外源接種黃曲霉污染普洱茶安全性研究

李亞莉，邢倩倩，涂青，周紅杰

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201

外源接種黃曲霉污染普洱茶安全性研究

李亞莉，邢倩倩，涂青，周紅杰*

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201

以云南普洱茶為實驗材料，外源接種黃曲霉（Aspergillus flavus）菌株于普洱茶原料及成品中，設(shè)未接種菌株普洱茶為對照，分別置于室溫，濕度80%、溫度30℃，濕度90%、溫度30℃的恒溫恒濕箱條件下存放，在第7天、14天、21天、28天分別取樣以LC-MS/MS檢測法進(jìn)行黃曲霉毒素檢測。檢測結(jié)果表明，所有受試茶樣中均未檢測到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，檢出率為0。說明無論是室溫還是在高溫高濕條件下，被黃曲霉污染的普洱茶，經(jīng)存放后，不會產(chǎn)黃曲霉毒素，就這一點而言普洱茶具有較高的飲用安全性。

普洱茶；黃曲霉；黃曲霉毒素；安全性

曲霉毒素（Aflatoxins, AFT）屬真菌毒素，是某些黃曲霉菌和寄生曲霉菌所產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物[1]，含有一個雙呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?，前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者可能與致癌有關(guān)[2-3]。黃曲霉毒素是一種毒性很強(qiáng)的肝毒素，可引起肝臟的急性或慢性損害，除損害機(jī)體的肝臟以外，黃曲霉毒素對腎臟等其他多種組織器官也能造成嚴(yán)重?fù)p害，更為嚴(yán)重的是，黃曲霉毒素已被證實具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的作用[4]，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為Ⅰ類致癌物質(zhì)，嚴(yán)重危害人、畜、禽類健康[5]。

普洱茶是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質(zhì)特征的茶葉[6]。倉儲陳化是普洱茶重要的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，普洱茶“越陳越香”主要是由茶的本質(zhì)特征、儲藏的環(huán)境、存放的年限等多種因素決定的。由于普洱茶的發(fā)酵和倉儲環(huán)境存在高溫、高濕的特殊性，而黃曲霉毒素的污染主要是由于儲存條件不當(dāng)造成的，如倉儲溫度高、濕度大、通風(fēng)透氣條件不良等，因此人們對普洱茶是否會受到黃曲霉污染并產(chǎn)生致癌物質(zhì)存有疑慮。針對這一問題，前人進(jìn)行了相關(guān)研究。

2003年，臺灣的孫璐西[7]將黃曲霉接種于云南曬青毛茶，進(jìn)行模擬普洱茶渥堆試驗。試驗發(fā)現(xiàn)，接種黃曲霉的毛茶中只有滅過菌的A組檢出黃曲霉毒素（1.05 μg·kg-1），且其量低于標(biāo)準(zhǔn)，其余B及C組皆未檢出黃曲霉毒素。2014年，李亞莉等[8]進(jìn)行了接種產(chǎn)毒黃曲霉進(jìn)行模擬普洱茶發(fā)酵試驗，結(jié)果表明，在普洱茶發(fā)酵過程中，接種的黃曲霉能在茶葉中生長繁殖，但在發(fā)酵終止時，未在茶樣中檢測出黃曲霉毒素。2011年，徐丹等[9-10]研究了黑曲霉對黃曲霉生長、產(chǎn)毒的抑制作用，發(fā)現(xiàn)黑曲霉既能抑制黃曲霉生長、產(chǎn)毒，又能降解AFTB1。陳建玲等[11]抽取了70份濕倉儲存普洱茶樣本，檢測黃曲霉毒素B1、伏馬毒素（Fumonisin B1, FB1）、嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇, deoxynivalenol, DON）和T-2毒素的濃度，結(jié)果表明，濕倉儲存普洱茶存在真菌毒素 AFB1及 DON不同程度的污染。

普洱茶質(zhì)量安全問題已成為普洱茶生產(chǎn)、消費和管理領(lǐng)域的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。為了更全面系統(tǒng)地研究普洱茶在倉儲過程中是否產(chǎn)生黃曲霉毒素，本文模擬高溫高濕的倉儲環(huán)境，以人工致霉變的普洱茶樣和產(chǎn)毒黃曲霉菌株污染的普洱茶茶樣為實驗對象，分析普洱茶在受黃曲霉污染的情況下是否產(chǎn)毒，為普洱茶生產(chǎn)安全、質(zhì)量安全及飲用安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗茶樣：普洱生茶（緊壓茶）、普洱熟茶（緊壓茶）、曬青毛茶、普洱熟茶（散茶），來源于云南南澗鳳凰沱茶廠。

實驗菌株：黃曲霉（A. flavus）菌株，引自云南省微生物研究所。YM 31880，來源于ATCC（美國菌種保藏中心）；YM 31882，來源于AS（中國科學(xué)院微生物研究所）。兩株菌均能產(chǎn)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。

1.2 試劑及儀器

黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度 99%，美國Sigma公司），乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher公司），鹽酸（分析純），MycoSep 228 AflaPat多功能凈化柱（配 10 mL樣品凈化試管，美國Romer公司），0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜（德國MEMBRANA公司），18.2 MΩ·cm超純水由賽多利斯超純水機(jī)生產(chǎn)。

潔凈工作臺（蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、恒溫恒濕箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、架盤藥物天平（北京醫(yī)用天平廠）、LC/MS/MS高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB公司）、液相色譜儀（日本島津）、AS系列超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）、高速冷卻離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、氮吹儀（美國Organomation公司）、電子天平（德國Sartorius公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化

將黃曲霉菌株YM 31880、YM 31882接種到PDA培養(yǎng)基斜面上，28℃活化培養(yǎng)5～7 d備用。

1.3.2 孢子懸液的制備與接種

根據(jù)兩株黃曲霉菌種在PDA斜面上的生長狀況，挑選出生長力比較旺盛的菌種進(jìn)行孢子懸浮液的制備與接種。實驗顯示YM 31882生長力較YM 31880更強(qiáng)，所以之后的接種便選取YM 31882。取PDA斜面活化的菌種數(shù)支，加入適量0.85%的生理鹽水，使孢子懸浮于生理鹽水中，并用無菌移液管轉(zhuǎn)移至無菌三角瓶中（200 mL），再以血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度達(dá)到106cfu·mL-1，備用。

曬青毛茶、普洱散茶（熟）：分別取 40 g曬青毛茶、普洱散茶（熟）放入無菌玻璃瓶中。按5%的接種量接入茶樣中，混勻，用三層紗布封口，培養(yǎng)24 h搖瓶1次。YM 31882孢懸液黃曲霉菌數(shù)為3.326×107cfu·mL-1，茶樣接種YM 31882的量為1.66×105cfu·g-1。

普洱緊壓茶（生、熟）：緊壓茶 100 g小餅，按5%的接種量均勻噴霧接種于茶餅表面，用棉紙包好。YM 31882孢懸液黃曲霉菌數(shù)為3.326×107cfu·mL-1，茶樣接種YM 31882的量為1.66×105cfu·g-1。

1.3.3 茶樣處理

為更系統(tǒng)地研究普洱茶是否產(chǎn)毒，實驗?zāi)M黃曲霉適宜的生長環(huán)境：（1）濕度80%、溫度30℃；（2）濕度90%、溫度30℃；（3）室溫、常濕。將接種黃曲霉菌株YM 31882的茶樣置于相應(yīng)的恒溫恒濕箱中，設(shè)未接種普洱茶為對照。第7天、第14天、第21天和第28天取樣，檢測黃曲霉毒素。試驗各處理見表1，每個處理重復(fù)3次。

表1 試驗處理Table 1 Experimental treatment

1.3.4 黃曲霉毒素檢測——LC-MS/MS檢測法

（1）提取

取2.0 g混合均勻并搗碎的茶葉末于25 mL具塞比色管中，加入1%鹽酸溶液/乙腈（3∶7）提取液15 mL，旋渦混勻后超聲30 min，過濾，取濾液備用。

（2）凈化

取濾液10 mL于多功能凈化柱配套的試管內(nèi)，緩慢壓下多功能凈化柱，保持1 mL·min-1的速度，完全壓至試管底部，取凈化后的提取液5 mL于10 mL的比色管中，在40℃的溫度下氮吹至盡干，用1 mL水/甲醇（2∶8）溶液洗滌殘渣，振蕩混勻，用0.22 μm濾膜針頭濾器過濾，濾液待測。

（3）測定

色譜條件：色譜柱為美國 Waters公司Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動相A為水，流動相B為甲醇。流動相梯度洗脫條件見表2，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫40℃。

表3 4種黃曲霉毒素的保留時間、定性定量離子對及錐孔電壓和碰撞電壓Table 3 Test conditions of multiple reactions of 4 kinds of aflatoxins

質(zhì)譜條件：掃描方式：電噴霧正離子模式（ESI+）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧電壓：5 500 V；氣簾氣：30 kPa；碰撞氣：55 kPa；脫溶劑溫度：600℃；霧化氣：10 kPa；輔助氣：60 kPa。多反應(yīng)檢測條件見表3。

計算方法：試樣中的黃曲霉毒素含量按以下公式進(jìn)行計算：

式中：X為試樣中待測組分含量（μg·kg-1）；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的樣液中待測組分的質(zhì)量濃度（ng·mL-1）；V為樣液最終定容體積（mL）；m為稱取樣品的質(zhì)量（g）。

檢出限與精密度：本方法黃曲霉毒素（G1、G2、B1、B2）測定最低限均為 0.5 μg·kg-1。在重復(fù)條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株黃曲霉菌種在PDA斜面上的生長情況

將產(chǎn)毒黃曲霉菌種 YM 31880和 YM 31882接至PDA斜面上，28℃±1℃恒溫培養(yǎng)，觀察其生長情況，圖 1、圖 2是菌種在 PDA斜面上生長6 d后的情況。

如圖1與圖2所示，2株菌株培養(yǎng)6 d后，PDA斜面上，YM 31880菌種生長出的氣生菌絲稀少，黑色菌核比較多，菌落呈橘紅色，孢子呈黃綠色。YM 31882菌種的氣生菌絲生長旺盛，有黑色菌核，菌落呈黃綠色，孢子呈黃綠色。所以，為了使實驗更具說服力，在接下來的實驗中選取YM 31882菌種。

2.2 未接種與接種后不同階段茶樣中微生物的變化

圖1 YM 31882生長6 d斜面Fig. 1 Growth results of YM 31882 fungi on the 6th day

圖2 YM 31880生長6 d斜面Fig. 2 Growth results of YM 31880 fungi on the 6th day

將接種黃曲霉菌茶樣和未接種茶樣按試驗設(shè)計置于 30℃、相對濕度 80%，30℃、相對濕度90%和室溫條件3種環(huán)境下存放。其中1～12號茶樣未接種黃曲霉菌株，13～24號茶樣接種了黃曲霉菌株YM 31882，接種量1.66× 105cfu·g-1，觀察不同階段茶樣中微生物數(shù)量的變化。

2.2.1 茶樣存放7 d菌落計數(shù)

接種和未接種茶樣存放第 7天的微生物檢測結(jié)果（表4）表明，1～12號茶樣均未檢測到黃曲霉。13～24號茶樣中均檢測到黃曲霉，14、16、23號茶樣中黃曲霉數(shù)量比接種的黃曲霉略多，其他茶樣中黃曲霉的數(shù)量較接種的黃曲霉數(shù)量略少。

在進(jìn)行微生物檢測實驗時，部分茶樣中還檢測出黑曲霉和青霉，1～12茶樣中，1、2、5、6、10號茶樣檢測出黑曲霉，熟茶（2、6、10號）中檢測出的黑曲霉在數(shù)量上比曬青毛茶（1號和5號）多。13～24號茶樣中，13、14、18、24號茶樣中檢測出黑曲霉，僅在17號茶樣中檢測到青霉。

2.2.2 茶樣存放14 d菌落計數(shù)

茶樣存放第14天的微生物檢測結(jié)果（表4）表明，1～12號茶樣中，均未檢測出黃曲霉。13～24號茶樣中，22、23、24號茶樣中未檢測到黃曲霉，其他茶樣均檢測到黃曲霉；在室溫（13～16號茶樣）條件下，茶樣中黃曲霉的數(shù)量與第7天相差不大，在相對濕度80%、90%（17～24號茶樣）條件下，茶樣中黃曲霉數(shù)量較第7天茶樣中的黃曲霉數(shù)量增多。

1～12號茶樣中，2、4、5、9、10、11、 12號茶樣檢測出黑曲霉。室溫條件下，存放7 d、14 d茶樣中黑曲霉數(shù)量變化不大；相對濕度 80%、90%條件下，存放 14 d茶樣中黑曲霉在數(shù)量上比存放7 d的茶樣有所增加。13～24號茶樣中，13、14、17、18、21、22、23號茶樣中檢測出黑曲霉，其余茶樣均未檢測出黑曲霉。室溫條件下，存放7 d與14 d的茶樣中黑曲霉數(shù)量變化不大；相對濕度80%、90%條件下，存放14 d茶樣中黑曲霉數(shù)量比存放7 d的茶樣有所增加。茶樣中青霉比較少。

2.2.3 茶樣存放21 d菌落計數(shù)

茶樣存放第21天的微生物檢測結(jié)果（表4）表明，1～12號茶樣中，5號茶樣檢測到黃曲霉。13～24茶樣中，僅14號和24號茶樣中未檢測到黃曲霉，其他茶樣均檢測到黃曲霉；在室溫（13～16號）條件下，茶樣中黃曲霉的數(shù)量相差不大，在相對濕度80%、90%（17～24號）條件下，茶樣中黃曲霉數(shù)量較第7天、第14天增加，且普洱熟茶（18、20、22、24號）中黃曲霉數(shù)量比普洱生茶（19、23）、曬青毛茶（17、21）少。

除18號茶樣中未檢測到黑曲霉，其他23個茶樣中均檢測到黑曲霉。

2.2.4 茶樣存放28 d菌落計數(shù)

茶樣存放第28天的微生物檢測結(jié)果（表4）表明，1～12號茶樣中，5、6、10號茶樣中檢測出黃曲霉；5號茶樣中第 28天的黃曲霉數(shù)量比 21天有所增加。13～24號茶樣中，除18、20、22號茶樣中未檢測到黃曲霉，其他茶樣中均檢測到黃曲霉。存放 28 d的部分茶樣中黃曲霉數(shù)量較存放21 d的茶樣有所下降。

表4 茶樣中微生物在不同階段的數(shù)量變化Table 4 The time course changes of microorganisms in tea samples cfu·g-1

2.2.5 存放過程中茶樣菌落數(shù)量的變化

在存放過程中（7～28 d），茶樣中黃曲霉的長勢在相對濕度為80%、90%的環(huán)境中要比室溫條件下好。在室溫環(huán)境下，茶樣中的黃曲霉數(shù)量變化波動不大，且室溫條件下存放28 d的茶樣中黃曲霉數(shù)量少于接種的黃曲霉數(shù)量，說明室溫環(huán)境不適合黃曲霉生長，但在相對濕度為80%、90%環(huán)境下，從第14天開始茶樣中黃曲霉的數(shù)量就多于接種量。

在進(jìn)行微生物檢測實驗時，部分茶樣中還檢測出黑曲霉和青霉，1～12號茶樣中均檢測到黑曲霉。室溫（1～4號）條件下，存放7、14、21、28 d的茶樣中黑曲霉在數(shù)量上變化不大；相對濕度80%、90%（5～12號）條件下，茶樣中的黑曲霉數(shù)量在存放過程中呈上升趨勢。13～24號茶樣中均檢測到黑曲霉。室溫（13～16號茶樣）條件下，存放過程中茶樣中黑曲霉數(shù)量變化不大；相對濕度 80%、90%（17～24號）條件下，存放過程中茶樣中黑曲霉數(shù)量呈上升趨勢。存放28 d時，供試茶樣中大部分茶樣的黑曲霉數(shù)量超過黃曲霉的數(shù)量。

茶樣中青霉比較少，只有部分茶樣檢測到青霉，室溫條件下，茶樣中青霉數(shù)量在存放過程中變化不大；相對濕度80%、90%條件下，茶樣中青霉數(shù)量在存放過程中大致呈上升趨勢。

2.3 恒溫恒濕箱存放茶樣中黃曲霉毒素檢測

接種黃曲霉菌株YM 31882的茶樣，在室溫，相對濕度80%、溫度30℃，相對濕度90%、溫度30℃的恒溫恒濕箱中存放7 d、14 d、21 d、28 d時，均已生長黃曲霉孢子，未接種黃曲霉菌株的茶樣也已經(jīng)霉變。存放7 d時，接種黃曲霉菌株YM 31882的茶樣上可看到黃曲霉有所增長，未接種的茶樣開始出現(xiàn)霉變。存放14 d時，接種黃曲霉菌株YM 31882的茶樣上可看到黃曲霉有所增長，未接種黃曲霉菌株的茶樣其霉變程度也較存放7 d時略有增長但總體變化不大。第21天時，接種黃曲霉菌株YM 31882的茶樣上可看到黃曲霉布滿茶樣，未接種黃曲霉菌株的茶樣也已經(jīng)霉變?？傮w來說，室溫條件下第7天和第14天黃曲霉生產(chǎn)情況差異不大；在相對濕度80%、90%（17～24號）條件下，茶樣中黃曲霉數(shù)量與第 7天、第 14天相比呈上升趨勢。存放 28 d時，接種黃曲霉菌株YM 31882的茶樣上可以看到黃曲霉孳生布滿茶樣，未接種黃曲霉菌株的茶樣也已經(jīng)霉變，并且在 28 d左右黃曲霉開始衰老。分別對這幾個時間點取茶樣進(jìn)行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2檢測，檢測結(jié)果表明，無論是存放7 d、14 d的茶樣，還是21 d、28 d的茶樣中均未檢測到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，檢出率為0。說明被黃曲霉污染的普洱茶也不會產(chǎn)毒。

2.3.1 存放第7天茶樣中黃曲霉毒素檢測

黃曲霉產(chǎn)毒高峰在第 5～7天[12]，取第 7天茶樣采用 LC-MS/MS法進(jìn)行黃曲霉毒素檢測。圖3為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，11、12、23、24號茶樣的檢測圖譜如圖4。

圖3 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig. 3 Standard solution chromatograms of aflatoxin B1, B2, G1, G2

由圖4與圖3對比可以看出，樣品在B1、B2、G1、G2對應(yīng)的出峰時間并未有峰值出現(xiàn)，表明存放7 d的茶樣中均未檢測到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，檢出率為 0。結(jié)果說明，普洱茶被黃曲霉污染并且存放于適合黃曲霉生長產(chǎn)毒的環(huán)境中也不會產(chǎn)黃曲霉毒素，普洱茶具有較高的安全性。

2.3.2 存放第28天茶樣中黃曲霉毒素檢測

實驗中觀察到存放14 d和21 d時茶樣中黃曲霉雖然有增長，但變化不大。而第28天時，黃曲霉開始衰老，第 28天的茶樣以LC-MS/MS法進(jìn)行黃曲霉毒素檢測，檢測圖譜如圖5。

由圖5與圖3對比可以看出，樣品在B1、 B2、G1、G2對應(yīng)的出峰時間并沒有峰值出現(xiàn)，表明存放 28 d的茶樣中也未檢測到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，檢出率為0。上述結(jié)果表明，若普洱茶被黃曲霉污染并且存放于適合黃曲霉產(chǎn)毒的高溫高濕環(huán)境中，黃曲霉雖然能在普洱茶中生長，但隨著存放時間的延長，黃曲霉生長呈下降趨勢，同時，可能由于普洱茶的抑菌作用，即便霉變和被黃曲霉污染的普洱茶也不會產(chǎn)生對人體有害的黃曲霉毒素。

圖4 存放7 d普洱茶樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2檢測圖譜Fig. 4 LC-MS/MS analysis of aflatoxin B1, B2, G1, G2 in Pu-erh tea after storaging for 7 d

圖5 存放28 d普洱茶樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2檢測圖譜Fig. 5 LC-MS/MS analysis of aflatoxin B1, B2, G1, G2 in Pu-erh tea after storaging for 28 d

3 討論

本實驗在普洱茶的倉儲過程中添加外源黃曲霉，并置于適宜黃曲霉生長的環(huán)境中進(jìn)行倉儲存放，研究普洱茶的安全性，結(jié)果顯示在各階段均未檢測到黃曲霉毒素。綜合分析，可能的原因是在高溫高濕的倉儲條件下，雖然黃曲霉大量生長，但同時黃曲霉的生長受到了原料茶中微生物（尤其是優(yōu)勢菌種）的競爭抑制作用。有研究表明，黑曲霉是普洱茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種[13]。而在普洱茶發(fā)酵過程中，黃曲霉和黑曲霉的生長都呈現(xiàn)先迅速增長而后逐漸下降的趨勢。黃曲霉在發(fā)酵初期的生長態(tài)勢優(yōu)于黑曲霉，但到發(fā)酵后期，黑曲霉作為優(yōu)勢菌種，其生長強(qiáng)于黃曲霉，說明兩者之間存在競爭抑制作用[8]。除此之外，云南大葉種茶中的某些（種）成分對黃曲霉毒素的生物合成具有抑制作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶具有抗菌抑菌作用，還有研究發(fā)現(xiàn)普洱茶中的沒食子酸和槲皮素均能抑制黃曲霉菌產(chǎn)生AFB1[14]；吳清華[15]、李浩[16]研究發(fā)現(xiàn)，紅茶、綠茶、普洱生茶、普洱熟茶和花茶的水提物均對黃曲霉產(chǎn)毒有不同程度的抑制作用，但對黃曲霉的生長沒有明顯的抑制作用?；蛟S茶葉中的某些（種）物質(zhì)抑制了合成黃曲霉毒素的關(guān)鍵酶，但具體是什么物質(zhì)目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究闡明。

普洱茶的倉儲陳化是形成其品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，但倉儲需要適宜的環(huán)境條件（溫度25℃±3℃，相對濕度≤75%），如溫濕度控制不當(dāng)，如高溫高濕條件有利于微生物生長繁殖，有害微生物產(chǎn)生真菌毒素導(dǎo)致茶葉出現(xiàn)霉變現(xiàn)象，因而存在真菌毒素污染的可能。本實驗在高溫高濕環(huán)境下進(jìn)行，添加外源黃曲霉菌，實驗結(jié)果并未檢測到黃曲霉毒素，說明普洱茶具有較高的安全性。但實驗只檢測了黃曲霉毒素，對高溫高濕條件下是否有其他有毒物質(zhì)產(chǎn)生還有待進(jìn)一步研究和驗證。

實踐經(jīng)驗證明，普洱茶與其他茶相比，特別耐貯藏。它的這種特性表現(xiàn)在經(jīng)過一定時間貯藏的普洱茶品質(zhì)會得到提高（后熟作用），隨著品質(zhì)的提高，價值也就得到提升。好的普洱茶具有飲用和收藏的雙重功能，即普洱茶除了具有飲料的屬性外，它還有收藏的價值。受“普洱茶越陳越香”的影響，眾多喜愛普洱茶的人收藏普洱茶，并希望通過倉儲提升品質(zhì)，作為商品可以升值，作為個人消費可以享受陳年普洱的獨特陳韻。由此可見，控制倉儲條件對形成優(yōu)質(zhì)普洱茶尤其重要。

4 結(jié)論

（1）接種黃曲霉菌株YM 31882及未接種菌株的曬青毛茶、普洱散茶（熟）、普洱緊壓茶（生、熟），分別置于室溫，相對濕度80%、溫度30℃，相對濕度90%、溫度30℃ 3種條件下進(jìn)行倉儲，接種黃曲霉菌株YM 31882的茶樣均已生長黃曲霉孢子，未接種黃曲霉菌株的茶樣也已經(jīng)霉變。說明高溫高濕條件下倉儲普洱茶，會導(dǎo)致普洱茶霉變。

（2）存放第7、14、21、28天的茶樣取樣進(jìn)行黃曲霉毒素檢測，結(jié)果未檢測到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，檢出率為0。說明普洱茶即使在室溫或者高溫高濕倉儲條件發(fā)生霉變，但也不會產(chǎn)生具有致癌毒性的黃曲霉毒素，在這一點上普洱茶具有較高的飲用安全性。但實驗只檢測了黃曲霉毒素，對高溫高濕條件下是否有其他有毒物質(zhì)產(chǎn)生還有待進(jìn)一步研究和驗證。

[1]Piekkola S, Tumer P C, Aadel-Hamid M, et al. Characterisation of aflatoxin and deoxynivalenol exposure among pregnant Egyptian women [J]. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment, 2012, 29(6): 962-971.

[2]孫建和, 陸蘋, 顧紅香, 等. 真菌毒素的微生物脫毒技術(shù)[J]. 微生物學(xué)通報, 2003, 30(1): 60-63.

[3]孟昭赫, 張國柱, 宋圃菊, 等. 真菌毒素研究進(jìn)展[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1979: 14-18.

[4]Calvo A M, Wilson R A, Bok J W, et al. Relationship between secondary metabolism and fungal development [J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002, 66(3): 447-459.

[5]劉暢. 益生菌對黃曲霉毒素 B1的吸附作用的研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2010: 13-15.

[6]蔡新, 張理珉，楊善禧, 等. GB/T 22111—2008 地理標(biāo)志產(chǎn)品 普洱茶[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008: 2.

[7]孫璐西. 普洱茶模擬渥堆試驗接種黃曲菌之研究[A]. 中國茶葉學(xué)會第三屆海峽兩岸茶葉學(xué)術(shù)研討會論文集. 杭州: 中國茶葉學(xué)會, 2003: 352-357.

[8]李亞莉, 康冠宏, 楊麗源, 等. 普洱茶發(fā)酵過程中外源接種黃曲霉產(chǎn)毒研究[J]. 茶葉科學(xué), 2014, 34(5): 435-441.

[9]徐丹, 石偉力, 宋宏新, 等. 茶多酚對黃曲霉生長及產(chǎn)毒能力的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2014, 40(12): 20-24.

[10]徐丹, 孫秀蘭, 李永仙, 等. 黑曲霉對黃曲霉生長、產(chǎn)毒及黃曲霉毒素 B1的影響[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2011, 23(6): 490-494.

[11]陳建玲, 李文學(xué), 楊光宇, 等. 廣州某茶葉市場普洱茶中多種生物毒素污染現(xiàn)狀調(diào)查[J]. 癌變·畸變·突變, 2011, 23(1): 68-71.

[12]許艷麗. 產(chǎn)黃曲霉毒素菌株的檢測方法及產(chǎn)毒條件的研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2008: 19-26.

[13]李浩, 譚英智, 陳柱濤, 等. 云南大葉種曬青毛茶提取物對產(chǎn)毒黃曲霉生長及產(chǎn)毒的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(11): 101-106.

[14]龔加順, 周紅杰. 云南普洱茶化學(xué)[M]. 昆明: 云南科技出版社, 2010: 49.

[15]盧添林, 黃夢姣, 程悅, 等. 普洱茶水提物體外抑菌效果研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2015, 42(2): 313-315.

[16]吳清華. 茶葉中抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的組分及相關(guān)特性研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2013: 19.

[17]李浩. 云南大葉種曬青毛茶提取物對產(chǎn)毒黃曲霉生長及產(chǎn)毒的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 3(11): 101-106.

Study on the Safety of Pu-erh Tea Contaminated by Exogenous Aspergillus flavus

LI Yali, XING Qianqian, TU Qing, ZHOU Hongjie*

Pu-erh Tea College, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

Yunnan Pu-erh tea was used as experimental material. Aspergillus flavus strains YM31882 were inoculated into Pu-erh tea, and the Pu-erh tea un-inoculated by strains was taken as the control. The storage conditions were (1) temperature 30℃, humidity 90%. (2) temperature 30℃, humidity 90% and (3) room temperature. The tea samples were storage for 7, 14, 21and 28 days respectively and then collected for yellow aspergillus toxin detection by LC-MS / MS. The results showed that none of the aflatoxin B1, B2, G1, G2 was detected in tested samples. indicating that storage process could avoid Aspergillus flavus contamination in Pu-erh tea, In summary, Pu-erh tea is safe to drink in this field.

Pu-erh tea, Aspergillus flavus, aflatoxin, safety

TS272.5+4；Q949.32

A

1000-369X（2017）05-513-10

2017-03-18

2017-05-23

國家自然科學(xué)基金項目（31460215）、云嶺產(chǎn)業(yè)技術(shù)領(lǐng)軍人才（發(fā)改委[2014]1782）

李亞莉，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事普洱茶加工和綜合利用研究。*通訊作者：1051195348@qq.com