato, Carl J Yeoman, Angela Kent, et al. Habitat degradation impacts black howler monkey (Alouatta pigra) gastrointestinal microbiomes [J]. The ISME Journal, 2013, 7(7): 1344-1353.

    [26]彭喜春, 于淼. 一款 10年陳熟普洱茶中可培養(yǎng)微生物的分離鑒定[J]. 食品科學, 2011, 32(15): 196-199.

    [27]方祥, 陳棟, 李晶晶, 等. 普洱茶不同貯藏時期微生物種群的鑒定[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(2): 105-108, 160.

    [28]鐘濤, 齊桂年, 胥偉, 等. 藏茶貯存過程中真菌種群的鑒定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(10): 101-103, 106.

    [29]陳慶金, 黃麗, 滕建文, 等. 基于 Miseq測序分析六堡茶陳化初期真菌多樣性[J]. 食品科技, 2015, 40(8): 67-71.

    [30]陳建玲, 李文學, 楊光宇, 等. 廣州某茶葉市場普洱茶中多種生物毒素污染現(xiàn)狀調(diào)查[J]. 癌變畸變突變, 2011, 23(1): 68-71.

    RNA Sequencing Analysis of Fungi Community Diversity in Mildew Raw Dark Tea

    XU Wei, JIANG Yihe, WU Dan, ZHAO Renliang, ZHU Qi*

    1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

    In order to understand the feature of microbe in the mildew dark tea under high humidity conditions, Illumina Miseq high-throughput sequencing was performed to study fungi diversity by artificial culture of certain fungi. The influence of the OTU (Operational Taxonomic Unit) threshold on the bioinformatic analysis results of fungal diversity was also discussed. The results showed that the mildew dark tea fungus under high humidity conditions were mainly classified into 2 phylum (Ascomycota, Basidiomycota) and 6 genera (Aspergillus, Galactomyces, Ogataea, Debaryomyces, Pichia and Cryptococcus), with the highest abundance value of Aspergillus (>98%). The different OTU thresholds resulted in the difference in the taxonomic status, diversity index and community structure in the same sample. The Shannon diversity index of OTU under the 0.97 was 0.15-0.43, and the Shannon diversity index under 0.99 was 0.28-0.58. Under high moisture conditions aspergillus was the major fungi causing dark tea mildew in storage.

    raw dark tea, mildew, fungi community diversity

    TS272.5+4;Q949.32

    A

    1000-369X(2017)05-483-10

    2017-02-28

    2017-05-04

    國家自然科學基金(31571802)、湖南省教育廳重點項目(14A066)、湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2016B283)

    胥偉,男,博士研究生,主要從事茶葉加工及功能成分化學研究。*通訊作者:1965994459@qq.com

    猜你喜歡
    毛茶分類學高通量
    劉嘉怡作品
    ——增城毛茶制作技藝插畫
    大觀(2023年8期)2023-09-25 06:21:14
    高通量衛(wèi)星網(wǎng)絡及網(wǎng)絡漫游關鍵技術
    國際太空(2023年1期)2023-02-27 09:03:42
    仁化紅山鎮(zhèn)白毛茶亮相央視《新聞直播間》
    源流(2022年5期)2022-06-30 01:31:44
    疫情背景下“布盧姆教育目標分類學”的應用
    高通量血液透析臨床研究進展
    Ka頻段高通量衛(wèi)星在鐵路通信中的應用探討
    湖南不同等級黑毛茶品質分析
    茶葉通訊(2018年3期)2018-11-08 07:01:56
    中國通信衛(wèi)星開啟高通量時代
    國家自然科學基金青年基金項目 后現(xiàn)代中國植物志的修訂——中國山礬科的分類學修訂
    直接民意、間接民意及司法應對——分類學視角下對司法與民意關系的再審視
    99久久精品一区二区三区| 99久国产av精品国产电影| 国产精品无大码| 国产黄片美女视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日日啪夜夜撸| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美日韩在线观看h| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产毛片在线视频| 两个人免费观看高清视频 | 男女边吃奶边做爰视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 男女边摸边吃奶| 好男人视频免费观看在线| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久久久久久成人| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲综合精品二区| 亚洲内射少妇av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 成人免费观看视频高清| 欧美97在线视频| a级毛色黄片| 国产精品久久久久久av不卡| 女人精品久久久久毛片| 美女大奶头黄色视频| 日韩一本色道免费dvd| 久久热精品热| 免费观看av网站的网址| 日韩一区二区三区影片| 99热全是精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲久久久国产精品| 国产精品一区二区性色av| 最黄视频免费看| 精品午夜福利在线看| 综合色丁香网| 美女福利国产在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 中文在线观看免费www的网站| 久久久久久久久久成人| 免费高清在线观看视频在线观看| av福利片在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美性感艳星| 免费观看的影片在线观看| a级毛色黄片| 亚洲精品456在线播放app| 99久久精品一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产熟女午夜一区二区三区 | 亚洲第一区二区三区不卡| 成人毛片a级毛片在线播放| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 日韩人妻高清精品专区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 成人黄色视频免费在线看| 精品久久久久久电影网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 极品人妻少妇av视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 国产亚洲欧美精品永久| 中国国产av一级| 精品国产国语对白av| 免费大片18禁| 国产深夜福利视频在线观看| 少妇 在线观看| 免费看日本二区| 大香蕉97超碰在线| 国产成人免费无遮挡视频| 搡老乐熟女国产| 久久国产乱子免费精品| 中文欧美无线码| 亚洲av成人精品一二三区| 免费观看a级毛片全部| 国产黄片美女视频| a级片在线免费高清观看视频| 美女中出高潮动态图| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲欧美一区二区三区国产| 在线免费观看不下载黄p国产| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 人妻人人澡人人爽人人| 最近手机中文字幕大全| 国产亚洲精品久久久com| 国产亚洲精品久久久com| 能在线免费看毛片的网站| 伦理电影免费视频| 人人妻人人澡人人看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 九九在线视频观看精品| 内射极品少妇av片p| 国产色婷婷99| 伦精品一区二区三区| 久久av网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费黄色在线免费观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲av福利一区| 少妇人妻 视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 22中文网久久字幕| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲中文av在线| 亚洲性久久影院| 人妻 亚洲 视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲图色成人| 老熟女久久久| av黄色大香蕉| 人人妻人人看人人澡| 不卡视频在线观看欧美| 黄色配什么色好看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本91视频免费播放| 自线自在国产av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一个人免费看片子| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 尾随美女入室| 亚洲丝袜综合中文字幕| 中文字幕久久专区| 精品一区二区三卡| 女人久久www免费人成看片| 寂寞人妻少妇视频99o| 2022亚洲国产成人精品| 观看av在线不卡| 99久久中文字幕三级久久日本| 夫妻午夜视频| 国产精品欧美亚洲77777| 视频中文字幕在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国产成人aa在线观看| 国内精品宾馆在线| 51国产日韩欧美| 国产精品一二三区在线看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 青春草视频在线免费观看| 十八禁高潮呻吟视频 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品福利在线免费观看| xxx大片免费视频| 日本vs欧美在线观看视频 | 一本久久精品| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩 亚洲 欧美在线| 人妻系列 视频| 韩国高清视频一区二区三区| 久久人人爽人人片av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 香蕉精品网在线| 成年av动漫网址| 丝袜在线中文字幕| 热re99久久精品国产66热6| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 下体分泌物呈黄色| 黄色视频在线播放观看不卡| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲av日韩在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 男人舔奶头视频| 深夜a级毛片| 热re99久久精品国产66热6| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费黄频网站在线观看国产| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 在线观看人妻少妇| 涩涩av久久男人的天堂| 99国产精品免费福利视频| 在线看a的网站| av福利片在线| 少妇人妻久久综合中文| 欧美精品国产亚洲| 亚洲精品国产av成人精品| 丝袜在线中文字幕| 国产精品不卡视频一区二区| 国产免费福利视频在线观看| 黑人高潮一二区| 嫩草影院新地址| 免费观看的影片在线观看| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品日本国产第一区| 国产91av在线免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品国产av在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日本wwww免费看| av国产精品久久久久影院| 亚洲欧美日韩另类电影网站| kizo精华| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产精品国产三级国产专区5o| 午夜视频国产福利| 22中文网久久字幕| 久久久精品94久久精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久毛片免费看一区二区三区| 男人舔奶头视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 色视频www国产| 内射极品少妇av片p| 欧美精品一区二区免费开放| 日韩强制内射视频| 久久国内精品自在自线图片| 欧美成人午夜免费资源| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 女人久久www免费人成看片| 最新中文字幕久久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品久久久久久精品古装| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产欧美亚洲国产| 日本色播在线视频| 大码成人一级视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 十分钟在线观看高清视频www | 久久ye,这里只有精品| 最近的中文字幕免费完整| 男人添女人高潮全过程视频| 天堂中文最新版在线下载| 99热网站在线观看| av卡一久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲国产精品999| 这个男人来自地球电影免费观看 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲真实伦在线观看| 欧美国产精品一级二级三级 | 边亲边吃奶的免费视频| 男人舔奶头视频| 精品久久久久久电影网| 久久6这里有精品| 国产 精品1| 一个人免费看片子| 天堂中文最新版在线下载| 精品一区二区免费观看| 热re99久久国产66热| 一本一本综合久久| 简卡轻食公司| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 九草在线视频观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| www.色视频.com| 亚洲国产精品一区三区| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产日韩欧美亚洲二区| 国产av码专区亚洲av| 日韩伦理黄色片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 下体分泌物呈黄色| 国产淫语在线视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲一区二区三区欧美精品| 极品人妻少妇av视频| 我要看日韩黄色一级片| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲无线观看免费| 永久网站在线| 一区在线观看完整版| 少妇的逼好多水| 黄色毛片三级朝国网站 | 三级经典国产精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品女同一区二区软件| 春色校园在线视频观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人特级av手机在线观看| 91成人精品电影| 十八禁高潮呻吟视频 | 欧美另类一区| 丝袜脚勾引网站| 人妻 亚洲 视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 午夜免费鲁丝| 韩国av在线不卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 秋霞伦理黄片| 亚洲av不卡在线观看| 免费少妇av软件| 蜜桃在线观看..| 在线观看av片永久免费下载| 欧美少妇被猛烈插入视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品久久久久久电影网| 亚洲综合精品二区| 91成人精品电影| 国产精品久久久久久久电影| 最新中文字幕久久久久| 日韩欧美精品免费久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 我的女老师完整版在线观看| 9色porny在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 极品教师在线视频| 国产av一区二区精品久久| 三级国产精品欧美在线观看| 久久久国产一区二区| 久久人人爽人人片av| 久久久久国产网址| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜91福利影院| 欧美精品高潮呻吟av久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 男女边摸边吃奶| xxx大片免费视频| av国产精品久久久久影院| 亚洲国产精品国产精品| 成人亚洲欧美一区二区av| av一本久久久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 熟女电影av网| 日本vs欧美在线观看视频 | 秋霞伦理黄片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久青草综合色| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日本欧美视频一区| 精品熟女少妇av免费看| 成人特级av手机在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| av在线老鸭窝| .国产精品久久| 我的女老师完整版在线观看| 日本欧美国产在线视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日本av免费视频播放| 好男人视频免费观看在线| 18禁动态无遮挡网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美最新免费一区二区三区| 色吧在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 黄色视频在线播放观看不卡| 中文字幕久久专区| 伊人亚洲综合成人网| 丰满乱子伦码专区| 少妇熟女欧美另类| 亚洲国产精品999| 中文欧美无线码| 在线观看国产h片| 在线观看www视频免费| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 高清av免费在线| 91精品国产九色| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品一区二区性色av| 亚洲精品色激情综合| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲综合色惰| 亚洲国产最新在线播放| 久久久国产欧美日韩av| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 各种免费的搞黄视频| 高清欧美精品videossex| tube8黄色片| 亚洲第一区二区三区不卡| 大码成人一级视频| 99久国产av精品国产电影| 国产色爽女视频免费观看| 国产成人精品久久久久久| 国产亚洲欧美精品永久| 美女cb高潮喷水在线观看| 美女中出高潮动态图| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产男女内射视频| 在线观看www视频免费| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲精品国产成人久久av| 丝袜在线中文字幕| 高清午夜精品一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频 | 赤兔流量卡办理| 国产极品天堂在线| 综合色丁香网| 日韩电影二区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 午夜91福利影院| 欧美变态另类bdsm刘玥| 中文欧美无线码| 久久6这里有精品| 久久久久久久久久久丰满| 美女大奶头黄色视频| av在线播放精品| 日韩一区二区视频免费看| 日韩伦理黄色片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产欧美亚洲国产| 亚洲美女黄色视频免费看| 黄片无遮挡物在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 妹子高潮喷水视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 99热网站在线观看| 丰满少妇做爰视频| 赤兔流量卡办理| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 日日撸夜夜添| 最近的中文字幕免费完整| 久久国产精品大桥未久av | 国产av一区二区精品久久| 婷婷色综合大香蕉| 免费观看的影片在线观看| 亚洲精品一二三| 国产一区二区在线观看av| 三级国产精品片| 国产成人精品无人区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲av不卡在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 一二三四中文在线观看免费高清| 丁香六月天网| 欧美最新免费一区二区三区| 日韩强制内射视频| 涩涩av久久男人的天堂| 国产一区二区三区av在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲经典国产精华液单| 各种免费的搞黄视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 免费看光身美女| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲内射少妇av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲av国产av综合av卡| 久久97久久精品| av在线老鸭窝| 久久婷婷青草| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久免费观看电影| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲av在线观看美女高潮| 两个人的视频大全免费| 综合色丁香网| 老女人水多毛片| 国产精品国产三级专区第一集| 热re99久久国产66热| 秋霞伦理黄片| 久久久久精品久久久久真实原创| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 在线播放无遮挡| 久久久久久久久大av| 97精品久久久久久久久久精品| 久久久久久久久久久免费av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲av日韩在线播放| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲欧美精品专区久久| 一本大道久久a久久精品| 高清视频免费观看一区二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 性色av一级| 亚洲av日韩在线播放| 久久97久久精品| 久久这里有精品视频免费| 最黄视频免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| 人人澡人人妻人| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | av不卡在线播放| 国产黄片美女视频| 日本av手机在线免费观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲av免费高清在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产永久视频网站| a 毛片基地| 亚洲欧美精品自产自拍| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 看十八女毛片水多多多| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产成人一区二区在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩电影二区| 一级毛片 在线播放| 极品教师在线视频| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产 精品1| 高清黄色对白视频在线免费看 | 久久女婷五月综合色啪小说| 一区二区三区四区激情视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 在线 av 中文字幕| 十八禁网站网址无遮挡 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 蜜臀久久99精品久久宅男| 熟女人妻精品中文字幕| 永久免费av网站大全| 亚洲国产色片| 寂寞人妻少妇视频99o| 春色校园在线视频观看| 99视频精品全部免费 在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 人妻一区二区av| √禁漫天堂资源中文www| 欧美精品高潮呻吟av久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费看av在线观看网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影小说| 永久网站在线| 最近手机中文字幕大全| 九草在线视频观看| 亚洲情色 制服丝袜| 久久av网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 色5月婷婷丁香| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品国产av在线观看| 一级a做视频免费观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲精品国产成人久久av| 国产色爽女视频免费观看| av免费在线看不卡| 亚洲精品一区蜜桃| 婷婷色综合大香蕉| 日本黄色片子视频| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产 精品1| 日韩一本色道免费dvd| 国产 精品1| 精品人妻偷拍中文字幕| 男人爽女人下面视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美最新免费一区二区三区| 美女内射精品一级片tv| 久久久久久久久久成人| 一级毛片电影观看| 另类亚洲欧美激情| 伦理电影免费视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 丰满乱子伦码专区| 国产精品国产av在线观看| 成人影院久久| 国产精品99久久久久久久久| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 多毛熟女@视频| 久久这里有精品视频免费| 男女边吃奶边做爰视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜久久久在线观看| 中文字幕久久专区| 夫妻午夜视频| 午夜福利,免费看| 久久6这里有精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 成人无遮挡网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品久久久精品久久久| av.在线天堂| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久鲁丝午夜福利片| 春色校园在线视频观看| 永久网站在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美精品一区二区大全| 亚洲国产色片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品自拍成人| 国产乱来视频区| 亚洲欧美精品专区久久| 国产一级毛片在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 极品教师在线视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲美女搞黄在线观看|