陸地棉PPO基因全基因組鑒定及對(duì)黃萎病菌的響應(yīng)分析

張慧，田新權(quán)，高巍，蔡應(yīng)繁，龍璐

陸地棉PPO基因全基因組鑒定及對(duì)黃萎病菌的響應(yīng)分析

張慧，田新權(quán)，高巍，蔡應(yīng)繁，龍璐*

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開(kāi)封475004）

【目的】多酚氧化酶（Polyphenol oxidases，PPO）廣泛參與植物抵抗病蟲害等生物逆境脅迫的過(guò)程。本研究旨在研究棉花中的PPO基因及其表達(dá)模式，驗(yàn)證多酚氧化酶與棉花抗黃萎病的關(guān)系?！痉椒ā糠治隽它S萎病菌V991侵染下異源四倍體陸地棉TM-1根系中PPO酶活力變化，并利用TM-1的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定相關(guān)基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)分析?！窘Y(jié)果】共篩選到13個(gè)候選GhPPO基因。這些基因都不含內(nèi)含子，所編碼的蛋白包含2個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)和PPO的保守序列（酪氨酸酶、DWL和KFDV保守結(jié)構(gòu)域）。進(jìn)化分析顯示，陸地棉PPO基因的種內(nèi)相似性大于種間相似性，并且相互之間形成了多對(duì)重復(fù)基因。GhPPO的表達(dá)量差異較大，少數(shù)基因具有組織特異表達(dá)的特性，多數(shù)基因在棉花不同組織中表達(dá)量都很低。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析結(jié)果表明：GhPPO6D在棉花根系中表達(dá)量較高，且在黃萎病菌V991侵染后上調(diào)?！窘Y(jié)論】GhPPO6D可能參與了棉花與黃萎病菌的互作過(guò)程，與V991侵染后棉花根系PPO酶活力上升相關(guān)。

陸地棉；多酚氧化酶；基因家族；黃萎??；生物信息學(xué)分析

Abstract:[Objective]Polyphenol oxidases(PPOs)areubiquitous among plants and have been shown to be involved in defense responses to biotic stresses,such as pathogens and insects.The aim of this study was to verify PPO genes and their expression patternsin upland cotton and determine therelationship between PPOand cotton resistance to Verticillium dahliae.[Method]We analyzed changes in PPO activity in allotetraploid cotton TM-1 roots after V991 (V.dahliae)inoculation,and isolated related genes from the TM-1 genome database.Bioinformatics and expression analysis were used to characterize the isolated genes.[Result]13 putative PPO genes were isolated,all of which were intron-free and encoded proteins containing two copper ion binding sites and conserved PPOdomains(tyrosinase,DWL and KFDV domain).Phylogenetic analysis revealed that there was greater genetic diversity in PPO genes within species than between species.GhPPO genes were duplicated,most of which were lowly expressed in all tissues examined,only a few showed tissue-specific expression in different organs.Quantitative real-time polymerase chain reaction showed that GhPPO6D was highly expressed in cotton roots and induced by V.dahliae inoculation.[Conclusion]These results indicated that GhPPO6D may participate in the interaction between cotton and V.dahliae and could beresponsible for the up-regulation of PPOactivity after V991 infection.

Keywords:Gossypium hirsutum;polyphenol oxidase;gene family;Verticillium dahliae;bioinformaticsanalysis

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是廣泛存在于植物、昆蟲和真菌中的金屬蛋白酶，具有2個(gè)銅離子結(jié)合域，能與二價(jià)銅離子結(jié)合，通過(guò)氧化作用催化酚類化合物形成醌類物質(zhì)[1]。植物中的PPO存在于各組織和器官，是植物受到損傷等刺激后酶促褐變的主要原因。已有的研究表明，PPO作為1種重要的防御酶類，參與了多種植物抵抗病蟲害等逆境脅迫的過(guò)程[2]。

植物在受到病原菌侵染或昆蟲取食時(shí)，PPO的表達(dá)和活力受到誘導(dǎo)上升，通過(guò)多種途徑增強(qiáng)植物對(duì)病蟲害的防御反應(yīng)。馬鈴薯野生種Solanum berthaultii的腺體中含有大量PPO，遭受脅迫時(shí)PPO快速催化酚類化合物的氧化聚合作用，產(chǎn)生褐色的黏性聚合物限制昆蟲的取食和病原菌的擴(kuò)散[3]。PPO還能通過(guò)其產(chǎn)生的醌類共價(jià)結(jié)合修飾親核氨基酸，降低植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)作用，發(fā)揮抗脅迫功能[4]。此外，PPO的上調(diào)還伴隨著其他一些脅迫誘導(dǎo)的抗性蛋白的增加，醌類物質(zhì)對(duì)昆蟲和病原菌也具有直接毒害作用[5]。

PPO具有多基因家族的特性，由多個(gè)基因編碼[2,6-7]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，植物PPO基因被逐漸分離和克隆。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)操縱PPO基因的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的活力，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)植物抗病、抗蟲能力的提高。2002年Li等在番茄中異源表達(dá)了1個(gè)馬鈴薯PPO基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)PO酶活力提高了5～10倍，增強(qiáng)了對(duì)假單胞菌的抗性，證明單個(gè)PPO基因能影響植物對(duì)病原菌的抵抗能力[8]；反之，轉(zhuǎn)入馬鈴薯PPO反義鏈能抑制蕃茄中所有PPO基因的表達(dá)，同時(shí)顯著降低蕃茄的抗病性[9]。干涉蒲公英中PPO-2基因，植株對(duì)假單胞菌的抗性減弱，在擬南芥中異源表達(dá)該基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗病性[10]。番茄中PPO的酶活力與害蟲的體質(zhì)量和取食量呈負(fù)相關(guān)，超表達(dá)PPO基因的蕃茄抑制了斜紋夜蛾幼蟲的生長(zhǎng)并降低了其存活率[11]。超表達(dá)PtdPPO1基因的楊樹(shù)對(duì)食草性森林天幕毛蟲 （Malacosoma disstria）的抗性增強(qiáng)，用其樹(shù)葉飼養(yǎng)的天幕毛蟲幼蟲死亡率高，平均體質(zhì)量增幅相比對(duì)照組較小[12]。

早期的研究表明蟲害和病害影響了棉花中PPO的酶活力[13-14]。但目前對(duì)于棉花中的PPO基因研究仍然很少。朱香鎮(zhèn)等2014年從棉花綠盲蝽刺吸脅迫抑制消減雜交 （Suppression subtractive hybridization，SSH）文庫(kù)中首次克隆和分析了棉花內(nèi)源的PPO基因GhPPO1。GhPPO1表達(dá)受機(jī)械損傷誘導(dǎo)，參與棉花響應(yīng)棉鈴蟲取食的過(guò)程[15]。為了研究棉花中的PPO基因及其表達(dá)模式，本研究分析陸地棉（Gossypium hirsutum）TM-1在黃萎病菌侵染下PPO酶活力的變化；在TM-1基因組中分離到13個(gè)PPO基因，對(duì)這些PPO基因進(jìn)行了序列特征、進(jìn)化分析，并分析了這些基因在TM-1中的組織表達(dá)模式和黃萎病菌侵染下的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

陸地棉品種TM-1由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，棉花強(qiáng)致病力落葉型黃萎病菌菌系V991由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所簡(jiǎn)桂良研究員提供。

1.2 植物材料的種植和處理

將TM-1種子在水中浸泡8 h，轉(zhuǎn)移至放有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中催芽36 h。待種子胚根萌發(fā)至1.5 cm左右時(shí)，將其播種于混合營(yíng)養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土與蛭石質(zhì)量比為1∶1）中，轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱生長(zhǎng)（溫度為25℃，相對(duì)濕度為60%，光周期為光照16 h、黑暗8 h）。待棉花幼苗生長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的幼苗進(jìn)行脅迫處理。

黃萎病菌V991接種處理：將4℃保存的V991置于PDA培養(yǎng)基上，于25℃活化并繼代培養(yǎng)2次。在活化后的V991菌落邊緣，挑取約1 cm2的菌絲團(tuán)，在查氏培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)3～5 d（25℃，暗培養(yǎng)）。用雙層紗布過(guò)濾菌絲團(tuán)，所獲得的V991分生孢子懸浮液經(jīng)1000 r·min－1離心10 min，去上清液后用蒸餾水稀釋至每毫升2×105個(gè)孢子。幼苗接種采用傷根接種法[16]，以傷根后水處理作為對(duì)照組 （Mock）。處理后觀察幼苗發(fā)病情況，7 d 后照相，并分別取 0 h、1 h、6 h、12 h、24 h、72 h和120 h的根系樣品置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PPO酶活力測(cè)定

酶活力測(cè)定方法參照Sugumaran等[17]，略有改動(dòng)。取待測(cè)樣品0.2 g用液氮研磨成均勻的粉末，加入1.6 mL聚乙烯吡咯烷酮（PVP）質(zhì)量濃度為 15 g·L－1的 Tris-HCl（pH=7.5）溶液，充分混勻后吸取500μL溶液至2 mL離心管中，渦旋震蕩3 min，4 ℃、1300 r·min－1下離心 20 min， 上清液為PPO粗酶液。取200μL鄰苯二酚 （10 mmol·L－1）至酶標(biāo)板中，加入15μL粗酶液混勻，于室溫反應(yīng)30 min，測(cè)定反應(yīng)前后398 nm處的吸光值，每變化0.01為1個(gè)酶活力單位。酶活力測(cè)定共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置5個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.4 PPO基因家族的鑒定和生物信息學(xué)分析

本研究中棉花PPO序列信息來(lái)源于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)公布的TM-1基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[18]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從NCBI網(wǎng)站上下載馬鈴薯（Solanum tuberosum）[7]和蒲公英（Taraxacum officinale)[6]等物種的PPO氨基酸序列，以這些序列為參考序列進(jìn)行HMM（Hidden Markov Model）建模（使用軟件為HMMER3.1，http://hmmer.janelia.org/）在陸地棉TM-1數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索候選的PPO氨基酸序列。候選PPO序列使用軟件InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro）和 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，包含酪氨酸酶、DWL和KFDV保守結(jié)構(gòu)域的候選序列為本研究中所涉及的GhPPO。

GhPPO家族成員的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量預(yù)測(cè)軟件為 ExPASy（http://web.expasy.org/compute_pi/）；內(nèi)含子預(yù)測(cè) （基因結(jié)構(gòu)分析）軟件為GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）；氨基酸多重序列比對(duì)軟件為DNAMAN；進(jìn)化分析軟件為MEGA6.0，選擇馬鈴薯和蒲公英中的PPO成員，采用鄰近法，設(shè)置1000次重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。GhPPO基因的表達(dá)模式熱圖分析軟件為Genesis。用已釋放的表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析了棉花中13個(gè)PPO基因在TM-1不同組織中的表達(dá)水平。

1.5 棉花RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）

選擇黃萎病菌V991處理12 h的根系樣品，用液氮研磨至粉末狀，進(jìn)行總RNA提取。RNA提取使用北京艾德萊公司的ESAYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒。取1μg棉花根系總RNA進(jìn)行第一鏈cDNA合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本東洋紡公司的ReverTra AceqPCRRT試劑盒。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)陸地棉PPO家族基因的表達(dá)量，以棉花泛素蛋白基因UB7（Ubiquitin 7）為內(nèi)參基因。引物設(shè)計(jì)軟件為Primer Premier 5，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增試劑為南京諾維贊公司的SYBRGreen Mater Mix試劑盒 （Q111-02），擴(kuò)增儀器為ABI7500-Fast（購(gòu)自應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó)）。每個(gè)樣品設(shè)置4次技術(shù)重復(fù)，反應(yīng)后導(dǎo)出CT值，用

法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

表1 所用引物序列Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉中PPO基因的篩選

通過(guò)HMM在TM-1的基因組中共檢索到13個(gè)可能編碼PPO蛋白的候選基因，分別記為No.1～No.13。篩選到的13個(gè)GhPPO基因中有7個(gè)定位于6號(hào)染色體上，其余6個(gè)分別分布于第2、3、9和 12號(hào)染色體。GhPPO的編碼序列（Coding sequence，CDS） 長(zhǎng)度為 1587～1800 bp，編碼528～599個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為（60.55～68.34）×103，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為 6.11～8.58。對(duì)GhPPO的CDS和基因組序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉中13個(gè)GhPPO均不含內(nèi)含子（表2）。

對(duì)13個(gè)GhPPO基因的核苷酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中12個(gè)GhPPO之間形成了共6對(duì)序列高度相似的重復(fù)基因 （Duplicated genes）。如GhA03G1718和GhD02G2150，CDS長(zhǎng)度完全一致，僅存在少量單堿基差異。因此，將這2個(gè)基因分別命名為GhPPO1A （來(lái)源于A染色體組）和GhPPO1D（來(lái)源于D染色體組）。

表2 陸地棉TM-1中預(yù)測(cè)的PPO基因Table 2 The putative PPO genes in G.hirsutum L.TM-1

2.2 GhPPO的氨基酸序列分析

用DNAMAN軟件對(duì)所篩選得到的序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TM-1中鑒定到的13個(gè)GhPPO都具有PPO_DWL、PPO_KFDV和酪氨酸酶3個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖1）。其中酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域中包含2個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)CuA和CuB，這2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)富含His殘基，能與銅離子結(jié)合形成特定的三維結(jié)構(gòu)，是PPO高度保守的活性中心[2]。

進(jìn)化樹(shù)分析顯示，陸地棉GhPPO的種內(nèi)相似性大于與馬鈴薯、蒲公英PPO的種間相似性（圖 2）。在陸地棉的 13個(gè) PPO成員中，GhP PO6A/D和GhPPO1A/D的進(jìn)化關(guān)系較近；而Gh-PPO2A/D、GhPPO3A/D、GhPPO4A/D、GhPPO5A/D和GhPPO7的進(jìn)化關(guān)系較近。其中GhPPO3A和GhPPO3D與已報(bào)道的棉鈴蟲取食誘導(dǎo)的陸地棉GhPPO1（GenBank 登錄號(hào)：JQ345705）[15]相似性分別為97.66%和99.83%，據(jù)此認(rèn)為GhPPO1和GhPPO3D是同一個(gè)基因。

2.3 GhPPO基因的組織表達(dá)模式分析

組織表達(dá)模式分析結(jié)果（圖3-A）顯示，在營(yíng)養(yǎng)器官（根、莖和真葉）和生殖器官（花萼、花托、花瓣、雄蕊和雌蕊）8個(gè)組織中，GhPPO1D和Gh-PPO6D基因在7個(gè)組織中的表達(dá)豐度較高；同源基因 GhPPO3A、GhPPO3D和 GhPPO7在 3個(gè)組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)；GhPPO1A、GhPPO4A、GhPPO5A和GhPPO5D僅在1個(gè)組織中表達(dá)豐度稍高。

PPO基因也參與了棉花纖維發(fā)育的過(guò)程。分析GhPPO在棉纖維發(fā)育－3～25 DPA（Days post anthesis）的 RPKM（Reads per kilo bases per million reads）值顯示：在13個(gè)GhPPO基因中，有9個(gè)的表達(dá)豐度一直較低，4個(gè)在纖維發(fā)育的不同時(shí)期呈現(xiàn)出較高的表達(dá)豐度。其中，GhPPO1D和GhPPO4D分別在10 DPA和20 DPA優(yōu)勢(shì)表達(dá)；GhPPO7從－3 DPA開(kāi)始上調(diào)表達(dá)，在纖維發(fā)育的前期表達(dá)豐度較高，10 DPA之后下調(diào)；GhPPO6D與GhPPO7相反，在－3 DPA和－1 DPA的纖維中表達(dá)豐度較高，開(kāi)花（0 DPA）之后迅速下降，而在纖維發(fā)育的中后期（10～25 DPA）上調(diào)表達(dá)（圖 3-B）。

圖1 陸地棉PPO 家族的氨基酸序列比對(duì)Fig. 1 Multiple sequence alignments of the cotton PPO family

圖2 陸地棉、馬鈴薯、蒲公英中PPO的進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of PPO in G.hirsutum,S.tuberosum and T.officinale

2.4 黃萎病菌侵染下陸地棉的PPO酶活力分析

如圖4所示，對(duì)照組（Mock）在傷根處理后1 h時(shí)，根系PPO酶活力呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，處理6 h后下降，在隨后的時(shí)間PPO酶活力維持在與0 h相似的水平。傷根接種黃萎病菌（V.dahliae）處理下PPO酶活力同樣在1 h后上升，6 h時(shí)下降，在12 h時(shí)再次上升達(dá)到第2個(gè)PPO酶活力峰值，之后再次下降。12 h時(shí)對(duì)照組和傷根接種黃萎病菌處理的PPO酶活力差異達(dá)到了顯著水平。

2.5 GhPPO在黃萎病菌誘導(dǎo)下的表達(dá)分析

由于序列之間的高度相似性，PCR技術(shù)不易分辨重復(fù)基因，所以本研究中擴(kuò)增的為重復(fù)基因的總和。如圖5所示，除GhPPO3A/D以外，其余基因均在棉花根系中被檢測(cè)到。其中，GhPPO1A/D、GhPPO4A/D、GhPPO5A/D 和 GhPPO7在傷根處理對(duì)照組（Mock）和傷根接種黃萎病菌（V.dahliae）處理12 h后的陸地棉根系中表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。GhPPO2A/D在傷根接種處理后表達(dá)量顯著下調(diào)，約為對(duì)照組的1/10。而根系中GhPPO6A/D的表達(dá)則被病原菌侵染激活，傷根接種黃萎病菌處理12 h時(shí)的GhPPO6A/D表達(dá)量升高至對(duì)照組的3倍。

3 討論

圖3 PPO基因在陸地棉不同器官中的表達(dá)模式熱圖Fig.3 Expression heat map of PPO genes in different organs of G.hirsutum

圖4 黃萎病菌侵染對(duì)棉花根系PPO酶活力的影響Fig.4 The effect of V.dahliae infection on PPO activity in cotton roots and enzyme activity

PPO是1種重要的防御酶，參與了植物的花色形成、光合作用和抗病蟲害的過(guò)程，并對(duì)其在各物種尤其是農(nóng)作物中的作用等進(jìn)行了深入的研究[2,19-21]。大量PPO基因的鑒定和功能分析，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和基因改良提供了可靠的理論基礎(chǔ)和候選基因[12,22-24]。到目前為止，關(guān)于棉花中PPO在植物與病原菌、害蟲之間互作的具體機(jī)制，已有部分報(bào)道。棉花的PPO被認(rèn)為參與了抗枯萎病的過(guò)程，抗病品種的PPO酶活力略高于感病品種；病原菌侵染后，抗病品種中的PPO酶活力上升速率和幅度都顯著高于感病品種[13]。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定陸地棉根系中的PPO酶活力發(fā)現(xiàn)，對(duì)比傷根處理的對(duì)照組，傷根接種黃萎病菌處理下PPO的酶活力在處理后顯著升高，表明PPO參與了棉花與黃萎病菌的互作過(guò)程。

植物中的PPO通常由多個(gè)基因編碼，筆者以馬鈴薯、蒲公英等物種的PPO氨基酸序列為參照，從異源四倍體陸地棉TM-1基因組數(shù)據(jù)中共鑒定到了13個(gè)GhPPO成員。與其他物種相比，棉花PPO的數(shù)量相對(duì)較多，且有12個(gè)成員兩兩之間形成了6對(duì)高度相似的重復(fù)基因，這一現(xiàn)象可能是由于棉花基因組的大小和基因組內(nèi)包含大量重復(fù)序列而造成的[18]。

圖5 V.dahliae處理12 h后陸地棉根系中PPO基因的表達(dá)變化Fig.5 Expression changes of PPO genes at 12 h after V.dahliae inoculation in upland cotton(G.hirsutum)roots

PPO的酶活力與基因數(shù)目之間沒(méi)有明確的關(guān)系。但是在特定的條件下，PPO基因成員中可能存在優(yōu)勢(shì)表達(dá)的單個(gè)基因，通過(guò)對(duì)單個(gè)優(yōu)勢(shì)表達(dá)的PPO基因的調(diào)控能實(shí)現(xiàn)對(duì)植物PPO酶活力的調(diào)控[25]。如蒲公英中存在5個(gè)PPO基因，只有PPO-2受病原菌誘導(dǎo)，參與抗病的過(guò)程，且干涉PPO-2能顯著降低蒲公英的抗病性[12]。本研究對(duì)棉花GhPPO基因成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)13個(gè)GhPPO基因在棉花不同組織中的表達(dá)差異非常大，只有部分基因能在棉花組織中檢測(cè)到。其中，GhPPO7僅在纖維發(fā)育－1～5 DPA有較高水平的表達(dá)，GhPPO7可能參與棉花纖維發(fā)育早期的過(guò)程；GhPPO6D在大部分組織中高量表達(dá)，如營(yíng)養(yǎng)器官、花器官和纖維中，在正常情況下，GhPPO6D可能是棉花13個(gè)GhPPO成員中的優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因。在黃萎病菌侵染的情況下，只有GhPPO2A/D和GhPPO6A/D出現(xiàn)了表達(dá)變化。GhPPO2A/D在根系中表達(dá)量很低，且在病原菌侵染后下調(diào)；相反，GhPPO6A/D受黃萎病菌誘導(dǎo)，表達(dá)量上調(diào)至對(duì)照的3倍。GhPPO6D在棉花根系中表達(dá)量較高，GhPPO6A在棉花不同組織中表達(dá)量都很低，因此在黃萎病菌處理下，棉花根系中的PPO酶活力上升可能是由GhPPO6D單個(gè)基因的表達(dá)量上升引起的，GhPPO6D可能參與了棉花與黃萎病菌互作的過(guò)程。但是GhPPO6D的具體功能以及GhPPO6D調(diào)控的PPO酶活力變化在棉花抗病中的作用還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

黃萎病菌侵染后陸地棉TM-1中根系的PPO酶活力上升。在TM-1基因組中鑒定到了13個(gè)PPO基因，其中GhPPO6D在各組織中表達(dá)量都較高，且受黃萎病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。推測(cè)GhPPO6D是陸地棉13個(gè)PPO基因中的優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因，與黃萎病菌侵染下根系PPO的酶活力變化有關(guān)，可能參與了棉花與黃萎病菌的互作過(guò)程。

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Genome-Wide Identification of PPO Gene Family Members and Their Response to Verticillium dahliae in Upland Cotton

Zhang Hui,Tian Xinquan,Gao Wei,Cai Yingfan,Long Lu*
(School of Life Science,Henan University/State Key Laboratory of Cotton Biology/Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology,Kaifeng,Henan 475004,China)

S562.035

A

1002-7807（2017）05-0428-09

10.11963/1002-7807.zhll.20170727

2016-12-01

張慧（1992－），女，碩士，zhanghui047@yeah.com。*通信作者：lulong1826@163.com

棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（CB2015A31，CB2016A23）