茶樹磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CsPT4的克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析

辛華洪，王偉東，王明樂，馬青平，甘玉迪，黎星輝

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095

茶樹磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CsPT4的克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析

辛華洪，王偉東，王明樂，馬青平，甘玉迪，黎星輝*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095

茶園中磷肥的利用效率取決于茶樹體內(nèi)與磷元素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及生理利用等相關(guān)蛋白的協(xié)同調(diào)控，而磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Phosphate transporter proteins，Phts）在此過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。本研究以茶樹品種龍井長葉（Camellia sinensis cv. Longjing-changye）為試驗(yàn)材料，采用同源克隆的方法首次克隆獲得茶樹磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因CsPht1:4（CsPT4）的全長cDNA。該基因全長1 642 bp，開放閱讀框（ORF）1 620 bp（GenBank登錄號：KY132100），編碼539個氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，CsPT4基因編碼蛋白分子量為59.12 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.51；具有典型的 Pht1家族特性：“6-親水-6”跨膜結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，該蛋白分布于質(zhì)膜上，與Softberry軟件預(yù)測結(jié)果一致。熒光定量PCR表明：CsPT4在正常生長的茶樹根、莖、嫩葉、老葉中均有表達(dá)，在老葉中的表達(dá)量較高，在根部表達(dá)量最低。低磷處理，根和葉中 CsPT4上調(diào)表達(dá)水平均先上升后下降；根部CsPT4表達(dá)量48 h內(nèi)各個時間點(diǎn)均高于葉部。缺磷處理，根和葉中CsPT4上調(diào)表達(dá)水平均升高；根部和葉部分別在72 h和48 h達(dá)最大值。本研究為茶樹響應(yīng)低磷的分子機(jī)制提供了參考。

茶樹；磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；基因克隆；亞細(xì)胞定位；表達(dá)分析

磷是植物生長發(fā)育所必需的元素之一，是ATP、磷脂和核酸等許多代謝物和大分子的重要組分，同時又參與植物體內(nèi)多種生物化學(xué)途徑，如基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[1-2]。然而磷在土壤中極易被吸附和固定，使得土壤中有效磷的濃度很低而難以滿足植物的吸收利用，因而土壤中有效磷缺乏成為限制作物產(chǎn)量的重要因素[3-4]。研究表明，植物對磷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)是一個逆濃度梯度的主動運(yùn)輸過程，這一過程主要依靠磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實(shí)現(xiàn)[3,5]。植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白根據(jù)其功能特征分為Pht1、Pht2、Pht3、Pho1和Pho2五大家族，其中Pht1家族主要成員在植物根系細(xì)胞膜中負(fù)責(zé)磷酸根的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)，其表達(dá)受磷調(diào)控[6-8]，因此Pht1家族成為研究的熱點(diǎn)，也是研究得最為深入的植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。近年利用 Pht1家族的保守性，分別從煙草[9-10]、擬南芥[11-12]、水稻[13-14]、大麥[3]、玉米[4]、油菜[15]、大豆[16]、菊花[17]、油茶[18-19]等植物中克隆到多個屬于 Pht1家族的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。

茶樹[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]主要種植于濕潤、半濕潤的熱帶、亞熱帶和溫帶的酸性土壤中，茶園缺磷的現(xiàn)象普遍存在，為了提高茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量，每年不得不施入大量的磷肥[20-21]。缺磷導(dǎo)致茶葉水浸出物、茶多酚、類黃酮、總游離氨基酸、茶氨酸等內(nèi)含成分含量下降，從而降低了茶葉品質(zhì)[22]。目前茶樹磷的研究比較廣泛，但關(guān)于茶樹應(yīng)答低磷脅迫的研究比較少。迄今關(guān)于茶樹磷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的研究尚未見報道。研究茶樹Pht1基因?qū)μ剿鞑铇淞酌{迫分子響應(yīng)機(jī)制及提高磷利用效率具有重要意義。本研究以龍井長葉兩年生水培苗為試材，通過對茶樹磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Pht1家族基因 CsPht1:4（以下簡稱CsPT4）的分離克隆、亞細(xì)胞定位和該基因在根系中表達(dá)情況進(jìn)行分析，為探索茶樹磷脅迫分子響應(yīng)機(jī)制、磷高效種質(zhì)資源篩選，以及分子育種提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌種與試劑

2015年9 月至2016年3月，以茶樹品種龍井長葉（Camellia sinensis cv. Longjing changye）為試驗(yàn)材料。于2015年9月15日取正常生長的茶樹的根、莖、老葉、嫩葉、芽。低磷、缺磷處理前選取長勢一致的茶苗于光照培養(yǎng)箱中（晝夜溫度25℃/22℃，光周期12 h晝/12 h夜，光照強(qiáng)度 240 μmol·m-2·s-1，相對濕度 75%～80%）進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)至長出新根，完全營養(yǎng)液的配方組分參考 Wan等[23]，包括大量元素 NH4+-N 0.75 mmol·L-1、NO3-N 0.25 mmol·L-1、K 0.35 mmol·L-1、P 0.05 mmol·L-1、Ca 0.395 mmol·L-1、Mg 0.21 mmol·L-1、Al 0.25 mmol·L-1和微量元素Mo 0.17 μmol·L-1、B 3.33 μmol·L-1、Fe 2.10 μmol·L-1、Mn 0.5 μmol·L-1、Cu 0.13 μmol·L-1、Zn 0.51 μmol·L-1。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和模擬土壤有效磷濃度 1～2 μmol·L-1[24-25]在2016年1月10日對水培茶苗進(jìn)行正常磷（50 μmol·L-1）、低磷（1 μmol·L-1）、缺磷處理，并分別于0、6、12、24、48、72 h取新長出的根、老根和當(dāng)年生第一成熟葉片。所采樣品立即投入液氮，－80℃保存?zhèn)溆?。取處?個月后的根（新根、老根）、莖、葉用于測定總磷濃度。

亞細(xì)胞定位載體pJIT166-GFP和大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；rTaq聚合酶、pMD?-T5 Zero Cloning Vector、pMD?19-T Vector、dNTPs、DL2000 M arker、HindⅢ酶、XbaⅠ酶、熒光定量染料SYBR?GreenⅠ、T4 DNA連接酶、TdT、dCTP、RNA酶抑制劑、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）等均購自TaKaRa公司；pMD?-T5 Zero Cloning Vector、Blunt simple Vector、Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞購于南京百斯凱科技有限公司；多糖多酚RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物，E. Z. N. A.TM Gel Extraction Kit D2500-02、Plasm id M ini Kit II購自O(shè)MEGA。所有引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其編號及序列見表1。

表1 基因克隆和定量PCR引物Table 1 Primers used for cloning and RT-PCR of CsPT4

1.2 磷濃度測定

樣品于75℃烘干至恒重，磷含量測定參照電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）[26]。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，利用Duncan’s新復(fù)極差法做顯著性分析（P＜0.05）。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

取保存實(shí)驗(yàn)材料，用多糖多酚RNA提取試劑盒提取總RNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA的完整性后，用 Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent, USA）檢測總RNA的質(zhì)量，用NanoD rop ND-1000 spectrophotometer（NanoDrop, Wilm ington, DE）檢測總RNA的濃度。根據(jù)Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 茶樹CsPT4基因克隆

根據(jù)已在NCBI公布的油茶（GenBank: AHL44892.1）；大豆（GenBank: AEA 76640.1）、菊花（GenBank:AGK29560.1）、胡蘿卜（ GenBank:XP_017224754.1）、 擬 南 芥（GenBank：NM_001203533.1）、毛果楊（GenBank:XM_002312553.2）、 玉 米（GenBank: NM_001111799.1）磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列中的保守區(qū)，利用Primer Prem ier 5.0軟件設(shè)計(jì)簡并引物PT4-Degenerate primer-F和PT4-Degenerate primer-R。以cDNA為模板擴(kuò)增出的產(chǎn)物連接到 pMD?-T5 Zero Cloning Vector上并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，進(jìn)行菌落 PCR篩選，挑選陽性克隆進(jìn)行測序，普通PCR擴(kuò)增程序參照趙真等[27]。在獲得的片段序列上設(shè)計(jì)3'RACE和5'RACE的巢式擴(kuò)增引物，參照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，美國）改進(jìn)步驟進(jìn)行 5'RACE和3'RACE。根據(jù)RACE得到的序列信息，拼接后設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長cDNA序列，cDNA全長采用高保真酶 PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥杖L cDNA擴(kuò)增片段，與Blunt simple Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，LB/Amp平板培養(yǎng)，挑選單菌落震蕩培養(yǎng)14 h，取1 μL菌液為模板，用載體通用引物M13F和M13R進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定的陽性克隆樣品測序。

1.5 CsPT4基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI BLAST對測序結(jié)果進(jìn)行檢索比對，DNAMAN6.0軟件分析酸堿氨基酸統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用ProtParam tool（http：//web.expasy. org/protparam）計(jì)算蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)；ProtScale Sever（http://web.expasy. org/protscale）采用 Hphob/Doolittle的方法對CsPT4蛋白的親水/疏水性進(jìn)行分析；使用MHMM（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；采用 NetPhos Sever 3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）程序?qū)Φ鞍仔蛄兄械闹饕被釟埢赡艿牧姿峄稽c(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。利用在線軟件 Softberry（http://www.softberry.com/berry.phtml）[28]進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.6 CsPT4基因的亞細(xì)胞定位

以測序 CsPT4全長正確的菌液，提取質(zhì)粒作為模板，以vector primer-HindⅢ、vector primer-XbaⅠ為F、R引物進(jìn)行RT-PCR，將正確的亮帶進(jìn)行膠回收，與平末端載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，挑單克隆進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的菌液提取質(zhì)粒與pJIT166-GFP分別經(jīng)XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，回收目的片段并用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pJIT166-GFP/CsPT4融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入DH5α，經(jīng)PCR、酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。金粉子彈的制備和轟擊洋蔥表皮細(xì)胞參照王明樂等[29]和Wang等[30]的方法。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR

使用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄后按照 SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RnaseH Plus）使用說明進(jìn)行熒光定量 PCR。為了研究基因 CsPT4在茶樹正常生長情況下芽、葉（老葉和嫩葉）、根、莖中的表達(dá)情況，提取了芽、嫩葉、老葉、莖、根的總 RNA，將提取的 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以茶樹 β-actin基因（Accession No. HQ420251）[31]作為內(nèi)參基因，使用 IQ5 multicolor real time PCR detection system（Bio-Rad, USA）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，采用 2–ΔΔCT算法[32]分析結(jié)果。為了研究基因 CsPT4在低磷和缺磷處理下根部和葉部的表達(dá)情況，將在完全營養(yǎng)液下水培好的新根苗進(jìn)行低磷處理（1 μmol·L-1）、缺磷處理。CsPT4基因在茶樹中的表達(dá)受低磷、缺磷誘導(dǎo)，為了研究該基因在不同誘導(dǎo)時間的表達(dá)情況，分別提取了經(jīng)過低磷、缺磷處理 0、6、12、24、48、72 h等不同時間的根部和葉部的 RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測分析。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，利用 Duncan's新復(fù)極差法做顯著性分析(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷水平對茶樹磷濃度的影響

茶樹在水培液正常生長3個月后，進(jìn)行低磷（1 μmol·L-1）、缺磷處理3個月，結(jié)果表明，低磷、缺磷處理顯著降低了茶樹根、莖、葉中的磷濃度，新根的總磷含量高于老根（圖1）。

圖1 低缺磷處理對茶樹磷濃度的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05）Fig. 1 Effects of different P treatments on P concentrations in tea plants (Mean±SD, P＜0.05)

2.2 CsPT4基因克隆與序列分析

在 NCBI中下載并比較不同植物同一家族的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，獲得592 bp的片段（圖2-A）。利用 5′RACE和 3′RACE得到的序列進(jìn)行拼接后設(shè)計(jì)全長引物進(jìn)行cDNA編碼區(qū)全長的特異擴(kuò)增，克隆后測序結(jié)果表明，該條帶長度1 642 bp（圖2-D）。該基因編碼539個氨基酸，長度與其他物種同家族的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相近。

圖2 基因克隆電泳圖Fig. 2 Electrophoresis results of CsPT4 cloning

2.3 CsPT4生物信息學(xué)分析

2.3.1 CsPT4的進(jìn)化分析

ORF分析表明，CsPT4基因含有1 617 bp的開放閱讀框，編碼 539個氨基酸（圖 3），其中酸性氨基酸65個，堿性氨基酸50個，中性氨基酸424個。同源比對發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列 與 油 茶 （ AHL44892.1）、 芝 麻（XP_011073523.1）、菊花（AGK29560.1）、胡 蘿 卜 （ XP_017224754.1）、 可 可（XP_007035103.2）的同源性大多在 70%以上；其中與油茶和芝麻的一致性達(dá)到 92%和83%。利用 ProtParam tool分析發(fā)現(xiàn)，CsPT4蛋白理論等電點(diǎn)（pI）為：8.51，分子式為C2737H4166N672O731S29，分子量為59.12 kDa。

圖3 CsPT4與其他植物的Pht1磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸多序列比對Fig. 3 Alignment of amino acid sequence of CsPT4 with some selected Pht1 proteins in plants

2.3.2 CsPT4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析以及磷酸化修飾預(yù)測

ProtScale Sever在線分析整個蛋白質(zhì)基本上表現(xiàn)出疏水性。HMMTOP對CsPT4進(jìn)行的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖4-A）顯示：CsPT4具有12個跨膜域，預(yù)測結(jié)果與報道的其他物種Pht1跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)一致[2]。磷酸化修飾預(yù)測發(fā)現(xiàn)整個蛋白質(zhì)多肽鏈中分值大于 0.5的氨基酸位點(diǎn)共有19個，且非均勻分布在整個多肽鏈中，其中10個絲氨酸殘基（Ser）可能發(fā)生磷酸化，分別位于肽鏈的第99、122、153、163、193、206、282、439、510、515個位點(diǎn)；4個蘇氨酸殘基（Thr）可能發(fā)生磷酸化，分別位于肽鏈的第58、229、239、398個位點(diǎn)；5個絡(luò)氨酸殘基（Tyr）可能發(fā)生磷酸化，分別位于肽鏈的第37、155、194、199、231個位點(diǎn)（圖4-B）。

圖4 CsPT4的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測（A）和磷酸化預(yù)測（B）Fig. 4 The prediction of CsPT4 transmembrane domains (A) and phosphorylation (B)

2.4 CsPT4蛋白的亞細(xì)胞定位

基因槍轟擊洋蔥表皮后25℃暗培養(yǎng)18 h，利用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM780）對綠色熒光蛋白信號進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)pJIT166-GFP空載體的洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)布滿了綠色熒光（圖 5-A），而轉(zhuǎn)pJIT166-GFP/CsPT4載體的洋蔥細(xì)胞內(nèi)只有細(xì)胞質(zhì)膜上有綠色熒光信號（圖 5-B），說明CsPT4蛋白定位于質(zhì)膜。

圖5 GFP蛋白（A）和CsPT4蛋白（B）在洋蔥表皮中的定位Fig. 5 Subcellular localization of GFP protein (A) and CsPT4 protein (B) in onion epidermal cells

2.5 CsPT4基因的組織特異性表達(dá)分析

熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)CsPT4在茶樹的芽、嫩葉、老葉、莖、根中均有表達(dá)；表達(dá)量由高到低依次為：老葉、嫩葉、芽、莖、根，在老葉中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量最低；隨著葉齡增加，表達(dá)量呈上升趨勢（圖6）。

圖6 CsPT4基因在茶樹不同組織的表達(dá)情況（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05）Fig. 6 Relative transcription level of CsPT4 gene in different tissues (Mean±SD, P＜0.05)

2.6 CsPT4基因在不同磷水平條件下的差異表達(dá)分析

低磷（1 μmol·L-1）處理茶樹后（設(shè)未處理的表達(dá)量為 1，下同），與對照相比，根部和葉部 CsPT4表達(dá)水平均先上升后下降，根部在12 h達(dá)到最大值（圖7-A）；葉部6 h即達(dá)到最大值（圖7-B）；根部CsPT4表達(dá)量48 h內(nèi)各個時間點(diǎn)均高于葉部。缺磷處理，與對照相比，根和葉 CsPT4表達(dá)水平基本呈上升趨勢。根部在72 h達(dá)最大值（圖7-C），葉部至48 h達(dá)最大值（圖7-D）。

3 討論

植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中 Pht1家族主要成員在植物根系細(xì)胞膜中負(fù)責(zé)磷酸根的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)，其表達(dá)受磷調(diào)控[33-34]，因此 Pht1成為研究的熱點(diǎn)也是研究得最為深入的植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。本研究利用該家族的保守性并結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE），首次從茶樹中克隆到磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 CsPT4。發(fā)現(xiàn) CsPT4編碼的氨基酸序列與油茶、芝麻等高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似性高達(dá)80%以上，并含有Pht1家族蛋白的主要特點(diǎn)：位于質(zhì)膜上，蛋白大小約59 kDa，含539個氨基酸殘基；預(yù)測保守結(jié)構(gòu)為“6-親水-6”結(jié)構(gòu)，即包括6個N端的跨膜區(qū)和6個 C端的跨膜區(qū)，中部由 1個親水環(huán)分隔開；家族保守序列GGDYPLSATIMSE位于第 4個跨膜域。同時，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，CsPT4所在的亞家族Ⅰ磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大部分已通過酵母突變體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，證明為高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如 AtPht1:4[11]、CmPT1[16]等。因此，可以推測 CsPT4為茶樹的高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。

Pht1家族基因表達(dá)受磷濃度調(diào)控[33]?，F(xiàn)有報道在模式植物中 Pht1家族基因主要在根部接收低磷信號上調(diào)表達(dá)[34]，而通過熒光定量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) CsPT4在茶樹正常生長的芽、嫩葉、老葉、莖、根中均有表達(dá)，在老葉中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量最低；這與擬南芥[11]、水稻[13]等物種的主要表達(dá)于根部不同。可能因?yàn)榱资强梢苿拥臓I養(yǎng)元素，又因?yàn)椴铇涫嵌嗄晟颈局参铮茰y正常生長情況下茶樹老葉中的磷轉(zhuǎn)移到幼嫩葉部而出現(xiàn)低磷狀態(tài)，從而高表達(dá)了CsPT4基因。在低磷和缺磷處理下，不管是茶樹根部還是葉部 CsPT4都上調(diào)表達(dá)了，說明了 CsPT4是受低磷脅迫響應(yīng)的正調(diào)控誘導(dǎo)型基因，具有Pht1家族基因表達(dá)特點(diǎn)，這與轉(zhuǎn) AtPht1:4基因擬南芥的結(jié)果一致[11]。在低磷處理下，根部上調(diào)表達(dá)高于葉部，說明CsPT4主要在根部表達(dá)，這與其他物種的Pht1基因表達(dá)一致[34]；上調(diào)表達(dá)出現(xiàn)先上升后下降可能是由于CsPT4轉(zhuǎn)錄的mRNA的累積效應(yīng)。本研究雖然從茶樹中克隆到CsPT4基因，但是茶樹 Pht1基因家族成員的數(shù)量及功能仍然有待驗(yàn)證。

圖7 CsPT4在不同磷水平條件下的表達(dá)分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05）Fig. 7 Expression analysis of CsPT4 under different P treatments (Mean±SD, P＜0.05)

[1]Liu J, Yang L, Luan M, et al. A vacuolar phosphate transporter essential for phosphate homeostasis in Arabidopsis [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112(47): E6571-E6578.

[2]Rausch C, Bucher M. Molecular mechanisms of phosphate transport in plants [J]. Planta, 2002, 216(1): 23-37.

[3]Rae A L, Cybinski D H, Jarmey J M, et al. Characterization of two phosphate transporters from barley, evidence for diverse function and kinetic properties among members of the Pht1 family [J]. Plant Mol Biol, 2003, 53(1/2): 27-36.

[4]蘇順宗, 吳鋒鍇, 劉丹, 等. 一個玉米 Pht1家族磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆和功能分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報, 2013, 27(7): 885-894.

[5] Liu J, Versaw W K, Pumplin N, et al. Closely related members of the medicago truncatula PHT1 phosphate transporter gene family encode phosphate transporters with distinct biochemical activities [J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(36): 24673-24681.

[6]Catarecha P, Segura M D, Franco-zorrilla J M, et al. A mutant of the arabidopsis phosphate transporter PHT1:1 displays enhanced arsenic accumulation [J]. The Plant Cell Online, 2007, 19(3): 1123-1133.

[7]Miao J, Sun J, Liu D, et al. Characterization of the promoter of phosphate transporter TaPHT1.2, differentially expressed in wheat varieties [J]. Journal of Genetics and Genomics, 2009, 36(8): 455-466.

[8] Preuss C P, Huang C Y, Gilliham M, et al. Channel-like characteristics of the low-affinity barley phosphate transporter PHT1:6 when expressed in xenopus oocytes [J]. Plant Physiology, 2010, 152(3): 1431-1441.

[9]Park M R, Baek S, Los Reyes B G, et al. Overexpression of a high-affinity phosphate transporter gene from tobacco (NtPT1) enhances phosphate uptake and accumulation in transgenic rice plants [J]. Plant and Soil, 2007, 292(1/2): 259-269.

[10]Tan Z, Hu Y, Lin Z. Expression of NtPT5 is correlated with the degree of colonization in tobacco roots inoculated with glomus etunicatum [J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2012, 30(4): 885-893.

[11]Shin H, Shin H, Dewbre G R, et al. Phosphate transport in Arabidopsis: Pht1:1 and Pht1:4 play a major role in phosphate acquisition from both low- and high-phosphate environments [J]. The Plant Journal, 2004, 39(4): 629-642.

[12]Misson J, Thibaud M C, Bechtold N, et al. Transcriptional regulation and functional properties of Arabidopsis, Pht1;4, a high affinity transporter contributing greatly to phosphate uptake in phosphate deprived plants [J]. Plant Molecular Biology, 2004, 55(5): 727.

[13]高佳, 劉雄倫, 劉玲, 等. 水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Pht1家族研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2009, 25(15): 31-34.

[14]Ye Y, Yuan J, Chang X, et al. The phosphate transporter gene OsPht1:4 is involved in phosphate homeostasis in rice [J]. Plos One, 2015, 10(5): e126186.

[15]Ren F, Zhao C, Liu C, et al. A brassica napus PHT1 phosphate transporter, BnPht1:4, promotes phosphate uptake and affects roots architecture of transgenic arabidopsis [J]. Plant Molecular Biology, 2014, 86(6): 595-607.

[16]Song H, Yin Z, Chao M, et al. Functional properties and expression quantitative trait loci for phosphate transporter GmPT1 in soybean [J]. Plant, Cell & Environment, 2014, 37(2): 462-472.

[17]Peng L, Chen S, Song A, et al. A putative high affinity phosphate transporter, CmPT1, enhances tolerance to Pi deficiency of chrysanthemum [J]. Bmc Plant Biology, 2014, 14(1): 1-9.

[18]周俊琴, 譚曉風(fēng), 袁軍, 等. 油茶 Pht1;2的克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 生物技術(shù), 2013(1): 37-42.

[19]周俊琴, 譚曉風(fēng), 袁軍, 等. 油茶 Phtl;1基因克隆及其表達(dá)分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報, 2013, 14(3): 512-517.

[20]Akn Z, Loganathan P, Hedley M J. Phosphorus utilisation efficiency and depletion of phosphate fractions in the rhizosphere of three tea (Camellia sinensis L.) clones [J]. Nutrient Cycling in Agroecosystems, 1999, 53(2): 189-201.

[21]Salehi S Y, Hajiboland R. A high internal phosphorus use efficiency in tea (Camellia sinensis L.) plants [J]. Asian Journal of Plant Sciences, 2008, 7(1): 30-36.

[22]Lin Z, Qi Y, Chen R, et al. Effects of phosphorus supply on the quality of green tea [J]. Food Chemistry, 2012, 130(4): 908-914.

[23]Wan Q, Xu RK, Li XH. Proton release by tea plant (Camellia sinensis L.) roots as affected by nutrient solution concentration and pH [J]. Plant Soil Environ, 2012, 58(9): 429-434

[24]Raghothama K G. Phosphate acquisition [J]. Annual Review of Plant Biology, 1999, 50(1): 665-693.

[25]Schachtman D P, Reid R J, Ayling S M. Phosphorus uptake by plants: from soil to cell [J]. Plant Physiology, 1998, 116(2): 447-453.

[26]何飛頂, 李華昌, 馮先進(jìn). 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)測定紅土鎳礦中的Cd、Co、Cu、Mg、Mn、Ni、Pb、Zn、Ca 9種元素[J]. 中國無機(jī)分析化學(xué), 2011, 1(2): 39-41.

[27]趙真, 陳暄, 王明樂, 等. 茶樹磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子基因 CsPPT的克隆與表達(dá)分析[J]. 茶葉科學(xué), 2015, 35(5): 491-500.

[28]楊亦揚(yáng), 胡雲(yún)飛, 萬青, 等. 茶樹硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NRT1.1基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 茶葉科學(xué), 2016, 36(5): 505-512.

[29]王明樂, 王偉東, 趙真, 等. 茶樹NADPH氧化酶基因的克隆、亞細(xì)胞定位與表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報, 2015, 42(1): 95-103.

[30]Wang W, Wang Y, Du Y, et al. Overexpression of Camellia sinensis H1 histone gene confers abiotic stress tolerance in transgenic tobacco [J]. Plant Cell Reports, 2014, 33(11): 1829-1841.

[31]孫美蓮, 王云生, 楊冬青, 等. 茶樹實(shí)時熒光定量 PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 植物學(xué)報, 2010, 45(5): 579-587.

[32]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCTmethod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[33]李慧, 叢郁, 常有宏, 等. 豆梨磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因(PcPht1)的克隆、表達(dá)及啟動子分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2013, 29(4): 842-850.

[34]楊存義, 劉靈, 沈宏, 等. 植物 Pht1家族磷轉(zhuǎn)運(yùn)子的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種, 2006, 4(2): 153-159.

Molecular Cloning, Subcellular Localization and Expression Analysis of CsPT4 Gene in Tea Plant (Camellia sinensis)

XIN Huahong, WANG Weidong, WANG Mingle, MA Qingping, GAN Yudi, LI Xinghui*

Tea Research Institute，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095, China

Phosphate transporter proteins (Phts) play important roles in plant phosphorus (P) absorption and transportation. Furthermore, Phts affect usage efficiency of the tea garden fertilizer. A full-length phosphate transporter complementary DNA (cDNA) CsPht1:4 (also named CsPT4) was cloned from tea plant (Camellia sinensis cv. Longjingchangye) by rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques. CsPT4 had an open reading frame of 1 620 bp (GenBank accession No. KY132100) and encoded a 539 amino acid polypeptide. Bioinformatic analyses showed that CsPT4 had a molecular weight of 59.12 kD and a theoretical isoelectric point of 8.51. The protein secondary structure was a “6+Hydrophilic+6” configuration,which was consistent with the typical structure of Phts. Subcellular localization assay showed that the CsPT4 protein localized in plasma membrane, which was consistent with the predicted results of Softberry. The expression pattern of CsPT4 gene was tissue-specific. Its transcript abundance in old leaves was much higher than that in tender leaves, stems and roots. The lowest expressionof CsPT4 gene was identified in roots. Quantitative real-time PCR showed that the gene expression trends in root and leaves were different under low-P and P-deficiency treatments. Under low-P treatment, its induced level was first increased and then decreased, with higher expression in roots than leaves. While under P-deficiency treatment, the induced expression of CsPT4 gene kept stable, with its peak in roots and leaves at 72 h and 48 h, respectively. The results of this study provided a reference for the study of the molecular mechanism of tea adaptation to low P.

tea plant (Camellia sinensis), phosphate transporter protein, gene cloning, subcellular localization, expression analysis

S571.1；Q51

A

1000-369X(2017)05-493-10

2017-04-05

2017-05-02

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-23）、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金（31570691）、江蘇省科技支撐計(jì)劃（BE2009313-1）

辛華洪，男，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種和茶葉生化研究。*通訊作者：lxh@njau.edu.cn