利用多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)6種棉花轉(zhuǎn)化體的方法研究

李憶，尹全，劉勇

利用多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)6種棉花轉(zhuǎn)化體的方法研究

李憶1#，尹全2#，劉勇3*

（1.四川民族學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)系，四川康定626001；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，成都610066；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，成都610066）

【目的】建立1種轉(zhuǎn)基因棉花多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法?！痉椒ā吭囼?yàn)選擇6種轉(zhuǎn)基因棉花作為多重PCR檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)引物終濃度配比和引物退火溫度的兩要素全組合優(yōu)化多重 PCR反應(yīng)體系，并分析方法靈敏度?！窘Y(jié)果】多重 PCR較優(yōu)的 MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLCOTTON25、MON531 引物終濃度為 0.25、0.30、0.25、0.16、0.30、0.20 μmol·L－1， 較優(yōu)引物退火溫度為56℃，方法靈敏度為66個(gè)拷貝棉花基因組。利用盲樣對(duì)上述體系的驗(yàn)證結(jié)果顯示，所有盲樣擴(kuò)增條帶與其含有的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體完全一致?！窘Y(jié)論】本研究建立的體系可用于6種棉花轉(zhuǎn)化體的快速檢測(cè)。

棉花；多重PCR；特異性引物；檢測(cè)

Abstract:[Objective]The aim of this study was to establish a multiplex polymerase chain reaction(PCR)detection method for transgenic cotton.[Method]Six events in genetically modified cotton were selected for multiplex PCR.Specific primers were designed based on national standards or related literature.The ratio of primer concentration,annealing temperature,and sensitivity of the multiplex PCRreaction system were optimized.[Result]The optimal concentrations for primers MON1445,GHB614,MON15985,MON88913,LLCOTTON25 and MON531 were 0.25,0.30,0.25,0.16,0.30,and 0.20 μmol·L－1,respectively;the optimal annealing temperature of the multiplex PCRwas 56℃;the detection sensitivity of the method was 66 copies of the cotton genome.The verification results of the system showed that the amplified bands of all the known samples were identical to those of the transgenic events.[Conclusion]The system established in thisstudy can be used for therapid detection of six events occurring in genetically modified cotton.

Keywords:cotton;multiplex PCR;specific primer;detection

棉花是較早成功實(shí)施商業(yè)化轉(zhuǎn)基因品種種植的植物之一，目前包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家如印度、美國(guó)、阿根廷和南非等均大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因棉花，且發(fā)展非常迅速[1-2]。據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（The International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2015年轉(zhuǎn)基因棉花種植面積達(dá)370萬(wàn)hm2，面積有所下降，但其采用率從2014年的93%升高到2015年的96%[3]。目前我國(guó)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因棉花均為自主研發(fā)的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉花。除種植外，我國(guó)還允許國(guó)外抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花531等9種轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)口用作加工原料[4]。

隨著轉(zhuǎn)基因棉花的廣泛種植以及大量進(jìn)口轉(zhuǎn)基因棉花用作加工原料，出于對(duì)轉(zhuǎn)基因作物安全性的考慮，我國(guó)于2002年3月20日起施行《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，要求對(duì)5類轉(zhuǎn)基因生物所涉及的17種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)，其中包括轉(zhuǎn)基因棉花種子及其產(chǎn)品[5]。因此，建立1套方便、快捷的棉花轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)是貫徹標(biāo)識(shí)制度的重要前提。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)的報(bào)道多涉及轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻及其加工產(chǎn)品[6-8]；而對(duì)于轉(zhuǎn)基因棉花的檢測(cè)研究報(bào)道則相對(duì)較少，已有研究報(bào)道主要集中在單一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)[9]，且現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)存在操作復(fù)雜、成本花費(fèi)高、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)以及無(wú)法同時(shí)檢測(cè)多種轉(zhuǎn)化體等缺點(diǎn)。

因此，多重PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)品檢測(cè)中應(yīng)運(yùn)而生。多重PCR是指在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，向1個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，針對(duì)1個(gè)或多個(gè)DNA模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)[10-11]。近年來(lái)，多重PCR技術(shù)得到了較大的發(fā)展。尹全等[12]利用多重PCR方法檢測(cè)了抗除草劑棉花LLCOTTON25，Germini等[13]建立了1個(gè)能同時(shí)區(qū)分4種轉(zhuǎn)基因玉米和1種轉(zhuǎn)基因大豆的多重PCR體系，陳貞等[14]建立了菜籽粕轉(zhuǎn)基因成分多重PCR檢測(cè)體系。多重PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)品檢測(cè)中有重要應(yīng)用價(jià)值。

目前，我國(guó)國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體的檢測(cè)方法均為單一PCR檢測(cè)技術(shù)，國(guó)內(nèi)少數(shù)學(xué)者進(jìn)行過(guò)轉(zhuǎn)基因棉花多重PCR方法研究，但僅局限于多個(gè)基因或3～4種轉(zhuǎn)化體的多重PCR檢測(cè)[1-2]。為了提高轉(zhuǎn)基因棉花多個(gè)轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)效率，本研究選擇6種進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化事件作為研究對(duì)象，旨在建立1種能快速準(zhǔn)確檢測(cè)6種轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體的多重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

轉(zhuǎn)基因棉花 MON1445、GBH614、MON15985、LLCOTTON25、MON531和 MON88913 來(lái)源于美國(guó)油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)（American Oil Chemists'Society，AOCS）；轉(zhuǎn)基因油菜 GT73來(lái)源于美國(guó)FLUKA公司；轉(zhuǎn)基因玉米Bt11和Bt176來(lái)源于歐盟委員會(huì)聯(lián)合研究中心（Joint Research Centre，JRC）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）；轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2來(lái)源于美國(guó)孟山都公司；轉(zhuǎn)基因油菜RF2、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1為本實(shí)驗(yàn)室保存。植物基因組提取試劑盒購(gòu)于成都博瑞克生物技術(shù)有限公司；Master Mix購(gòu)于日本東洋紡績(jī)株式會(huì)社；毛細(xì)管電泳預(yù)制凝膠卡夾、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（Size marker）購(gòu)于成都愛(ài)奇藝生物技術(shù)公司。

1.2 儀器設(shè)備

離心機(jī)（5424，德國(guó) Eppendorf公司），PCR 儀（Veritee96-well，美國(guó) ABI公司），DNA 超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 1000，美國(guó) Thermo 公司），毛細(xì)管電泳儀（QIAxcel Advanced，德國(guó)Qiagen公司）。

1.3 PCR引物序列

試驗(yàn)引物序列（表1）參照國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或相關(guān)文獻(xiàn)資料選取，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，并將所有引物濃度稀釋至10 μmol·L－1待用。

1.4 樣品總DNA提取與制備

試驗(yàn)樣品采用干磨杯粉碎處理，稱取粉碎試驗(yàn)樣品100 mg用于樣品總DNA的提取，提取步驟參照北京天根生化植物基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。樣品總DNA提取后采用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)量濃度和純度。然后用1×TAE緩沖液將各樣品總DNA稀釋至25 mg·L－1待用。

1.5 引物特異性驗(yàn)證

采用標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)中推薦的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)引物特異性進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析，驗(yàn)證各引物對(duì)特異性。

1.6 多重PCR退火溫度及引物濃度兩要素全組合優(yōu)化

多重PCR退火溫度和引物濃度（表2）按照兩要素全組合設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)體系為25μL，其中 Master Mix（2×）12.5μL，引物終濃度配比按照表2設(shè)置8個(gè)濃度梯度，模板2μL，ddH2O補(bǔ)足25μL。反應(yīng)條件：第一階段94℃預(yù)變性3 min；第二階段94℃變性40 s，退火溫度梯度為50、54、56、58、60、64 ℃，退火 30 s、72 ℃延伸 30 s，35個(gè)循環(huán)；第三階段72℃延伸3 min，最后4℃保存。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，確定引物終濃度和引物退火溫度。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物Table 1 The sequence of primers and the length of amplified productions

1.7 多重PCR靈敏度分析

棉花轉(zhuǎn)化體DNA以TE緩沖液進(jìn)行梯度稀釋，使得每個(gè)反應(yīng)體系中棉花基因組分別為264、132、66、33、16、8、4、2、1 個(gè)拷貝 （1 ng DNA 約合440拷貝棉花基因組），檢測(cè)體系設(shè)置清水為空白對(duì)照進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.8 多重PCR盲樣分析

利用本研究?jī)?yōu)化建立的多重PCR檢測(cè)體系對(duì)盲樣進(jìn)行分析，驗(yàn)證該方法是否可靠，檢測(cè)體系設(shè)置空白對(duì)照（水）進(jìn)行質(zhì)量控制。

表2 多重PCR引物終濃度方案Table 2 The design of primer concentrations in the multiplex PCR μmol·L－1

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA提取制備結(jié)果

對(duì)提取純化后的樣品總DNA進(jìn)行測(cè)定，所有樣品OD260nm/OD230nm均大于2.0，OD260nm/OD280nm均在 1.8～2.0，質(zhì)量濃度均大于 25 mg·L－1。 以上結(jié)果表明，樣品總DNA質(zhì)量較好，滿足下一步試驗(yàn)研究需要。

2.2 多重PCR引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

由轉(zhuǎn)化體擴(kuò)增圖譜（圖1）可見(jiàn)，在含有相關(guān)轉(zhuǎn)化體的樣品中6對(duì)引物均能在相應(yīng)目標(biāo)位置處觀察到特異性條帶，并且未見(jiàn)非特異性條帶擴(kuò)增，在不含相關(guān)基因的樣品中未見(jiàn)特異性條帶和非特異性條帶擴(kuò)增；空白對(duì)照（水）未見(jiàn)條帶擴(kuò)增，說(shuō)明檢測(cè)體系正常。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)選擇的引物對(duì)可用于多重PCR檢測(cè)體系研究。

圖1 轉(zhuǎn)化體擴(kuò)增圖譜Fig.1 PCR amplification of the events

2.3 多重PCR兩要素全組合優(yōu)化結(jié)果

圖2 引物濃度配比和退火溫度全組合優(yōu)化擴(kuò)增圖譜Fig.2 The optimized amplification map of primer concentrations and annealing temperature

兩要素全組合優(yōu)化結(jié)果表明：退火溫度太低、引物濃度太高都容易產(chǎn)生非特異性條帶，而退火溫度太高、引物濃度太低又不能獲得理想的目的條帶，只有在相對(duì)適宜的退火溫度和引物濃度情況下才能得到理想的結(jié)果。由圖2可見(jiàn)，在較低退火溫度50℃條件下，所有引物濃度梯度都會(huì)在200 bp上下各出現(xiàn)1條非特異性條帶擴(kuò)增，而且有的引物濃度下還會(huì)出現(xiàn)引物二聚體，很顯然50℃條件下所有引物濃度均不適宜；而在較高退火溫度區(qū)58℃、60℃、64℃的條件下，每個(gè)引物濃度均會(huì)有至少1條目的條帶未得到理想擴(kuò)增，退火溫度越高，得到的目的條帶越少，所以58℃、60℃、64℃的退火溫度條件均不適宜。在退火溫度54℃和56℃條件下，引物濃度梯度為A、B、E、G、H方案時(shí)均有 1條目的條帶的擴(kuò)增不理想，而引物濃度梯度為C、D、F方案時(shí)，各目的條帶均被有效擴(kuò)增。考慮到各目的條帶擴(kuò)增效率的一致性，最終選擇D方案作為多重PCR引物濃度配比，選擇56℃作為多重PCR退火溫度。

2.4 多重PCR靈敏度分析結(jié)果

多重PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，在棉花基因組不低于66個(gè)拷貝時(shí)，6個(gè)目標(biāo)片段均可被有效擴(kuò)增（圖3）。而當(dāng)棉花基因組為33個(gè)拷貝時(shí)，雖然幾個(gè)基因都能被擴(kuò)增，但MON1445和GHB614的目的條帶擴(kuò)增量太小，條帶模糊，不能準(zhǔn)確判斷目的條帶。表明所建立的多重PCR檢測(cè)體系靈敏度可達(dá)66個(gè)拷貝棉花基因組。

圖3 靈敏度擴(kuò)增圖譜Fig.3 PCR amplification of the sensitivity samples

2.5 多重PCR盲樣分析結(jié)果

采用此多重PCR體系檢測(cè)盲樣的結(jié)果表明，所有盲樣擴(kuò)增條帶與其含有的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體完全一致（圖4）。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了建立的多重PCR檢測(cè)方法可靠性較好。

3 討論

Chamberlain等[20]于1988年首次提出的多重PCR方法，已被廣泛應(yīng)用于基因多態(tài)性分析、定性定量分析、微生物耐藥檢測(cè)及動(dòng)物源性檢測(cè)等領(lǐng)域。它是科研、檢測(cè)工作的重要手段，具有很高的實(shí)用價(jià)值，可大大節(jié)約試劑、減少操作時(shí)間以及降低檢測(cè)成本[21]。李會(huì)等[22]對(duì)多重PCR法快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米多種轉(zhuǎn)化體技術(shù)優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了比較，研究結(jié)果表明與單一PCR檢測(cè)技術(shù)相比，成本降低了75%，檢測(cè)耗時(shí)縮短了63%，檢測(cè)產(chǎn)生的廢液減少了75%。

本研究選擇我國(guó)進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因棉花 MON1445、GBH614、MON15985、LLCOTTON25、MON531和MON88913等6種轉(zhuǎn)化體作為檢測(cè)對(duì)象建立的多重PCR檢測(cè)技術(shù)體系，通量較高，有效提高了轉(zhuǎn)基因棉花的檢測(cè)效率，為轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)行業(yè)提供了1種檢測(cè)方法。

圖4 多重PCR盲樣擴(kuò)增圖譜Fig.4 Multiplex PCR amplification of the blind samples

多重PCR的優(yōu)化過(guò)程中主要需要考慮的因素是引物的選擇。一方面，如果選擇的引物間易產(chǎn)生二聚體，會(huì)影響對(duì)特異性擴(kuò)增片段的判斷。本試驗(yàn)為避免引物產(chǎn)生二聚體，采用Primer 5.0的Multiplex primer功能，對(duì)選用引物進(jìn)行二聚體檢驗(yàn)；另外，本反應(yīng)體系選用含有高質(zhì)量重組Taq DNA聚合酶的Master Mix，能提高擴(kuò)增效率，有效減少引物二聚體和非特異性條帶產(chǎn)生。另一方面，如果選擇的引物特異性擴(kuò)增片段大小太接近，也會(huì)影響試驗(yàn)對(duì)特異性擴(kuò)增片段的判斷。本試驗(yàn)不同引物特異性擴(kuò)增片段大小差異最小為21 bp，若采用分辨率相對(duì)較低的普通瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果會(huì)存在一定困難。因此，本試驗(yàn)選擇分辨率為3～5 bp的毛細(xì)管凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物以滿足試驗(yàn)要求。

多重PCR的優(yōu)化過(guò)程中另一個(gè)需要考慮的因素是反應(yīng)體系中引物的濃度配比和反應(yīng)程序中的引物退火溫度。多重PCR的優(yōu)化通常根據(jù)擴(kuò)增條帶質(zhì)量調(diào)整不同引物的濃度，降低過(guò)亮條帶的引物濃度，增加條帶過(guò)暗的引物濃度，直至最佳擴(kuò)增結(jié)果[23]。該優(yōu)化方法已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因橡膠樹(shù)[24]、轉(zhuǎn)基因柑橘[25]以及多種致病菌[26]的多重PCR檢測(cè)，還可用于其他轉(zhuǎn)基因植物、致病菌等多重PCR檢測(cè)，具有一定的通用性。本試驗(yàn)條件的優(yōu)化采用引物濃度配比和退火溫度全組合方法，共設(shè)計(jì)8種引物濃度配比和6個(gè)引物退火溫度梯度48組反應(yīng)體系進(jìn)行全組合優(yōu)化。在兩要素全組合優(yōu)化時(shí)非常謹(jǐn)慎，在考慮優(yōu)化條件設(shè)置的基礎(chǔ)上，獲得了擴(kuò)增條帶特異、引物二聚體少、各基因引物擴(kuò)增效率相對(duì)一致的多重PCR檢測(cè)體系；通過(guò)多重PCR優(yōu)化結(jié)果最終確定了6種轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體多重PCR檢測(cè)體系的退火溫度和引物濃度。由于特異性引物設(shè)計(jì)對(duì)象為6種轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體，所以本研究結(jié)果僅適用于選用的6種轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體，并不適用于其他轉(zhuǎn)基因棉花或者轉(zhuǎn)基因植物。

4 結(jié)論

試驗(yàn)建立了轉(zhuǎn)基因棉花6種轉(zhuǎn)化體特異檢測(cè)方法——多重PCR檢測(cè)方法，其中檢測(cè)體系：東洋紡2×Master Mix 12.5μL，引物 MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLCOTTON25、MON531 終 濃 度 為 0.25、0.30、0.25、0.16、0.30、0.20 μmol·L－1，樣品 DNA 模板 4 μL，補(bǔ)充 ddH2O至25μL；擴(kuò)增程序：第一階段94℃預(yù)變性3 min；第二階段 94℃變性 40 s、56 ℃退火 30 s、72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；第三階段72℃延伸3 min，最后4℃保存。該方法可實(shí)現(xiàn)在1個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花6種轉(zhuǎn)化體多個(gè)轉(zhuǎn)基因成分，檢測(cè)效率高。此體系可用于所選的6種棉花轉(zhuǎn)化體的快速檢測(cè)。

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Development of a Multiplex Polymerase Chain Reaction Method for Simultaneous Detection of Six Events in Genetically Modified Cotton

Li Yi1#,Yin Quan2#,Liu Yong3*
(1.Department of Environmental and Life Sciences,Sichuan Minzu College,Kangding,Sichuan 626001,China;2.Analysisand Testing Center,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;3.Instituteof Plant Protection,Sichuan A-cademy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China)

S562.035

A

1002-7807（2017）05-0487-08

10.11963/1002-7807.lyly.20170727

2016-12-29

李憶（1982―），女，碩士，xiangfeng_1981@163.com；#同等貢獻(xiàn)。*通信作者：liuyongdr@163.com

四川省財(cái)政現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與示范專項(xiàng)資金（2014CXSF-040）；四川民族學(xué)院自辦一般項(xiàng)目（XYB16002）